ACIDOS NUCLEICOS

COMPONENTES Y ORGANIZACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

La unidad monomérica de una molécula de ácido nucleico es un residuo de nucleótido. El
nucleótido, a su vez, tiene tres componentes fácilmente reconocibles:
 Un azúcar
 Una base purínica o pirimidínica.
 Una fracción esterificada de ácido fosfórico.

El azúcar es ribosa o desoxirribosa y divide a los ácidos nucleicos en dos grupos

principales. El ácido ribonucleico (RNA) tiene como azúcar a la D-ribosa en la
configuración de furanosa, mientras que el ácido desoxxirribonucleico (DNA), como su
nombre lo indica tiene el azúcar D-desoxirribosa, también en la configuración de furanosa.
Los nombres sistemáticos de las bases purínicas y pirimidínicas derivan de los compuestos
precursores, purina y pirimidina. La adenina (6-aminopurina) y la guanina (2-amino-6-
oxopurina) son las dos bases purínicas comunes tanto del DNA como del RNA.
Las bases pirimidínicas comunes del RNA son la citosina (2-oxo-4-aminopirimidina) y el
uracilo (2,4-bis-oxopirimidina), mientras que el DNA tiene citosina y timina como
pirimidinas predominantes.
DNA
Adenina, guanina, citosina y timina
 ADENINA
Compuesto orgánico nitrogenado de fórmula C5H5N5, que forma parte de los ácidos
nucleicos. Es un derivado de la purina (es una ‘base púrica’) en la que un hidrógeno ha sido
sustituido por un grupo amino (NH2).

Propiedades químicas

 Nombre: Adenina
 Nombre IUPAC: 7H-Purin-6-amine
 Fórmula: C5H5N5
 Masa molecular: 135.1267 g/mol
 Masa monoisótopica : 135.0544952 g/mol
 Punto de fusión: > 300 °C (573 K)
 Sinónimo: 7H-Purin-6-amine (en)
 Abreviatura: A

 GUANINA

La guanina (G) es una de las cuatro bases químicas del ADN, siendo las otras tres la
adenina (A), la citosina (C), y la timina (T). Dentro de la molécula de ADN, las bases de
guanina localizadas en una hebra forman puentes químicos con la citosina de la hebra
opuesta. Las instrucciones genéticas de la célula están codificadas por la secuencia
compuesta por las cuatro bases.

La guanina es una de las unidades de construcción del ADN. Le corresponde la letra G

dentro de las letras A, C, G, o T. La guanina se aparea con la citosina en la doble hélice,
por lo que veran pares GC; una en una hebra y la otra en la otra hebra. Los pares CG crean
uniones más fuertes que los pares AT, por lo que tramos largos de CG dan lugar a hebras
más firmes que hélices con regiones AT.

 CITOSINA

La Citosina (C) es una de las cuatro bases del ADN, siendo las otras tres la adenina (A),
guanina (G) y timina (T). Dentro de la molécula de ADN, las bases de citosina se
encuentran localizadas en una cadena formando enlaces químicos con las bases de guanina
de la cadena opuesta. La secuencia de las cuatro bases del ADN es lo que codifica las
instrucciones genéticas de la célula.

La Citosina es uno de los cuatro componentes básicos del ADN y el ARN, y es uno de los
cuatro nucleótidos que son parte del código genético. La Citosina tiene la propiedad única
de unirse en la doble hélice frente a la guanina, uno de los otros nucleótidos. La Citosina
tiene otra propiedad interesante que no posee ninguno de los otros nucleótidos, y es que
muy a menudo en la célula, la citosina puede tener un producto químico adicional ligado a
ella; un grupo metilo. Esta metilación del ADN en citosinas se cree que ayuda a regular los
genes, a activarse y desactivarse.

 TIMINA
Timina (T) es una de las cuatro bases químicas del ADN, los otros tres son adenina (A),
citosina (C) y guanina (G). Dentro de la molécula de ADN, las bases de timina se
encuentran en una línea que forma enlaces químicos con las bases de adenina en la cadena
opuesta.

Timina es uno de los componentes básicos del ADN. Es uno de los cuatro nucleótidos que
se unen para hacer la larga secuencia que se encuentran en el ADN, de C, A, G y T. En la
doble hélice, la timina se aparea con la adenina; el nucleótido A.
RNA
ADENINA, GUANINA, CITOSINA Y URACILO
 URACILO

Uracilo (U) es una de las cuatro bases químicas que forman parte del ARN. Las otras tres
bases son la adenina (A), citosina (C) y guanina (G). En el ADN, la base timina (T) se
encuentra en lugar del uracilo
El uracilo es un nucleótido, al igual que la adenina, guanina, timina y citosina, que son los
componentes básicos del ADN, excepto que el uracilo reemplaza a la timina en el ARN.
Así uracilo es un nucleótido que se encuentra casi exclusivamente en el ARN.
Un protocolo básico para la separación de fragmentos de ADN usando electroforesis en
gel de agarosa.
El uso de electroforesis en gel de agarosa ha revolucionado la separación del ADN. Antes
de la adopción de geles de agarosa, el ADN se separó utilizando principalmente de
densidad de sacarosa centrifugación en gradiente, que sólo proporcionan una aproximación
de tamaño. Para separar el ADN utilizando electroforesis en gel de agarosa, el ADN se
carga en prefabricados pozos en el gel y una corriente aplicada. El esqueleto de fosfato del
ADN (y ARN) molécula está cargado negativamente, por lo tanto, cuando se coloca en un
campo eléctrico, los fragmentos de ADN migrarán a la carga positiva, al ánodo. Debido a
que el ADN tiene un uniforme relación masa / carga, las moléculas de ADN se separan por
tamaño en un gel de agarosa en un patrón tal que la distancia recorrida es inversamente
proporcional al logaritmo de su peso molecular 3. El modelo principal para el movimiento
de ADN a través de un gel de agarosa es "parcial reptación", con lo que el borde delantero
se mueve hacia adelante y tira el resto de la molécula a lo largo de la velocidad de
migración de una molécula de ADN a través de un gel se determina por el siguiente:
1) el tamaño de la molécula de ADN
2) la concentración de agarosa
3) conformación de ADN
4) la tensión aplicada
5) presencia de bromuro de etidio
6) de tipo de tampón de electroforesis en agarosa
7) Después de la separación, las moléculas de ADN pueden ser visualizadas bajo luz UV
después de la tinción con un colorante adecuado.
PREPARACIÓN DEL GEL

La concentración de agarosa dependerá

Pesar la masa apropiada de de los fragmentos de DNA que se
agarosa. (p/v) separaron.

Añadir tampón de agarosa al Amortiguadores son TAE (40 Mm

matraz que contiene. Agite. Tris-acetato, 1 Mm) EDTA) y de TBE
(45 mM Tris-borato, 1 mM EDTA)

Fundir la mezcla de
agarosa/tampón. En intervalos de
30 s, retirar el matraz y agitar bien.

NOTA: EtBr es un carcinógeno y

Añadir bromuro de etidio (EtBr) a debe desecharse de forma
una concentración de 0.5 g/ml. adecuada.

Dejar que la agarosa se enfríe bien

en la mesa de trabajo o por
incubación en un baño de 65 °C. el
agua.

Coloque la bandeja de gel en el aparato

de fundición.

Colocar un peine adecuado en el molde

de gel para crear los pocillos.

Verter la agarosa fundida en el molde de Alternativamente, la gel también puede

gel. Permitir la agarosa para estableces a ser envuelto en una envoltura de
temperatura ambiente. Retirar el peine plástico y se almacena a 4 °C hasta su
y colocar el gel en el cuadro de gel. uso.
Puesta en marcha de aparato de gel y la separación de fragmentos de DNA.

Añadir colorante de carga para las

muestras de DNA para ser separados.
0.25 % azul de bromofenol, o.25 %
Gel de carga de colorante se hace
cianol xileno, 30 % de glicerol.
típicamente en una concentración 6X.

Programa de la fuente de alimentación a

la tensión deseada.

Añadir tampón, suficiente corriente para

cubrir la superficie del gel.

Coloque los cables de la caja de gel a la

fuente de alimentación. Encienda la
fuente de alimentación y verificar que
Encienda la alimentación. Ejecutar el gel
tanto la caja de gel y la fuente de
hasta que el colorante ha migrado a una
alimentación están trabajando. distancia apropiada.

Retire la tapa. Despacio y cuidadosamente Compruebe que los electrodos se

cargar la muestra de DNA(s) en el gel. Un conectan en las ranuras correctas en la
marcador de DNA de tamaño apropiado se fuente de alimentación.
deberán colocar siempre junto con las
muestras experimentales.
OBSERVANDO SEPARADOS POR FRAGMENTOS DE DNA

Cuando se ha completado la
electroforesis, apague la fuente de
alimentación y retire la tapa de la caja
de gel.

1. Quitar el gel de la cubeta. Escurrir el

exceso de tampón de la superficie del
gel. Coloque la bandeja de gel en las
toallas de papel para absorber el búfer
adicional en ejecución.

Quitar el gel de la bandeja de gel y

exponer el gel a la luz UV. Las bandas de
DNA debe mostrar arriba como bandas
fluorescentes de color naranja.

LOS RESULTADOS REPRESENTATIVOS

Después de la separación, los fragmentos de ADN resultantes
son visibles como bandas claramente definidas. El estándar de
ADN o escalera debe ser separado a un grado que permita la
determinación útil de los tamaños de las bandas de la muestra.
 Extracción y purificación de ácidos nucleicos.
Todos los tipos de macromoléculas biológicas tienen una característica en común que va a permitir el
desarrollo de un método de separación específico para ellas. Estos métodos deben ser completamente
biocompatibles para que puedan ser posteriormente útiles al investigador y, al mismo tiempo, lo
suficientemente potentes para permitir el aislamiento de la molécula deseada de entre un mezcla
compleja de multicomponentes que hacen las veces de “contaminantes” de nuestra molécula en
cuestión.

En este sentido, la cromatografía en columna ha demostrado ser una herramienta muy útil ya que se
dispone de varios mecanismos de separación. La modificación de las diferentes fases estacionarias ya
existentes, así como el desarrollo de nuevas es la base principal para la obtención de las condiciones
necesarias para la rápida y eficiente separación de biomoléculas.

El componente básico es una

columna empaquetada con una
matriz en gel especial, que son
partículas de un polímero orgánico
Cromatografía de estructura tridimensional, que
originan una red de poros
de hidrofílicos equilibrados con un
tampón acuoso.
penetrabilidad.  La técnica consiste en
que las moléculas de
gran tamaño no
penetran por los poros
del polímero, por lo que
migran mucho más
rápidamente que las de
menor tamaño que sí
son capaces de penetrar
por los poros de la
matriz. Al principio del
desarrollo de la técnica,
se realizaba a bajas
presiones por lo que el
rango de aplicaciones
estaba restringido
debido a los elevados
tiempos de separación y
su poca resolución. En la
actualidad se han
desarrollado matrices de
sílica estables a elevadas
presiones que se utilizan
columnas de alta
presión, para la
separación de
biomoléculas en función
de su forma y tamaño.
 Es el método más utilizado para la
separación de ácidos nucleicos.
 El mecanismo básico es
el intercambio reversible
Cromatografía de los iones en solución
con los grupos
de intercambio funcionales unidos
iónico. covalentemente a una
fase estacionaria
insoluble llamada resina.
 Por ejemplo, un ácido
nucleico con carga
negativa a pH 7,0 se
unirá a un
intercambiador iónico
con grupos cargados
positivamente, pero
eluirá de la columna al
cambiar el pH del
tampón (tampón de
elución) ya que los iones
del tampón de elución
interaccionan con los
grupos cargados del
ácido nucleico o del
intercambiador iónico,
respectivamente;
primero eluirán de la
columna las moléculas
cargadas positivamente
que no se unen a la fase
estacionaria y
posteriormente, al
añadir el tampón de
elución, eluirán las
moléculas con poca
carga negativa neta y
luego las de mayor carga
negativa neta.
Una modificación de este método
es la extracción en fase sólida, en
la que se utiliza una matriz
intercambiadora de aniones
empaquetada en columnas de
polipropileno. La unión se produce
bajo condiciones de baja salinidad
y durante los pasos de lavado y
elución se va incrementando la
concentración de sales en los
tampones correspondientes. Las
impurezas se eliminan debido a su
diferente capacidad de unión y se
obtienen una rápida y eficiente
purificación de los ácidos nucleicos
(DNA y/o RNA).
 Se basa en la adsorción y
desorción de los ácidos nucleicos
en presencia de sales caotrópicas.
Bajo condiciones nativas, los
ácidos nucleicos están recubiertos
de una capa hidratante de
Cromatografía moléculas de agua que mantienen
de adsorción. la solubilidad del DNA en
soluciones acuosas. Con la adición
de iones caotrópicos a los ácidos
nucleicos, se destruye esta
ordenada estructura de moléculas
de agua de la capa hidratante, por
lo que las sales caotrópicas crean
un entorno hidrofóbico alrededor
del DNA. Bajo estas condiciones
hidrofóbicas, los ácidos nucleicos
se unen perfectamente a la
membrana de sílica de las
columnas, mientras que las
proteínas, los metabolitos y otros
contaminantes no se unen y, por
lo tanto, son eliminados de la
muestra durante los pasos de
lavado.
Posteriormente, los ácidos
nucleicos se eluyen de la
membrana de sílica mediante
tampones de elución con baja
concentración de sales
(ligeramente alcalinos) o
simplemente agua, ya que
permiten recuperar la capa
hidratante de los ácidos nucleicos,
liberándolos así de la membrana.
Con esta tecnología, no se produce
ningún efecto sobre las moléculas
de los ácidos nucleicos ya que la
unión intramolecular de los
mismos no es de naturaleza
hidrofóbica. Con este rápido
proceso de purificación mediante
la tecnología de la adsorción-
desorción sobre membranas de
sílica, se obtiene ácidos nucleicos
altamente purificados.
 En esta tecnología, la muestra se
carga directamente sobre la
membrana de ultrafiltración y
mediante vacío o centrifugación,
se eliminan todos los
contaminantes mientras que la
Ultrafiltración muestra con los ácidos nucleicos
permanecen retenidos en la
superficie de la membrana.
Después de un paso de lavado
opcional, se recuperan los ácidos
nucleicos añadiendo agua o un
tampón adecuado.