Cromatógrafo de gases de espectrometría de masas basada en el perfil metabólico para la

identificación de marcadores de discriminación de Angelicae Radix y su aplicación al sistema

detector de ionización de llama cromatográfica de gases.

Se aplicaron tecnologías de metabolómica basadas en la cromatografía de gases (GC) para el

control de calidad de Angelicae Radix, una medicina herbal comúnmente utilizada en Japón y
China. Dado que las raíces de Angélica tienen un precio y una clasificación diferentes en función de
su especie y área de cultivo, existe la necesidad de un método simple y reproducible para
discriminar las raíces de Angélica.

Aquí, utilizamos los datos de perfil GC-MS para construir un método de discriminación para las
especies y el área de cultivo de A. Radix.

Setenta y seis metabolitos primarios fueron identificados. Los factores de calidad de A. Radix se
clasificaron con éxito utilizando perfiles metabólicos y las proyecciones ortogonales a la técnica de
análisis discriminante de estructuras latentes (OPLS-DA).

El sorbitol y una combinación de glucosa / ácido 4-aminobutírico se eligieron como biomarcadores

de S-plot de OPLS-DA. También se evaluó la aplicación de estos biomarcadores seleccionados a un
sistema más práctico y rentable, a saber, el sistema detector de ionización de llama por
cromatografía de gases (GC-FID). Como resultado, se obtuvieron las mismas separaciones de
sorbitol, glucosa y ácido 4-aminobutírico en gráficos de caja a partir de datos de GC-FID. Nuestros
resultados demuestran que los marcadores metabólicos basados en GC pueden aplicarse
fácilmente para establecer un método de control de calidad práctico para A. Radix.

Las raíces secas de Angélica (Angelicae Radix) se han utilizado como una droga cruda tradicional
para una amplia variedad de trastornos ginecológicos en el este de Asia. La Farmacopea Japonesa
16º (JP) aprueba el uso de Angelica acutiloba Kitagawa (Yamato-toki en japonés) y A. acutiloba
Kitagawa var. sugiyamae Hikino (Hokkai-toki en japonés), mientras que A. sinensis es la especie
ampliamente utilizada en China. Recientemente, el suministro de A. Radix producido en Japón ha
sido insuficiente y solo satisface aproximadamente el 44% de la demanda interna (1). Para hacer
frente a esta escasez, A. acutiloba que inicialmente se exportó a China y luego se cultivó en China
ahora se importa y circula dentro de Japón. En Japón, A. acutiloba que se produce en el país se
vende generalmente a un precio más alto que A. acutiloba producido en China o A. acutiloba var.
sugiyamae (2). Por lo tanto, la discriminación de A. Radix en función de su especie y área de cultivo
se está convirtiendo en un tema importante en la industria de la medicina herbal.

La discriminación de especies se ha realizado mediante análisis genéticos y análisis de

metaboloma. Las especies de A. Radix podrían ser discriminadas utilizando el análisis de la
secuencia de ADN de los dominios 5S-rRNA spacer y el genoma del plástido (3). La amplificación
aleatoria del ADN polimórfico (RAPD) también se ha usado para discriminar A. acutiloba, A.
acutiloba var. sugiyamae y A. sinensis (4,5).

Aunque el ADN es una macromolécula extremadamente estable que no se ve afectada por

factores externos (6), el uso potencial del método de base genética se ve obstaculizado por varios
factores técnicos, como contaminaciones de ADN no objetivo en muestras de PCR (7) o baja
reproducibilidad en Método RAPD (8). Discriminación de A. acutiloba y A. sinensis
basado en sus componentes químicos se ha centrado principalmente en los principales
componentes químicos que están directamente relacionados con la actividad farmacológica de A.
Radix, como la ligustilida y la xantotoxina (2). Estudios sobre la identificación de especies basados
en el contenido de compuesto no polar (9,10), y por compuestos volátiles, tales como ligustilida y
butilidentaluro (11) también se han informado.

Aunque la información sobre los compuestos farmacológicos tiene una importancia significativa en
el estudio de Angélica, la calidad de A. Radix se determina actualmente en función de su calidad
sensorial, como la apariencia, el aroma y el sabor, en lugar de basarse únicamente en sus
componentes activos. Por lo tanto, el uso de compuestos farmacológicos como marcadores parece
ser inadecuado ya que no está en línea con el método utilizado para calificar la calidad de las
muestras de crudo en los mercados comerciales. La dulzura de las cualidades sensoriales para A.
acutiloba se usa como un factor de calidad importante desde 1783 (1) al menos. Además, los
azúcares se han descrito como los compuestos que se ven altamente afectados por los métodos
de procesamiento (12). Por lo tanto, el desarrollo de métodos para la evaluación de la calidad y la
discriminación de los productos finales de A. Radix basado en metabolitos primarios se consideran
más aplicable para uso en la industria.

Nuestro grupo ha informado recientemente sobre varios estudios de metabolómica para la

discriminación de A. acutiloba y A. acutiloba var. Sugiyamae utilizando resonancia magnética
nuclear (RMN) (13), gas espectrometría de cromatografía de masas (GC-MS) (14), pirólisis GC-MS
(15) y cromatografía líquida de rendimiento ultraelevador (UPLC-MS) (16). Sin embargo, la
discriminación se realizó solo por análisis cualitativo y la significación estadística de los marcadores
candidatos no se mencionaron en los informes. Una reciente informe que utilizó el análisis
estadístico para la evaluación de marcadores por NMR y UPLC-MS es el estudio sobre A. gigas de
tres diferentes regiones en Corea (17). Las muestras analizadas solo representadas área de cultivo
como factor de calidad. Para evaluar la calidad de A. Radix en el mercado global, un método para
evaluar los marcadores de ambas especies y el área de cultivo utilizando un análisis más
cuantitativo con significancia estadística por t-test es necesaria. Al mismo tiempo, el método
establecido también debe ser confiable, rápido y rentable para una aplicación real en la industria.

En este estudio, nuestro objetivo es establecer un método práctico para la discriminación de

especies y origen geográfico de A. Radix. A lograr nuestros objetivos, utilizamos datos de perfiles
GC-MS o metabolitos para identificar marcadores estadísticamente significativos para la
discriminación de A. Radix. GC-MS se utilizó inicialmente para propósito de la identificación
compuesta con alta precisión, sensibilidad y reproducibilidad Posteriormente, mostramos una
aplicación de identificadores de un instrumento más práctico y rentable, cromatografía de gases
con detector de ionización de llama (GC-FID) (18). GC-FID es adecuado para el control de calidad
de rutina de A. Radix porque es un instrumento relativamente barato, es

actualmente disponible en la mayoría de las pequeñas fábricas y ya han sido reconocido en el JP.
Nos enfocamos en métodos efectivos de clasificación A. Radix durante el control industrial más
que en la industria farmacéutica efectos de las muestras.

Como una herramienta apropiada para identificar marcadores de clasificación, Proyecciones

ortogonales a estructuras latentes-análisis discriminante (OPLS-DA) se aplicaron los modelos. La
varianza de estos compuestos entre los grupos de muestra se evaluó estadísticamente mediante t-
test. Nosotros evaluar aún más la aplicación de estos marcadores usando un instrumento rentable,
GC-FID. La usabilidad GC-FID también fue mostrado desde el punto de vista de los significados
estadísticos en t-test e intensidades máximas por diagramas de caja. Nuestros resultados
demuestran que basado en GC la tecnología metabolómica es una herramienta poderosa para el
establecimiento de un método práctico de control de calidad para la discriminación de especies y
área de cultivo de A. Radix.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestras Todas las muestras de A. Radix fueron provistas por Tochimoto Tenkaido Co. Ltd. (Osaka,
Japón). Se realizaron identificaciones de especies de las muestras por descripción de un fármaco
crudo e identificación microscópica por un especialista antes del análisis de este estudio. Los
detalles de la muestra se muestran en la Tabla 1. Nara, Hokkaido y Gansu son conocidos como las
principales áreas de cultivo de A. acutiloba, A. acutiloba Kitagawa var. sugiyamae Hikino (1) y A.
sinensis (19), respectivamente.

Los especímenes primero se cortaron en rodajas o se astillaron antes de ser molidos en un polvo
fino Las muestras se guardaron en un tubo de plástico de 50 ml con luz blindaje en el congelador
30°C antes de su uso. Extracción de muestras y condiciones de análisis para el perfil metabólico
basado en GC se llevó a cabo como se describió anteriormente (14) con algunas modificaciones
que se pueden encontrar en Información de respaldo.

Detalles para la extracción de muestras, condiciones de análisis para GC-MS y GC-FID, datos
preprocesamiento y análisis multivariante también están disponibles como Soporte Información.

Productos químicos para análisis GC-FID de marcadores, sorbitol, ácido 4-aminobutírico se

compraron de Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Osaka, Japón). Glucosa fue comprado en
Nacalai Tesque (Kyoto, Japón).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN

GC-MS análisis GC-MS se utilizó para identificar y cuantificar compuestos hidrófilos de bajo peso
molecular en A. Radix muestras. Después de realizar el procesamiento de datos y el pico

determinación como se describe en Materiales y Métodos, estábamos capaz de identificar setenta

y seis compuestos en estas muestras (Tabla S1). El número total de compuestos identificados fue
mucho más de 22 metabolitos en nuestro estudio anterior (14), en su mayoría debido a la
operación de la salida de AI, un pico de GC-MS recientemente desarrollado sistema de anotación
(20).

Análisis de componentes principales Análisis de componentes principales (PCA) se utilizó para

explorar la estructura de datos obtenida por GC-MS. Como se muestra en la Fig. S1, el primer y
segundo principio componentes (PC) de la trama de puntuación PCA representó el 38,5% y

35.2% de la varianza total de las muestras, respectivamente. La varianza de las diferencias de

especies fue capturada con éxito en PC2. La trama de carga de PC2 reveló que la prolina
contribuyó a la discriminación de A. sinensis de otras especies. Este resultado fue consistente con
un informe anterior que establece que la acumulación de prolina, que puede variar hasta 100
veces, varía en las plantas (21).

Por lo tanto, la prolina podría convertirse en un marcador valioso para distinguiendo A. Radix.

Proyecciones ortogonales a estructuras latentes-discriminantes clasificación de análisis (OPLS-DA)

Luego analizamos los componentes que contribuyeron a la separación de A. Radix

sobre especies y origen agrícola utilizando proyecciones ortogonales para análisis discriminante de
estructuras latentes (OPLS-DA) y componente datos de perfil generados por GC-MS. S-plot (22) de
OPLS-DA fue utilizado porque ayuda a identificar metabolitos estadísticamente significativos,

basado tanto en las contribuciones al modelo como en su confiabilidad. UN número de problemas

analíticos de datos aparentemente diferentes puede ser expresado como problemas de regresión
con una codificación especial de Y o X en análisis discriminante lineal (LDA) y análisis de varianza

(ANOVA) (23). Por ejemplo, hubo problemas tales como dimensionalidad, multicolinealidad, ruido
y datos faltantes (24).

Con muchas variables colineales, una solución PLSR puede, por lo tanto, ser formulado para cada
uno de estos. Además, ventaja de OPLS comparado con PLS es que el modelo se rota de modo que
la separación de clases se encuentra en el primer componente predictivo (22). El primero
componente de OPLS facilita la interpretación del modelo. S-plot de OPLS-DA se utilizó para buscar
biomarcadores confiables porque Splot fue una excelente herramienta para la interpretación de
OPLS-DA. Las muestras se dividieron en cuatro grupos basados en especies y área de cultivo, A.
acutiloba de Japón, A. acutiloba de China, A. acutiloba var. sugiyamae y A. sinensis (Tabla 1).
Filogenético análisis de A. Radix por RAPD mostró que A. sinensis podría ser completamente
discriminado de las otras dos especies de Angélica (3,4). Por lo tanto, comenzamos a clasificar
todas las muestras de A. Radix por distinguiendo A. sinensis de los demás, y posteriormente se
separó A. acutiloba y A. acutiloba var. sugiyamae.
La discriminación de A. acutiloba basada en su origen agrícola fue también realizado. Todos los
modelos OPLS-DA fueron construidos con el número de variables latentes de 1 y Q2 mayores que
0.8 (Tabla S2). Q2 es la capacidad predictiva validada cruzada (22). Si o no un modelo de
predicción es bueno se puede juzgar en términos de Q2 valor, y un modelo se considera bueno si
Q2> 0.5; Si Q2> 0.9, se considera que un modelo tiene un excelente predictivo habilidad (24).

Además, se realizaron pruebas de permutaciones en el PLS-DA modelo para validar cada modelo
OPLS-DA según la validación métodos en trabajos previos de A. gigas (17). Todos los valores Q2 y
R2 fueron más alto en la prueba de permutación que en el modelo real, revelando gran
predictibilidad y bondad de ajuste. La validación externa apunta a abordar la precisión de un
modelo en muestras de diferentes muestras.

Para la predicción, se dejaron las una o dos muestras (un conjunto de datos de prueba) al azar de
cada región (un conjunto de datos de entrenamiento) y el OPLS-DA el modelo de predicción se
realizó tres veces sin ellos. El corte de la predicción fue 0.5. Como resultado, casi todas las
muestras fueron correctamente clasificadas (Fig. S2). En la Tabla S3, los valores R2 y Q2 de todos
los modelos tenían más de 0,85 (figura 1).

S-plot se usó para elucidar compuestos que eran importantes para la clasificación basada en la
covarianza y la correlación de perfiles de carga de cada metabolito. Para limitar el número de
seleccionados metabolitos, valores absolutos de p y p (corr) se establecieron para ser mayores que
0.2 y 0.5 (25). El sorbitol tuvo valores más altos de p y p (corr) luego otros compuestos (Tabla S4).
Luego calculamos el máximo y altura mínima de pico y desviación estándar del seleccionado

compuestos (Tabla S5). La altura máxima de cada compuesto seleccionado fue significativamente
diferente entre los grupos, según lo evaluado por t-test. Estas observaciones indicaron que los
compuestos seleccionados de la parcela S son bio-marcadores candidatos Para usar estos
marcadores como umbrales en aplicaciones prácticas e industriales, sin embargo, el rango de pico
las alturas del marcador no deben solaparse con eso en otros grupos.

Una comparación del diagrama de caja del rango de alturas máximas del candidato los marcadores
entre los grupos de muestra se muestran en la Fig. 2. Ácido cítrico, glucónico ácido, glucosa, ácido
málico, prolina y sorbitol fueron ilustrados porque estos fueron seleccionados de S-plot of OPLS-
DA.

Las alturas máximas de estos compuestos se normalizaron a las de ribitol, un estándar interno. El
resultado mostró que la prolina y el sorbitol podría usarse como marcador único para discriminar
A. sinensis de otras especies. Este resultado fue consistente con los resultados de la trama en S,
donde el sorbitol mostró jp (corr) j más cercano a 1 de todos los compuestos (Tabla S4). Luego
intentamos identificar biomarcadores de compuestos únicos para la discriminación de A. acutiloba
y A. acutiloba var. sugiyamae. Sin embargo, los rangos de glucose_1 (Fig. 3A) o 4-aminobutyric
ácido (Fig. 3B) superpuesto, y estas dos especies no podrían ser discriminado usando un
compuesto marcador único. Para superar este problema, intentamos usar bio-marcadores de dos
compuestos.

Basado en la trama S, apareció el ácido 4-aminoabutírico y la glucosa_1. en el lado izquierdo y

derecho del gráfico, respectivamente. Por lo tanto, estos dos compuestos contribuyeron en la
discriminación de A. acutiloba y A. acutiloba var. sugiyamae. Superposición de diagramas de caja
basados en el rango de la relación de altura máxima entre A. acutiloba y A. acutiloba var.
sugiyamae podría resolverse (Fig. 3). Por lo tanto, un compuesto de dos bio-marcador se utilizó
para discriminar con éxito A. acutiloba de A. acutiloba var. sugiyamae.

Fig 1. Resultados de las pruebas de permutación, que se llevaron a cabo con 200 permutaciones al
azar en modelos PLS-DA a partir de datos GCeMS. (A) 4 vs 3, 2, 1 modelo, (B) 4 vs 2, 1 modelo, (C)
4 frente a 3, (D) 3 frente a 2, 1 y (E) 2 frente a 1.

fig. 2. Cuadros de caja de compuestos seleccionados por S-plot de OPLS-DA usando intensidades
GC-MS relativas a patrón interno, ribitol: (A) ácido cítrico, (B) ácido glucónico, (C) glucose_1, (D)
málico ácido, (E) prolina y (F) sorbitol.

Además, investigamos marcadores de discriminación de A. muestras de acutiloba basadas en el

origen agrícola utilizando la proporción de las alturas de los picos seleccionados por el gráfico S
(Tabla S5). A pesar de que hay varios compuestos que mostraron diferencias significativas entre las
muestras evaluadas por t-test, no pudimos lograr una separación sin superposición entre muestras
en el diagrama de caja usando biomarcadores de dos compuestos. Sin embargo, diferencias de
marcadores que identificamos usando los perfiles GC-MS de muestras A. Radix que contenía
prolina / ácido cítrico fueron significativos por t-test basado en especies y área de cultivo. Para
discriminar Angélica Muestras de radix basadas en el área de cultivo, la relación entre la prolina y
ácido cítrico (p = 0.184, p (corr) = 0.535) que fue solo pico lpl> 0.15 y lp (corr) l = 0.5 (no se usó
ácido cítrico en el manuscrito) se utilizaron para superar una superposición entre las muestras
cultivadas en China y Japón Aunque los umbrales (lpl> 0.2 y lp (corr) l = 0,5) fueron apropiados
para seleccionar marcadores en este método, desafortunadamente, una superposición no mejoró
como se pudo ver en Fig. S3. Discriminación de Angelica Radix basada en el área de cultivo podría
ser posible con el uso de otro instrumento analítico tal como espectrometría de masas de plasma
acoplado inductivamente (ICP-MS). ICPMS puede ser un instrumento adecuado para discriminar
diferencias de área de cultivo, ya que puede analizar los elementos metálicos que directamente
tener relación con la composición del suelo. Sin embargo, si tenemos en cuenta consideración de
muchos factores involucrados en el control de calidad, combinación de GC-MS y GC-FID es una
técnica más apropiada porque puede capturar varios factores como especies, cultivo área y
métodos de procesamiento y calidad sensorial. Para el propósito del control de calidad en el
mercado, el uso de instrumentos que puede evaluar múltiples variables simultáneamente sería
deseable.

FIG.3 FIG. 4

FIG. 3. Diagramas de caja del grupo 3 frente a 1, 2 usando intensidades GC-MS relativas: (A)
glucosa_1, (B) ácido 4-aminobutírico y (C) ácido de glucosa_1 / 4-aminobutírico.

FIG. 4. Espectro GC representativo de Angelicae Radix (muestra n. ° 1): (A) GC-MS espectros, (B)
espectros GC-FID.
FIG. 5. Diagramas de cajas de compuestos seleccionados por los datos GC-MS usando GC-FID
relativo intensidades al estándar interno, ribitol: (A) sorbitol, (B) glucose_1, (C) 4-aminobutyric
ácido y (D) glucosa_1 / 4-ácido aminobutírico.

Validación por análisis GC-FID Para que nuestros resultados sean más aplicables para su uso en la
industria, análisis por un costo más simple y más rentable instrumento GC-FID se realizó.
Sometimos los marcadores seleccionados de datos GC-MS e sorbitol, glucosa y Ácido 4-
aminobutírico a GC-FID y encontró que todos los marcadores podrían ser utilizado en el sistema
GC-FID. Los cromatogramas de GC-FID y GC-MS se muestran en la Fig. 4. Todos los marcadores
fueron controlados por compuestos estándar. Tiempos de retención de sorbitol, glucosa y El ácido
4-aminoglutámico fue 705.0, 688.2 y 528.0 s, respectivamente.

En la Fig. 5, diagramas de caja de intensidades relativas obtenidas de GC-FID análisis fueron

mostrados para validación. En la Tabla S6, diferencias de todos los marcadores fueron
significativos por t-test. Probamos que las intensidades de el mismo marcador por análisis GC-FID
pudo identificar especies y el área de cultivo de A. Radix.

En conclusión, discriminamos con éxito las especies y el cultivo área por datos GC-MS y OPLS-DA.
Intensidades GC-MS de los marcadores seleccionados por S-plot fueron estadísticamente
significativos por t-test. El marcador de doble compuesto fue eficiente para aumentar la
intensidad relativa separación en el diagrama de caja. Además, los marcadores eran aplicables a
un análisis GC-FID más convencional. El método mostrado en este estudio será particularmente
útil para la selección de marcadores para identificar factores de calidad en la evaluación comercial
no solo de otras hierbas medicamentos, sino también productos alimenticios.