CONCEPTOS BÁSICOS
1.3 MUESTREO
El objetivo del muestreo es coleccionar una pequeña porción del material,
suficiente en volumen, para ser transportado de manera conveniente para su
manejo en el laboratorio, el cual aún debe representar con exactitud el material
muestreado. Este objetivo implica que la proporción o concentración relativa de
todos los componentes serán las mismas en las muestras, y que el material
muestreado, debe ser manipulado de manera tal que no sufran cambios
significativos en su composición antes de las pruebas.
Ningún análisis de laboratorio tiene sentido si la muestra tomada no es
representativa del agua que se está examinando. Es muy raro que los
resultados de una sola muestra sean suficientes para determinar el grado de
contaminación del agua; por lo general, es necesario tomar duplicado o
triplicado.
MATERIAL NECESARIO:
- Utilizar frascos de vidrio neutro o plástico esterilizable de boca ancha, con tapa
rosca y cierre hermético.
- Las botellas de boca ancha y tapa de bakelita deben secarse a 50°C a 60°C y su
esterilización sólo es en autoclave.
-Las botellas de polipropileno o policarbonato son autoclavables. Las de
polietileno no.
-Capacidad: mínimo 500mL. (100mL. de muestra) para facilitar la homogenización
antes del análisis.
Al tomar la muestra se debe dejar un amplio espacio libre (al menos 2.5 cm)
para facilitar la agitación antes del análisis.
TABLA # 1-1
PRESERVACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS
PARÁMETROS VOLUME RECIPIENTE PRESERVANTES TIEMPO
MICROBIOLÓGIC N MÍNIMO ALMACENAMIENTO
OS
Refrigerar y
100-500
Coliformes Totales PoV Tiosulfato De Máximo 6 h.
Mª
Sodio*
REFRIGERAR
100-500 TIOSULFAT
Coliformes Fecales PoV Máximo 6 h.
Mª O DE
SODIO*
Recuento Total Refrigerar
100-500
(Bacterias PoV Tiosulfato De Máximo 6 h.
Mª
Heterotróficos) Sodio*
NOTA: Todos los envases para la muestra microbiológica deben ser estériles.
*Se añade Tiosulfato de Sodio sólo si el agua contiene cloro residual.
1.4 NORMAS EN ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO
La Enumeracón de Escherichia coli en aguas esta acorde a ISO 9308.
ISO 9308 Parte 1: Water quality -- Detection and enumeration of Escherichia coli and
coliform bacteria -- Part 1: Membrane filtration method
ISO 9308-2:1990 Water quality -- Detection and enumeration of coliform organisms,
thermotolerant coliform organisms and presumptive Escherichia coli -- Part 2: Multiple
tube (most probable number) method
ISO 9308-3:1998 Water quality -- Detection and enumeration of Escherichia coli and
coliform bacteria in surface and waste water -- Part 3: Miniaturized method (Most
Probable Number) by inoculation in liquid medium
ISO 9308-3:1998/Cor 1:2000
LE MINOR, L. a. HAMIDA, F. BEN: Advantages de la recherche de la ß-galactosidase
sur celle de la fermentation du lactose en milieu complexe dans le diagnostic
bactériologique, en particulier des Enterobacteriaceae. - Ann. Inst. Pasteur (Paris), 102;
267-277 (1962).
MANAFI, M. a. KNEIFEL, W.: A combined chromogenic-fluorogenic medium for the
simultaneous detection of total coliforms and E. coli in water. - Zentralabl. Hyg. 189;
225-234 (1989).
OSSMER, R., SCHMIDT, W. a. MENDE, U.: Chromocult® Coliform Agar - Influence of
Membrane Filter Quality on Performance. - XVII Congresso de la Sociedad, Granada
(1999). New Zealand Dairy Industry: Microbiological Methods Manual, Section 48:
Product Test Methods - Enteric Indicator Organisms. - NZTM 2; 48.5.1-48.5.10 (1998).
Para leches y productos lácteos, helados de crema, alimentos para bebes y niños a
base de leches se basan en DIN 10 183 parte 3
" El método de La Fluorescencia-optica para la determinación de E. coli es la
determinación paralela de bacterias coliformes”
Fluorocult® Lauryl Sulphate broth (Cat. No. 1.12588)
CAPÍTULO II
A. Prueba presuntiva:
Existen 03 medios para esta prueba:
- Caldo Lauril Sulfato.
- Caldo Lauril Triptosa.
- Caldo Lactosado.
Medios de Cultivo para Coliformes totales por el Método Número mas Probable
(NMP).
B. Prueba confirmatoria:
Caldo EC
Fundamento: Los gérmenes lactosa positivos consumen la lactosa presente en
el medio con producción de gas. Contiene sales biliares que inhiben a los
gérmenes Gram positivos y de otros gérmenes no adaptados al medio ambiente
intestinal.
Preparación: 37 g/Litro pH final: 6,9 +,- 0,1
Esterilizar en autoclave 121 °C/15’
Repartir en tubos 150 x 16 mm provistos de campanas Durham de 75 x 10 mm.
Agar M-ENDO;
Preparación
41,5 g/L pH: 7,0 +,- 0,2
Esterilizar en autoclave 121°C/15’
Repartir en placas Petri estériles de 60 x 12 mm, 6 mL por placa.
Agar M- FC
Fundamento
Fórmula selectiva con peptonas y extracto de levadura para la demostración y
aislamiento de Escherichia coli fecal. Posee sales biliares que inhiben la flora
indeseable.
Se suplementa con ácido rosólico. Da colonias azules tipicas
Preparación: 52 g/ Litro pH: 7,0 +,- 0,2
Adicionar 10 ml de ácido rosólico al 1% en NaOH 0,2N
No Autoclavar
Repartir en placas Petri estériles de 60 x 12 mm, 6 mL por placa.
El procedimiento de filtración por membrana consiste en hacer pasar con ayuda del
vacío, un volumen de muestra de agua a través de una membrana de celulosa, la cual
es colocada luego en una placa petri conteniendo un medio de cultivo agar e incubada
a una temperatura de 35 °C. +,- 0,5 °C. por un periodo de 24 a 48 horas, esta técnica
permite examinar volúmenes muy variables de agua y ofrece un resultado directo de la
concentración de bacterias heterotróficas (por recuento de colonias).
EQUIPOS Y MATERIALES
Horno de aire caliente o estufa: provisto de termómetro calibrado y termostato para
mantener la temperatura de esterilización entre 170 a 180 °C. durante por lo menos
dos horas. Debe tener capacidad suficiente para circulación del aire caliente en su
interior.
Autoclave: De tamaño suficiente para permitir la circulación de vapor, debe tener fuente
interna de calor, termómetro con sensor en la salida, manómetro y válvula de seguridad
operativa.
La autoclave debe mantener la temperatura de esterilización durante todo el ciclo y
completar un ciclo en 45 minutos, cuando se usa un periodo de esterilización de 12 a
15 minutos a 1,05 kg/cm2 (15 psi) y 121 °C.
Para que la esterilización sea suficiente todo el aire debe ser eliminado del interior de
la autoclave antes de iniciar el periodo de esterilización. Concluido el autoclavado, la
presión debe bajar lentamente para asegurar que el medio no hierva.
Incubadora de aire caliente: Con dispositivo interno de control y monitoreo de
temperatura a 35,0 °C. +,- 0,5 °C.. Para incubadoras no portátiles, los termómetros
deben colocarse en la parte superior de los anaqueles del área en uso con el bulbo del
termómetro sumergido en líquido.
Refrigeradora: Capaz de mantener una temperatura entre 1 y 5 °C. Los termómetros
deben estar graduados en intervalos de 1 °C. y el bulbo del termómetro debe estar
sumergido en líquido.
Equipo de filtración: Que consta de un embudo de filtración, un soporte para las
membranas y un matraz kitasato o similar, fabricados de plástico resistente al
autoclavado, acero inoxidable o vidrio borosilicatado; no deben estar rallados o
corroídos y no tener fugas.
Equipo generador de vacío: que asegure una presión diferencial sobre el filtro de
membrana de tal manera que la filtración se lleve a cabo eficientemente y que a la vez
la membrana no se rompa.
Balanzas: con sensibilidad de 0,1 g.
Destilador de agua: Para producir agua de grado reactivo que pueda impedir el
desarrollo de bacterias. Se recomienda efectuar un tratamiento previo si es que el agua
que alimenta al destilador es de baja calidad (que contenga alta dureza, compuestos
orgánicos o turbiedad).
Peachímetro: digital capaz de dar lecturas directas con una exactitud de +,- 0,1
unidades de pH.
Contador de colonias o microscopio estereoscópico: Con lupa de 10 a 20
aumentos y una fuente de luz fluorescente fría. Utilizar papel de lentes para limpiar la
óptica y la platina después de cada uso.
Lámpara de esterilización UV: La cual se debe limpiar mensualmente y probar
trimestralmente con una placa de agar inoculado. Reemplazar si emite menos del 70 %
de su detección inicial o si una placa de agar inoculado que contiene 200 a 250
microorganismos expuestos a la luz durante dos minutos, no muestra una reducción de
recuentos de 99 %.
Agitador magnético:
Mechero de bunsen:
Frascos para el muestreo: Deben ser botellas de vidrio borosilicatado o de plástico de
boca ancha con tapas de vidrio o tapas con forros no tóxicos para resistir la
esterilización repetida. La capacidad de los envases de la muestra debe ser de al
menos 500 mL. Los tapones del frasco deben estar cubiertos con papel de aluminio,
papel filtro kraft o papel resistente a la esterilización.
Frascos con agua de dilución: Con capacidad total de 200 a 1 000 mL. Deben ser
autoclavables con tapas de rosca cuyo revestimiento no produzca compuestos tóxicos
o bacteriostáticos al ser esterilizados.
Pipetas serológicas: De 10 mL de capacidad y precisión de +,- 2,5 %. Deben tener la
graduación claramente marcada y la punta intacta.
Placas petri estériles: De 50 x 12 mm o placas de 60 x 15 mm de vidrio autoclavable.
Membranas pre esterilizadas: De éster de celulosa, preferentemente de color gris
oscuro, con cuadrículas de 47 mm de diámetro y tamaño de poro de 0,45 μm.
Almohadillas absorbentes: de 48 mm de diámetro y de espesor suficiente para
absorber entre 1,8 a 2,2 mL de medio de cultivo.
Pinzas de acero inoxidable sin dientes con borde plano: esterilizadas en alcohol etílico
al 95 % y a la llama.
Material para preparación de medios de cultivo: (probetas, matraces, espátulas, vasos
de precipitación, magnetos).
Estuches para pipetas: de acero inoxidable o aluminio, cilíndricas o rectangulares, de
5 a 7,5 cm de ancho y una longitud aproximada de 40 cm. Si no se dispone de ellas, se
sustituirán por envolturas del papel kraft.
Material diverso: como algodón, papel kraft, papel aluminio, pabilo, tijeras, plumón,
indeleble, mascarillas, guantes, etc.
Preparación de reactivos
Agar m-HPC:
Peptona 20,0 g
Gelatina 25,0 g
Glicerina 10,0 g
Agar 15,0 g
Agua grado reactivo 1 L.
Mezclar todo el componente, excepto la glicerina, ajustar el pH a 7,1 con solución de
Na0H 1N, si se requiere. Calentar hasta que se disuelva, adicionar la glicerina y
colocar en autoclave durante 5 min. A 121 °C.
Agar R2A:
Extracto de levadura 0,5 g
Proteosa peptona # 3 o polipeptona 0,5 g
Ácidos casamino 0,5 g
Glucosa 0,5 g
Almidón soluble 0,5 g
Fosfato ácido de potasio 0,3 g
Sulfato de magnesio 0,05 g
Piruvato de sodio 0,3 g
Agar 15,0 g
Agua grado reactivo 1,0 L
Ajustar el pH al final a 7,2 con fosfato ácido de potasio sólido antes de añadir el agar.
Calentar hasta disolver este último y autoclavar a 121 °C. durante 15 min.
Procedimiento
Precauciones de operación
No mantener el agua de dilución con inoculo por más de 30 minutos a temperatura
ambiente porque puede ocasionar la muerte o multiplicación de las bacterias
Los tiempos requeridos para esterilizar en autoclave son los que se enumera a
continuación:
A excepción de los filtros de membrana, almohadillas y medios que contiene
carbohidratos, los tiempos indicados son mínimos que pueden requerir ajuste de
acuerdo a volúmenes, envases y cargas.
Filtros de membrana 10 min.
Medios que contienen carbohidratos 12-15 min.
Materiales contaminados 30 min.
Ensamblaje del equipo de filtración 15 min.
Frascos de recolección de muestras 15 min.
Material de vidrio individual 15 min.
Blanco de agua de dilución 15 min.
El lavado del material de vidrio debe hacerse con un detergente adecuado, se debe
enjuagar con agua caliente para eliminar todos los residuos del compuesto de lavado y
por último con agua reactivo para el enjuague final.
El material de vidrio se esteriliza en recipientes de metal o acero inoxidable a 170 °C.
por un mínimo de 3 horas. Los frascos de muestreo con tapas de plástico y otros
materiales no resistentes a la esterilización por calor seco, deben autoclavarse durante
15 min. A 121 °C. y 1,05 kg/cm2 (15 psi).
Considerar que se interrumpe una serie de filtraciones cuando transcurre un intervalo
de 30 min. Entre la filtración de dos volúmenes de la misma muestra. Si se produjera
una interrupción de este tipo, la filtración siguiente se debe tratar como si fuera una
nueva serie y se debe esterilizar los soportes de los filtros de membrana que se estén
utilizando.
El agua para consumo humano se analiza filtrando 100 mL o más, o muestras
duplicadas de volúmenes más pequeños. Si hay mayor contaminación, se filtrará
volúmenes distintos (diluidos o no), en función de la densidad bacteriana que se
espere. Cuando se filtren menos de 20 mL, se añadiré alrededor de 10 mL de agua de
dilución estéril al embudo antes y después de la filtración.
Preparar las placas petri vertiendo 5 mL de medio estéril, dejándolas solidificar a
temperatura ambiente. Las placas preparadas pueden guardarse en bolsas plásticas o
envases bien cerrados en refrigeración. Desechar las placas después de una semana.
Procedimiento de análisis
Esterilizar el equipo de filtración entre una muestra y otra, mediante radiación UV o
autoclave. En caso del empleo de luz UV, bastará con una exposición de dos
minutos.
Usar una pinza estéril y colocar el filtro de membrana estéril sobre la base del
sistema de filtración, si fuera necesario.
Colocar con cuidado el embudo o vaso de filtración sobre la base del sistema,
fijándolo con una pinza.
Humedecer la membrana con un pequeño volumen de agua destilada estéril.
Realizar un análisis de un blanco filtrando 100 mL de agua destilada estéril y
proceder como si fuera una muestra más.
Homogenizar vigorosamente la muestra por lo menos unas 25 veces.
Proceder a realizar diluciones en caso fuera necesario.
Para las diluciones transferir con una pipeta estéril 10 mL de la muestra original a
un frasco con 90 ml de agua de dilución. De esta manera se tiene la primera dilución
(10-1), siendo que 1 mL de la misma corresonde a 0,1 mL de la muestra original.
Homogenizar el frasco que contiene (10-1), y con una nueva pipeta estéril transferir
10 mL a un nuevo frasco de dilución, teniendo así la segunda deilución (10 -2), siendo
que 1 mL de la misma corresponde a 0,01 mL de la muestra original. Continuar con
este proceso dependiendo del grado de contaminación de la muestra.
Ordenar frascos conteniendo las diluciones, en secuencia decreciente de
concentración (de mayor a menor dilución).
En caso de trabajar con diluciones, empezar con la más diluida.
Colocar la muestra o diluciones de la misma en un vulumen ideal que proporcione
alrededor de 20 unidades formadoras de colonias UFC y no más de 200 UFC (por
ejemplo; 10, 25, 50, y 100 mL). No se recomienda filtrar volúmenes menores de 10
mL.
Proceder a filtrar un volumen apropiado de la muestra, a través del filtro de
membrana, a una presión de vacío moderada. Enjuagar el embudo de filtración con
20-30 mL de agua de dilución estéril.
Luego de la filtarción y la desconexión del vacío, retirar el embudo y el filtro de
membrana con una pinza estéril.
Si se usa medio de cultivo líquido, colocar la almohadilla absorbente previamente
esterilizada en la base de la placa y saturar con 1,8 a 2,2 mL del medio.
Colocar la membrana (con la ayuda de la pinza estéril) en la placa conteniendo el
medio de cultivo, con un movimiento de rotación para evitar la formación de burbujas
de aire debajo de la membrana. El tiempo entre la filtración y la incubación no debe
exceder los 30 minutos.
Invertir la placa e incubar a 35 °C. por 48 horas si se utiliza agar HPC o más si se
utiliza caldo agar R2A; en caso de utilizar agar NWRI, incubar durante 5 a 7 días a
una temperatura entre 20 a 28 °C.
Contar como colonias individuales aquellas que posean características típicas y
crezcan muy cerca unas de otras, sin tocarse, siempre que la distancia entre ellas
sea por lo menos igual al diámetro de la colonia más pequeña. También considerar
como colonias individuales las adyacentes con aspecto distinto en lo que se requiere
a forma, color, etc.
Conteo de colonias y expresion de resultados
Contar con la ayuda del microscopio, todas las colonias presentes mayormente son de
color claro, pero también pueden presentarse pigmentadas y tener diversa forma, para
lo cual la placa se debe colocar en platina del microscopio en un ángulo de 45 o con
una fuente de luz que incida verticalmente sobre las colonias. La densidad óptima de
colonias por filtro de membrana es de 20 a 200. Con colonias pequeñas y no próximas
entre sí, se acepta un número mayor. Este es un conteo estimado, el que solo se
puede realizar cuando las colonias resultantes sean discretas, separadas y no estén
diseminadas.
Contar todas las colonias que existan en la membrana en el caso de 1 a 2 por
cuadrado.
Para un intervalo de 3 a 10 colonias por cuadrado, contar 10 cuadrados y obtener el
promedio de colonias por cuadrado. Multiplicar el promedio por 100 y dividir por el
volumen de la muestra.
Para 10 a 20 colonias por cuadrado, contar cinco cuadrados y obtener el promedio de
colonias por cuadrado. Multiplicar el promedio por 100 y dividir por el volumen de la
muestra.
Si existen más de 20 colonias por cuadrado expresar el recuento como mayor de 2 000
dividido por el volumen de muestra.
Expresar el conteo promedio como Unidades Formadoras de Colonias por mL,
(UFC/mL).
Informe
En el informe se debe reportar los resultados como UFC/mL. Incluir el método usado,
temperatura y tiempo de incubación, medio de cultivo. Anotar fecha y hora de análisis,
fecha y hora de muestreo, código y punto de muestreo.
Gráfica Nº 1: Análisis Microbiológico Coliformes Totales - NMP
Gas + Gas -
Prueba Presuntiva + 24 horas
24horas
Reincubar
24 horas
Gas + Gas -
Prueba Presuntiva + 48 horas
Caldo Brilla 48 horas Prueba Negativa
35°C +,- 0,5°C
10 10 10 10
ml. ml. ml. ml.
90 +,-2ml.de agua
de dilución amortig.
1 1 1 1 Volumen
ml. ml. ml. ml. sembrado
Caldo Brila
Caldo Lauril 35°C +,- 0.5°C
Gas + Gas -
24horas Reincubar
24 horas
Gas + Gas -
Prueba Confirmatoria + Prueba Negativa
Coliformes Presentes
Gráfica Nº 5: Análisis Microbiológico Coliformes Fecales - NMP
Filtrar volumen
Muestra de agua
necesaria
Caldo m-FC
18-24 horas
35°C, 0.5 °C
1 ml 1 ml
9 ml Agua pepton
0.1%
10- 10-2 10-3
Muestra: 90 ml 1
Muestra original
10 ml a 1 ml a cada/t 1 ml a cada/t
cada/t 10-
1
10 1 10-1
10 ml Caldo Lauril Doble 10 ml Caldo Lauril Simple
Muestra original
10 ml a 1 ml a cada/t 1 ml a cada/t
-
cada/t 10
1
10 1 10-1
10 ml Caldo Lauril Doble 10 ml Caldo Lauril Simple
1 ml 1 ml
1 ml 1 ml
9 ml Agua peptona
0.1%
10- 10-2 10-3
1
90 ml
Muestra:
AP 0.1%
10g /10ml
1 ml a
cada tubo
10 ml Caldo Lauril
Simple
Caldo EC positivo
Purificación
Las unidades se expresan en miligramos por litro (mg/l) a menos que se indique otra
cosa.
Todos y cada uno de los sistemas de agua deben declarar al estado, por escrito, que si
se usa acrilamida y/o epiclorhidrina para tratar agua, la combinación (o producto) de
dosis y cantidad de monómero no supera los niveles especificados, a saber: acrilamida
= 0.05% dosificada a razón de 1 mg/l (o su equivalente); epiclorohidrina = 0.01%
dosificada a razón de 20 mg/L (o su equivalente).
La Regla de Tratamiento de Agua de Superficie requiere que los sistemas que usan
agua de superficie o subterránea bajo influencia directa de agua de superficie, (1)
desinfecten el agua y (2) filtren el agua o realicen el mismo nivel de tratamiento que
aquellos que filtran el agua. El tratamiento debe reducir los niveles de Giardia lamblia
(parásito) en un 99.9% y los virus en un 99.99%. La Legionella (bacteria) no tiene
límite, pero la EPA considera que, si se inactivan la Giardia y los virus, la Legionella
también estará controlada. En ningún momento la turbidez (enturbiamiento del agua)
puede superar las 5 unidades nefelométricas de turbidez ("NTU") [los sistemas
filtrantes deben asegurar que la turbidez no supera 1 NTU (0.5 NTU para filtración
convencional o directa) en al menos el 95% de las muestras diarias de cualquier mes];
HPC- no más de 500 colonias por mililitro.
Coliformes fecales y E. coli son bacterias cuya presencia indica que el agua podría
estar contaminada con heces fecales humanas o de animales. Los microbios que
provocan enfermedades (patógenos) y que están presentes en las heces, causan
diarrea, retortijones, náuseas, cefaleas u otros síntomas. Estos patógenos podrían
representar un riesgo de salud muy importante para bebés, niños pequeños y personas
con sistemas inmunológicos gravemente comprometidos.
BIBLIOGRAFÍA
LE MINOR, L. a. HAMIDA, F. BEN: Advantages de la recherche de la ß-galactosidase
sur celle de la fermentation du lactose en milieu complexe dans le diagnostic
bactériologique, en particulier des Enterobacteriaceae. - Ann. Inst. Pasteur (Paris), 102;
267-277 (1962).
MANAFI, M. a. KNEIFEL, W.: A combined chromogenic-fluorogenic medium for the
simultaneous detection of total coliforms and E. coli in water. - Zentralabl. Hyg. 189;
225-234 (1989).
OSSMER, R., SCHMIDT, W. a. MENDE, U.: Chromocult® Coliform Agar - Influence of
Membrane Filter Quality on Performance. - XVII Congresso de la Sociedad, Granada
(1999). New Zealand Dairy Industry: Microbiological Methods Manual, Section 48:
Product Test Methods - Enteric Indicator Organisms. - NZTM 2; 48.5.1-48.5.10 (1998).