Prácticas de Bioquímica Práctica: Estudio de los aminoácidos y proteínas

ESTUDIO DE LOS AMINOACIDOS Y PROTEÍNAS

Objetivos

Al finalizar la práctica el alumno estará en capacidad de:

- Aplicar pruebas químicas para la determinación cualitativa de aminoácidos.

- Analizar el efecto de las sales neutras, el pH y la temperatura, sobre la solubilidad de las

proteínas

Introducción

Las proteínas son polímeros de aminoácidos y representan un grupo numeroso de

biomoléculas que juegan un papel central en la bioquímica celular. Los aminoácidos son las
unidades estructurales más simples (monómeros) que componen la estructura de las proteínas;
están constituidos por un grupo amino (NH2 o NH3+), un grupo carboxilo (COOH o COO-), un
átomo de hidrógeno y una cadena radical conocida también como grupo R, unidos al carbono α
(central) de la molécula. La presencia de estos grupos químicos en la estructura de los
aminoácidos confiere características estructurales y propiedades físico-químicas particulares a
estas moléculas. Esto determina que los aminoácidos y proteínas puedan ser sometidos a una
variedad de métodos, procedimientos y reacciones químicas, que permiten su
aislamiento/separación, caracterización e identificación.

Existe una variedad de reacciones generales y específicas para caracterizar aminoácidos,

péptidos y proteínas (ej. Reacción de Ninhidrina, Biuret, Sullivan, Sakagushi, Millon,
Xantoproteica) así como un centenar de métodos para el estudio de las propiedades de las
proteínas basados en el peso, forma, tamaño, solubilidad, y carga (ej. centrifugación,
cromatografía, electroforesis, precipitación con sales, metales o cambios en el pH).

En el presente trabajo práctico se realizarán algunas reacciones y métodos para el estudio

de aminoácidos y proteínas que se describen más adelante.

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MATERIALES Y REACTIVOS

- Beakers ó Erlenmeyer
- Tubos de centrífuga.
- Pizetas.
- Varilla de vidrio.
- Pipetas graduadas 2 mL, 1 mL, 10 mL.
- Cilindro graduado.
- Goteros.
- Centrífuga.
- Leche descremada.
- Sulfato de amonio saturado (al menos 30%)
-Plasma Bovino
- Ácido acético glacial.
- NaOH 0,1N.
- Etanol 95%.
- -naftol al 0,5 % -
- Baños de María
- Pinzas para tubo de ensayo
- Soluciones al 0,2% de los aminoácidos disponibles en el laboratorio
- Reactivo de ninhidrina: preparada al 0,1 % en etanol
- NaOCl al 14 %
- NaOH al 30 %
- HNO3 Concentrado

Reacción de Ninhidrina

Es una de las reacciones de uso frecuente en el estudio químico de los aminoácidos,

péptidos y proteínas Se fundamenta en la reacción de los grupos amino y/o carboxilos libres de
los aminoácidos, péptidos y proteínas, con la Ninhidrina, formándose un compuesto final de color
violeta.

En esta reacción se requieren dos equivalentes de Ninhidrina por cada equivalente de

aminoácido y lleva implícita varias etapas:

1. Condensación de la Ninhidrina con el aminoácido:

O O
O O
H3N+ CHC O- R
OH H2O R
O NCHC OH
OH aminoácido
O
O O O

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Ninhidrina Complejo Ninhidrina-aminoácido

2. Formación de la base de Schiff:

O O-
R
NCHC OH N CHR + CO2
O O
O

3. Formación del dicetohidrindeno:

O- O-
H2O
N CHR NH2 + CHO R
O O

4. Condensación del amino-dicetohidrindeno con otra molécula de ninhidrina:

O- O O- O

NH2 + O N

O O O
O

El último compuesto en esta cadena de reacciones es de color violeta, e indica la presencia

de grupos carboxilo y/o amino libres en la muestra analizada.

Experimento 1. Prueba de la Ninhidrina.

- Rotule dos tubos de ensayo (1, 2)

- Agregue 2 mL de aminoácido (tubo 1) y 2 mL de plasma bovino (tubo 2).
- Agregue a cada tubo 10 gotas de reactivo de ninhidrina y agite suavemente.
- Coloque los tubos en baño de agua hirviente durante al menos 10 minutos.

En caso positivo la solución se tornará violeta, lo que indica la presencia de aminoácidos

y/o proteínas con grupos amino o carboxilo libres.

Reacción de Sakaguchi

Esta reacción es específica para la identificación del grupo guanidino. Se fundamenta en

la condensación del grupo guanidino con el -naftol en un medio altamente oxidante, con la

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posterior producción de un compuesto de color rojo intenso. Esta prueba da positiva frente a la
arginina así como a las proteínas que contienen este aminoácido.

Experimento 2. Prueba de Sakagushi

- Rotule dos tubos de ensayo (1 y 2)
- Agregue 2 mL de arginina (tubo 1) y 2 mL de plasma bovino (tubo 2).
- Añada 3 gotas de NaOH al 30% a cada uno y agite suavemente.
- Agregar 3 gotas de -naftol al 0,5 % en etanol a todos los tubos y mezcle bien.
- Posteriormente agregue a los tubos 1 mL de hipoclorito de sodio (NaOCl) al 14%.
La positividad de la reacción se observará de inmediato en los tubos que contengan arginina,
bien sea libre o como parte de la estructura de una proteína.

Reacción Xantoproteica:

Esta reacción permite detectar aminoácidos que tienen anillo bencénico en su estructura,
tales como la fenilalanina o la tirosina. En esta reacción el aminoácido reacciona con ácido nítrico
concentrado, ocurre la nitración del anillo aromático formándose nitroderivados de color
amarillo.
O O
+
H32N CH C O- +
H32N CH C O-
CH2 CH2
+ HNO3

NO2
OH OH
Tirosina Tisosina nitrada
(amarillo)

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Experimento 3. Prueba Xantoproteica

- Rotule dos tubos de ensayo (1 y 2)

- Agregue 2 mL de tirosina (tubo 1) y 2 mL de plasma bovino (tubo 2).
- Agregue 2 mL de HNO3 concentrado a cada tubo y caliente los tubos en un baño de agua
hirviendo de 1 a 3 minutos.
La aparición de un color amarillo indica una reacción positiva para aminoácidos
aromáticos.

La carga eléctrica de las proteínas determina su afinidad por el solvente, favorece su

solubilidad y evita la formación de agregados proteínicos. La solubilidad de las proteínas es
alterada por diversos factores entre ellos, la fuerza iónica del medio, temperatura y pH.

Efecto de las sales neutras sobre la solubilidad de las proteínas

Al agregar sales en el medio donde se encuentran disueltas las proteínas, aumenta la

presencia de cargas eléctricas, conllevando esto a la precipitación de algunas de ellas. Al agregar
pequeñas cantidades de sales como el cloruro de sodio (NaCl) o el sulfato de amonio ((NH4)2SO4)
en principio se produce un pequeño incremento en la solubilidad de las proteínas que se conoce
como SALTING IN (término inglés) y se debe al efecto pantalla que produce el agua debido a su
alta constante dieléctrica al aumentar la concentración de sales, éstas comienzan a competir con
las proteínas por el agua de hidratación reduciendo así la relación proteína-agua. De esta manera,
las proteínas pierden el agua que las mantenía en solución y precipitan, este efecto que se conoce
como SALTING OUT.

Experimento 4. Precipitación de proteínas con sales neutras

- Agregue 3 mL de plasma en un vaso de precipitado y adicione 4 mL de sulfato de amonio

saturado (NH4) 2SO4. Agite con varilla de vidrio y observe la aparición de un precipitado
blanquecino.

- Trasvase completamente su contenido a un tubo de centrífuga. En otro tubo de

centrífuga, agregue 7 mL de agua y úselo como contrapeso.

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- Centrifugue a 3.500 rpm por 10 minutos y observe. Las proteínas precipitadas se

separarán (fuerza centrífuga) y quedarán en el fondo del tubo, mientras que aquellas
proteínas que aún permanecen solubles, quedan en el sobrenadante.

Efecto del pH sobre la solubilidad de las proteínas

Cuando el número de cargas positivas y negativas presentes en las proteínas se igualan, la

carga neta de la molécula es cero, a esto se conoce como punto isoeléctrico. Cada proteína
posee un valor de pH en el cual alcanza su punto isoeléctrico que se conoce como pH
isoeléctrico. Cuando se alcanza ese valor de pH en el medio, las proteínas de un mismo tipo y
por lo tanto, de igual carga neta que se mantenían en suspensión, comienzan a agregarse y
precipitan, perdiendo su solubilidad. El pH de la leche se encuentra entre 6,5 y 6,7, al ajustar este
valor con ácido acético (CH3COOH) u otro ácido débil hasta el pH isoeléctrico de las caseínas
(4,7), estas proteínas (que constituyen el 80% de las proteínas de la leche) precipitan y se pueden
separar del resto de las proteínas lácteas por centrifugación u otro método.

Experimento 5: Efecto del pH sobre las caseínas de la leche

- En un beaker de 100 mL coloque 10 mL de leche descremada y agregue 40 mL de agua

destilada.
- Añada dos gotas de ácido acético glacial y mezcle con una varilla de vidrio. Observar la
precipitación floculada de las caseínas.
- Centrifugue 10 mL del material obtenido a 3.500 rpm durante 10 minutos.
- Descarte el sobrenadante y reserve el precipitado.
- En el mismo tubo de centrífuga y utilizando la varilla de vidrio, redisuelva el precipitado
en 10 mL de NaOH 0.1 N.
- Observe y discuta los resultados.

Efecto de la temperatura sobre la estructura de las proteínas

Las temperaturas elevadas ocasionan la pérdida de la conformación plegada de las

proteínas, efecto conocido como “desnaturalización”. Bajo estas condiciones, algunas proteínas
experimentan un proceso llamado coagulación por calor. La coagulación se produce cuando, por
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efecto de temperaturas elevadas, los grupos sulfhidrilo de los residuos de cisteína se unen para
formar puentes disulfuro (enlaces covalentes) entre las moléculas de proteína formando cistina.
Este entramado molecular produce un coagulo insoluble de proteínas desnaturalizadas. Proteínas
como la albúmina (de huevo o sérica), son ricas en cisteína y coagulan con rapidez, mientras que
las caseínas (proteínas de la leche) que no contienen cisteína en su estructura química, no forman
coágulos al aumentar la temperatura.

Experimento 6. Efecto de la temperatura sobre las proteínas.

- En un tubo de ensayo agregue 2 mL de una suspensión de ovoalbúmina al 2%.

- Coloque el tubo en baño de agua a 100°C durante 1-2 minutos.
- Saque el tubo del baño, deje enfriar sin agitar y observe.
- Observe y discuta el resultado obtenido.

Autoevaluación

1. Explique el efecto del Sulfato de amonio (NH4)2SO4 saturado cuando es agregado a una

solución de proteínas.

2. Mencione cuatro métodos utilizados para la separación de proteínas y diga en que están
basados.

4. Mencione cuatro factores que afectan la solubilidad de las proteínas.

5. Explique en que se basa la precipitación de las caseínas de la leche.

Bibliografía

Alemany, M; Font, S. Práctica de Bioquímica. Edit Alhambra. España 1.983.

Pavia, Donald; Lampman, Gary; Kriz George. Introduction to organic laboratory techniques.
Saunders editores. 1976.
Plummer, David. Bioquímica práctica. Mc Graw Hill. 1981.
Robyt, John; White Bernard. Bioquemical Techniques. Waveland Press. 1987