Apa itu MTT assay?

MTT assay merupakan metode yang jamak digunakan dalam penelitian mengenai agen
antikanker. Metode ini digunakan untuk menguji aktivitas sitotoksik sampel penelitian pada
kultur sel yang digunakan.

Bagaimana prinsip MTT assay?

Prinsip metode ini adalah reaksi redoks yang terjadi di dalam sel. MTT (3-(4,5-
Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) direduksi menjadi garam formazan oleh
enzim suksinat dehidrogenase yang terdapat di dalam mitokondria sel hidup. Reaksi dibiarkan
terjadi selama 4 jam kemudian ditambahkan reagen stopper. Reagen stopper tersebut akan
melisis membran sel sehingga garam formazan dapat keluar dari sel, serta melarutkan garam
formazan tersebut. Garam formazan yang terbentuk dikuantifikasi dengan spektrofotometer dan
diukur dalam bentuk absorbansi. Semakin tinggi absorbansi, semakin banyak sel yang hidup
(viabilitas sel tinggi)

Bagaimana reaksi yang terjadi dalam sel?

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003450912001447

Seperti yang telah disebutkan sebelumnya, MTT akan direduksi oleh enzim dehidrogenase
(merupakan suatu enzim oksidoreduktase, karena terlibat dalam reaksi redoks) yang terdapat
dalam mitokondria sel hidup, menjadi garam formazan. Enzim suksinat dehidrogenase ini
merupakan enzim yang terlibat dalam respirasi sel, yaitu dalam siklus krebs. Enzim suksinat
dehidrogenase merupakan enzim yang mengubah suksinat menjadi fumarat.

Apa saja zat yang dapat digunakan sebagai reagen stopper?

Zat yang dapat digunakan sebagai reagen stopper adalah surfaktan. Hal ini dimaksudkan
agar zat tersebut dapat melisis membran sel serta melarutkan kristal formazan yang sebenarnya
tidak larut dalam media kultur. Terdapat beberapa jenis zat yang dapat digunakan, antara lain
SDS dalam HCl, isopropanol, dan DMSO.

Apa titik krusial dalam melakukan MTT assay?

1. Penanaman sel dalam 96 well plate

Untuk 1 konsentrasi sampel, digunakan triplo well (3 well) untuk mendapatkan validitas
penelitian. Oleh karena itu, penanaman sel dilakukan dengan memasukkan 4 triplo terlebih
dahulu berurutan, kemudian wadah berisi kultur sel disuspensikan kembali, dan ditanam lagi 4
triplo berikutnya. Hal ini dilakukan agar jumlah sel di setiap triplo seragam sehingga
menghindari deviasi data yang besar.

2. Pengamatan sel sebelum dilakukan treatment menggunakan sampel

Sebelum dilakukan treatment menggunakan sampel, lihat sel terlebih dahulu dan pastikan
kepadatan sel dalam tiap well sekitar 70-80% (konfluen). Jika terlalu rendah, dikhawatirkan
seluruh sel akan mati akibat perlakuan sampel bahkan dalam konsentrasi rendah sehingga
absorbansi yang didapatkan tidak valid. Sementara jika terlalu padat, jumlah sel dalam
well kontrol sel akan terlalu padat.

3. Selalu memastikan wadah berisi MTT kedap cahaya

MTT merupakan zat yang peka terhadap cahaya sehingga harus selalu terlindung dari cahaya
(dapat menggunakan alumunium foil untuk membungkus wadahnya), walaupun sudah
diencerkan menggunakan media kultur.

4. Garam formazan yang terbentuk harus benar-benar larut

sebelum dibaca menggunakan elisa reader, pastikan garam formazan yang terbentuk telah larut
sempuran (tidak ada kristal lagi di dalam well). Hal ini dikarenakan adanya kristal akan
mempengaruhi pembacaan larutan oleh spektrofotometer sehingga absorbansi yang didapatkan
tidak valid. Pelarutan garam formazan ini sangat ditentukan oleh ketepatan komposisi reagen
stopper serta dapat dibantu pelarutannya menggunakan shaker.

Metode uji sitotoksik

Uji sitotoksik 3-(4,5-dimetilazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida (MTT) merupakan
metode kolorimetri, dimana pereaksi MTT ini merupakan garam tetrazolium yang dapat dipecah
menjadi kristal formazan oleh sistem suksinat tetrazolium reduktase yang terdapat dalam jalur
respirasi sel pada mitokondria yang aktif pada sel yang masih hidup. Kristal formazon ini
memberi warna ungu yang dapat dibaca absorbansinya dengan menggunakan Enzyme-linked
Immunosorbent Assay (ELISA) reader (Pamilih, 2009). Penetapan jumlah sel yang bertahan
hidup pada uji sitotoksik dapat dilakukan berdasarkan dengan adanya kerusakan membran
meliputi perhitungan sel yang mengambil (up take) atau dengan bahan pewarna seperti biru
tripan. Sedangkan perubahan morfologi diketahui dengan mikroskop elektron.
Uji sitotoksik digunakan untuk menentukan parameter nilai IC50. Nilai IC50 menunjukkan
nilai konsentrasi yang menghasilkan hambatan proliferasi sel sebesar 50% dan menunjukkan
potensi ketoksikan suatu senyawa terhadap sel. Nilai ini merupakan patokan untuk melakukan uji
pengamatan kinetika sel. Nilai IC50 dapat menunjukkan potensi suatu senyawa sebagai
sitotoksik. Semakin besar harga IC50 maka senyawa tersebut semakin tidak toksik. Akhir dari uji
sitotoksik dapat memberikan informasi % sel yang mampu bertahan hidup, sedangkan pada
organ target memberikan informasi langsung tentang perubahan yang terjadi pada fungsi sel
secara spesifik.
Prinsip reaksi 3-(4,5-dimetilazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida (MTT) menurut
Mosmann (1983) sebagai berikut:

Uji Anti kanker

Uji sitotoksik terhadap kanker dengan metode MTT dilakukan dengan cara: Sel kanker
dengan konsentrasi 3 x 103 sel/100 μL didistribusikan kedalam sumuran dan diinkubasi selama
24 jam didalam inkubator CO2 agar sel beradaptasi dan menempel di sumuran. Selanjutnya pada
tiap sumuran ditambahkan 100 μL media kultur (MK) yang mengandung sampel dengan variasi
kadar dan diinkubasi kembali selama 48 jam. Pada akhir inkubasi, media kultur yang
mengandung sampel dibuang dan dicuci dengan 100 μL PBS (phosphate Buffered saline).
Kemudian kedalam asing-masing sumuran ditambahkan 100 μL media kultur yang mengandung
MTT dan diinkubasi kembali selama 4 jam pada suhu 370 C. Sel yang hidup akan bereaksi
dengan MTT membentuk formazan yang berwarna ungu. Setelah 4 jam, pada tiap sumuran
ditambahkan reagen stopper untuk membunuh sel dan melarutkan kristal formazan. Plate di
shaker selama 10 menit kemudian diinkubasi pada suhu kamar dalam ruang gelap selama
semalam. Selanjutnya, absorbansi tiap sumuran dibaca dengan ELISA reader pada panjang
gelombang 595 nm