Anda di halaman 1dari 40

LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA FARMASI ANALISA II

PRAKTIKUM V

PENENTUAN KADAR CAMPURAN PARACETAMOL DAN KAFEIN


MENGGUNAKAN HPLC

PENYUSUN :

KELAS III A

1. BELLA SASKIA FEBRI PRAMESTI (E0016010)


2. GIRLY RISMA FIRSTY (E0016016)
3. REANALDY IBRAHIM MASUDI P. (E0016030)
4. SUCI HIDA LESTARI (E0016038)
5. VENY FEBRIANI (E0016040)

DOSEN PENGAMPU : Iswandi, M.Farm., Apt

LABORATORIUM KIMIA FARMASI


PROGRAM STUDI S1 FARMASI
STIKes BHAKTI MANDALA HUSADA SLAWI
2019
PRAKTIKUM V
PENENTUAN KADAR CAMPURAN PARACETAMOL DAN KAFEIN
MENGGUNAKAN HPLC

I. TUJUAN
1. Dapat memahami cara kerja instrumen HPLC
2. Dapat melakukan preparasi dengan tepat dan akurat, serta dapat mengikuti
manual pengoprasian HPLC
3. Dapat menentukan atau menghitung kadar paracetamol dan kafein
dalamsampel obat.

II. DASAR TEORI


HPLC (High Perfomance Liquid Chromatography) merupakan tipe
kromatografi elusi yang paling serbaguna dan digunakan secara luas. Teknik
ini digunakan oleh para kimiawi secara kuantitatif dan kualitatif untuk
memisahkan dan menentukan spesi-spesi dalam berbagai bahan atau senyawa
seperti senyawa organik, anorganik, maupun material biologis yang berkadar
sangat kecil, dalam skala ng/L. Juga metoda ini hanya memerlukan jumlah
cuplikan yang sangat kecil (ml), teknik perbandingan kurang menghasilkan
data yang akurat bila hanya melibatkan satu konsentrasi standar. Oleh karena
itu, lebih akurat dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi. HPLC
dapat digunakan dalam analisis cuplikan Kimia Lingkungan, Farmasi, atau
kedokteran.
(Tim Dosen Kimia Analitik. 2013)
Kromatografi menyangkut metode pemisahan yang didasarkan atas
distribusi differensial komponen sampel diantara dua fasa. Menurut pengertian
ini kromatografi selalu melibatkan dua fasa ,yaitu fasa diam (stationary phase)
dan fase gerak (mobile phase). Fasa diam berupa padatan atau cairan yang
terikat pada permukaan padatan (kertas atau suatu adsorben) sedangkan fasa
gerak berupa cairan disebut eluen.
Jenis-jenis kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) biasanya
dikelompokkan oleh mekanisme pemisahannya ataupun jenis fasa diamnya.
Pengelompokkan tersebut diantaranya:
1) Partisi atau Kromatografi Cair-Cair
2) Adsorpsi atau kromatografi Padat-Cair
3) Penukar Ion atau Kromatografi Ion
4) Size-Exclusion Chromatography (Kromatografi Eksklusi Ukuran)
5) Kromatografi Afinitas
6) Kromatografi Kiral
(Budiasih,dkk.1999)

Prinsip kerja HPLC adalah berdasarkan distribusi differensial komponen


di antara dua fasa yang disebabkan oleh perbedaan kepolaran. Prinsip kerja
alat instrument HPLC adalah sebagai berikut :
Dengan bantuan pompa, fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke
detektor. Cuplikan dimasukan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara
penyuntikan.
Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran.
Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solute-solute terhadap fasa diam.
Solute-solute yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari
kolom lebih dulu. Sebaliknya, solute-solute yang kuat interaksinya dengan
fasa diam maka solute-solute tersebut akan keluar dari kolom lebih lama.
Setiap komponen campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detector
kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. Kromatogram HPLC serupa
dengan kromatogram GC, jumlah peak menyatakan jumlah komponen,
sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran.
Komputer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC.
Gambar : Skema instrument HPLC
(De Lux Putra, Effendy. 2004)

Terdapat dua perbedaan dalam HPLC berdasarkan polaritas dari pelarut


dan interaksi terhadap fasa diamnya.
1. Fasa normal HPLC, dimana dengan fasa diamnya bersifat lebih polar
daripada pelarutnya.
2. Fasa balik HPLC, dimana dengan fasa diamnya bersifat non-polar
dibandingkan dengan pelarutnya.
(Sudjadi dan Rahman, A. 1994)
Adapun Instrumentasi Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi atau HPLC :
1. Fase gerak
Fasa gerak dalam HPLC adalah zat cair. Dalam HPLC, fasa gerak
selain berfungsi membawa komponen - komponen campuran menuju
detektor, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solute - solute. Oleh karena
itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu factor penentu
keberhasilan proses pemisahan.
Wadah fase gerak terbuat dari bahan yang inert terhadap fase
gerak. Bahan yang umum digunakan adalah gelas dan baja anti karat.
Daya tampung tandon harus lebih besar dari 500 ml, yang dapat digunakan
selama 4 jam untuk kecepatan alir yang umumnya 1-2 ml/menit.
2. Pompa
Fase gerak dalam KCKT /HPLC adalah suatu cairan yang
bergerak melalui kolom Pompa dalam HPLC berfungsi untuk
mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus.
Untuk menggerakkan fase gerak melalui kolom diperlukan pompa.
Pompa harus mampu menghasilkan tekanan 6000 Psi pada kecepatan alir
0,1–10 ml/menit. Pompa ada 2 jenis yaitu pompa volume konstan dan
pompa tekanan konstan. Pompa terbuat dari bahan yang inert terhadap
semua pelarut. Bahan yang umum digunakan adalah gelas baja antikarat
dan teflon. Aliran pelarut dari pompa harus tanpa denyut untuk
menghindari hasil yang menyimpang pada detektor.
3. Injektor
Cuplikan harus dimasukkan ke dalam pangkal kolom (kepala
kolom), diusahakan agar sesedikit mungkin terjadi gangguan pada
kemasan kolom. Ada tiga jenis dasar injektor, yaitu:

A. Hentikan aliran/stop flow


Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir,
sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Tehnik ini bisa digunakan
karena difusi di dalam aliran kecil dan resolusi tidak dipengaruhi.

B. Septum
Injektor-injektor langsung ke aliran fase gerak umumnya sama
dengan yang digunakan pada kromatografi gas. Injektor ini dapat
digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak
tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Disamping itu,
partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat
menyebabkan penyumbatan.

C. Katup putaran (loop valve)


Ditunjukkan secara skematik dalam Gambar 6, tipe injektor ini
umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari pada
10µl dan sekarang digunakan dengan cara automatis (dengan adaptor
khusus, volume-volume lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual).
Pada posisi LOAD, sampel loop (cuplikan dalam putaran) diisi pada
tekanan atmosfir. Bila katup difungsikan, maka cuplikan di dalam
putaran akan bergerak ke dalam kolom.

4. Kolom dan fase diam


Kolom utama berisi fasa diam, tempat terjadinya pemisahan
campuran menjadi komponen-komponennya. Bergantung keperluannya
kolom utama dapat digunakan untuk analisis atau preparatif. Untuk
keperluan preparatif, setiap komponen yang keluar dari kolom ditampung
pada tabung yang berbeda dan keluaran HPLC dihubungkan dengan
fraction colector. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada
pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Ada 2 jenis kolom
pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor, Perbandingan
antara 2 kolom tersebut :

PARAMETER KOLOM KONVENSIONAL KOLOM MIKROBOR


Tabung Stainless steel Stainless steel
Panjang 3,10,15,20 dan 25 cm. Panjang 25 dan 50 cm Diameter
Kolom
Diameter luar :0,25 inci; dalam : luar : 0,25 inci; dalam : 2 mm.
4,6 mm.
Fase Diam Porous, silica ukuran kecil dan Porous, silica ukuran kecil dan
yang dimodifikasi secara kimiawi, yang dimodifikasi secara kimiawi,
polimer-polimer stiren/divinil polimer-polimer stiren/divinil
benzene. benzene.

Tekanan 500-3000 psi (35-215 bar). 1000-5000 psi (70-350 bar)


Operasional

Fase Fase gerak Hidrokarbon + pelarut- Hidrokarbon + pelarut-pelarut


Gerak pelarut terklorinasi atau alcohol terklorinasi atau alcohol untuk
untuk fase normal. Untuk fase fase normal. Untuk fase terbalik
terbalik digunakan methanol atau digunakan methanol atau
asetonitril + air atau buffer. asetonitril + air atau buffer.
Kecepatan alir : 1-3 ml/menit. Kecepatan alir : 10-100 µl/menit.
Kinerja Efisiensi meningkat dengan Sangat efisien dan sensitive, tetapi
berkurangnya ukuran pertikel fase lambat Konsumsi fase gerak lebih
diam, tetapi umur kolom dengan hemat yaitu ¼ dari kolom
ukuran pertikel 3 µm lebih konvensional.
pendek.
(Johnson dan Stevenson, 1991; Munson, 1991 dan Rohman, 2007)
5. Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen
sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya
(analisis kuantitatif). Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang
tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas,
dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang
rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan,
tetapi tidak selalu dapat diperoleh. Detektor KCKT /HPLC yang
umum digunakan adalah detektor UV 254 nm.
(R.P. Budhiraja, 2004)
6. Rekorder atau komputer (pengolah data)
Berfungsi menampilkan hasil dari pemisahan kromatografi.
Kromatogram berupa waktu retensi (sumbu x) dan intensitas
penyerapan (sumbu y). Hasil kromatogram akan kurang baik
dikarenakan adanya pelebaran puncak.
Pelebaran yang terjadi dapat disebabkan oleh tiga faktor, yaitu :
a. Difusi Eddy
b. Transfer massa
c. Difusi longitudinal

Pelarut dalam HPLC diantaranya n-heksana, sikloheksana,


tetraklorometana, metilbenzena, isopropanol, etanol, methanol, asam etanoat,
dan air. Sementara fasa diam dalam HPLC diantaranya oktilsilika,
propilsilika, aminopropil, asam sulfonat, dan amina kuartener.
(al-anshory,2007)
Parasetamol dan kafein pada umumnya terdapat bersama sama dalam
satu tablet obat yang memiliki sifat kepolaran berbeda. Gugus kromofor yang
dimilikinya menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV.
Karaktersitik senyawa ini memungkinkan analisis dengan teknik HPLC
menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar campuran
beberapa pelarut.
(Tim Dosen Praktikum Pemisahan dan Pengukuran, 2015)
 Parasetamol
Paracetamol secara luas digunakan untuk obat yang diperuntukan
sebagai penawar rasa sakit, demam(mengurangi temperature). Tindakan ini
dikenal sebagai analgesik dan antipiretik. Paracetamol murni berbentuk
kristal padat yang meleleh pada suhu 167-171°∁. Parasetamol berwujud
serbuk hablur berwarna putih tidak berbau dan sedikit pahit. Mengenai
kelarutannya parasetamol larut dalam air dingin adalah 1,43 g/100 cm3, tetapi
jauh lebih larut dalam air panas yakni 5 g/100 cm3 dan dalam etanol
kelarutannya 14 g/100 cm3, larut dalam air mendidih dan dalam NaOH 1N,
mudah larut dalam etanol, memiliki rumus empiris C8H9NO2 . Adapun
struktur kimia parasetamol adalah:
Gambar : Struktur Parasetamol
(Ellis, Frank. dkk. 2002)
 Kafein
Alkaloid yang mempunyai lingkar purin (lingkar senyawa heterosiklik
yang majemuk, yang merupakan kondensasi antara lingkar imidazol dan
lingkar pirimidin). Dengan rumus molekul C5H10N4O2 yang terdapat dalam
biji-biji kopi dan daun teh. Kristal kafein berbentuk jarum-jarum berwarna
putih, tidak berbau, dan berasa pahit yang bekerja sebagai obat perangsang
psikoaktif dan diuretic ringan. Kafein yang tidak mengandung kristal mencair
pada suhu 238 °∁. Kafein larut dalam larutan pirol dan tetrahidrofuran.
Kelarutan kafein dalam air berkurang degan adanya asam-asam
organik. Adapun struktur kimia dari kafein adalah :

Gambar : Struktur Kafein


(Damin Sumardjo, 2009)
III. ALAT DAN BAHAN
A. Alat
1. Timbangan analitik
2. Labu ukur
3. Gelas ukur
4. Pipet tetes
5. Gelas beaker
6. Mikropipet
7. Tip mikropipet
8. Spet
9. Vial
10. HPLC

B. Bahan
1. Larutan metanol
2. Aquadest
3. Serbuk parasetamol
4. Serbuk kafein
5. Tablet bodrex
IV. CARA KERJA
a. Pembuatan Pelarut Metanol : Air

Pelarut metanol : air (90:10)

- Diambil 450 mL metanol dan 50 mL air


- Dimasukkan dalam labu ukur 500 mL
HASIL

b. Pembuatan larutan baku sampel


1) Larutan baku 100 ppm
Paracetamol
- Ditimbang 10 mg parasetamol
- Dilarutkan dengan 100 mL pelarut metanol : air
HASIL

Kafein

- Ditimbang 10 mg kafein
- Dilarutkan dengan 100 mL pelarut metanol : air

HASIL

2) Larutan baku campuran

Larutan baku PCT : Kafein (4 ppm: 5 ppm)

- Diambil 60 µL larutan baku parasetamol 100 ppm


- Diambil 75 µL larutan baku kafein 100 ppm
- Dimasukkan dalam vial 1,5 mL
- Di ad kan dengan pelarut metanol:air

HASIL

Larutan baku PCT : Kafein (6 ppm: 10 ppm)

- Diambil 90 µL larutan baku parasetamol 100 ppm


- Diambil 150 µL larutan baku kafein 100 ppm
- Dimasukkan dalam vial 1,5 mL
- Di ad kan dengan pelarut metanol:air

HASIL
Larutan baku PCT : Kafein (8 ppm: 15 ppm)

- Diambil 120 µL larutan baku parasetamol 100 ppm


- Diambil 225 µL larutan baku kafein 100 ppm
- Dimasukkan dalam vial 1,5 mL
- Di ad kan dengan pelarut metanol:air

HASIL

Larutan baku PCT : Kafein (10 ppm: 20 ppm)

- Diambil 150 µL larutan baku parasetamol 100 ppm


- Diambil 300 µL larutan baku kafein 100 ppm
- Dimasukkan dalam vial 1,5 mL
- Di ad kan dengan pelarut metanol:air

HASIL

Larutan baku PCT : Kafein (12 ppm: 25 ppm)

- Diambil 180 µL larutan baku parasetamol 100 ppm


- Diambil 375 µL larutan baku kafein 100 ppm
- Dimasukkan dalam vial 1,5 mL
- Di ad kan dengan pelarut metanol:air

HASIL

Larutan baku PCT : Kafein (14 ppm: 30 ppm)

- Diambil 210 µL larutan baku parasetamol 100 ppm


- Diambil 450 µL larutan baku kafein 100 ppm
- Dimasukkan dalam vial 1,5 mL
- Di ad kan dengan pelarut metanol:air

HASIL
c. Pembuatan Larutan Sampel

Satu Tablet Bodrex

- Ditimbang
- Digerus sampai halus
- Ditimbang 20 mg/25 mg/ 10 mg
- Dimasukkan dalam labu ukur dengan volume 25
mL/ 50 mL
- Di ad kan sampai batas dengan pelarut metanol:air
- Disaring dengan menggunakan syringe membrane
selulosa nitrate
- Diambil 50 µL/ 75 µL / 100 µL, dimasukkan
dalam vial, di ad kan sampai 1,5 mL dengan
pelarut metanol:air.
- Dianalisis dengan HPLC

HASIL
V. HASIL
a. Perhitungan Pembuatan Larutan baku
No Konsentrasi Perhitungan
1. (Parasetamol) 4 ppm 4 × 1,5 = X × 100
4 ×1,5
𝑋= 100

X = 0,06 mL × 1000
= 60 µL

(Kafein) 5 ppm 5 × 1,5 = X × 100


5 ×1,5
𝑋= 100

X = 0,075 mL × 1000
= 75 µL

Volume pelarut matanol:air = 1500 - (60 + 75)


= 1500 – 135
= 1365 mL

2. (Parasetamol) 6 ppm 6 × 1,5 = X × 100


6 ×1,5
𝑋= 100

X = 0,09 mL × 1000
= 90 µL

(Kafein) 10 ppm 10 × 1,5 = X × 100


10 ×1,5
𝑋= 100

X = 0,15 mL × 1000
= 150 µL

Volume pelarut matanol:air = 1500 - (90 + 150)


= 1500 – 240
= 1260 mL
3. (Parasetamol) 8 ppm 8 × 1,5 = X × 100
8 ×1,5
𝑋= 100

X = 0,12 mL × 1000
= 120 µL

(Kafein) 15 ppm 15 × 1,5 = X × 100


15 ×1,5
𝑋= 100

X = 0,225 mL × 1000
= 225 µL

Volume pelarut matanol:air = 1500 - (120 + 225)


= 1500 – 345
= 1155 mL

4. (Parasetamol) 10 ppm 10 × 1,5 = X × 100


10 ×1,5
𝑋= 100

X = 0,15 mL × 1000
= 150 µL

(Kafein) 20 ppm 20 × 1,5 = X × 100


20 ×1,5
𝑋= 100

X = 0,3 mL × 1000
= 300 µL

Volume pelarut matanol:air = 1500 - (150 + 300)


= 1500 – 450
= 1050 mL
5. (Parasetamol) 12 ppm 12 × 1,5 = X × 100
12 ×1,5
𝑋= 100

X = 0,18 mL × 1000
= 180 µL

(Kafein) 25 ppm 25 × 1,5 = X × 100


25 ×1,5
𝑋= 100

X = 0,375 mL × 1000
= 375 µL

Volume pelarut matanol:air = 1500 - (180 + 375)


= 1500 – 555
= 945 mL

6. (Parasetamol) 14 ppm 14 × 1,5 = X × 100


14 ×1,5
𝑋= 100

X = 0,21 mL × 1000
= 210 µL

(Kafein) 30 ppm 30 × 1,5 = X × 100


30 ×1,5
𝑋= 100

X = 0,45 mL × 1000
= 450 µL

Volume pelarut matanol:air = 1500 - (210 + 450)


= 1500 – 660
= 840 mL
b. Hasil Area Larutan Baku Parasetamol
Konsentrasi Area
4 ppm 535,25409
6 ppm 716,59131
8 ppm 946,19635
10 ppm 1272,78845
12 ppm 1731,20166
14 ppm 2050,13062

a 0,988948
b 156,3544
r 0,988948

c. Hasil Area Larutan Baku Kafein


Konsentrasi Area
5 ppm 335,26624
10 ppm 507,40317
15 ppm 572,0451
20 ppm 632,47296
25 ppm 875,70819
30 ppm 1150,57385

a 154,723488
b 29,95360554
r 0,964136839

d. Larutan Sampel
Parasetamol Area
50 𝜇𝐿 1168,07849
75 𝜇𝐿 1749,47058
100 𝜇𝐿 2093,36060

Kafein Area
50 𝜇𝐿 56,52762
75 𝜇𝐿 83,89502
100 𝜇𝐿 99, 95150

e. Perhitungan Kadar
PARACETAMOL
50 𝝁𝑳 75 𝝁𝑳
Area − a 1168,07849−0,988948 Area − a 1749,47058−0,988948
 =  =
b 156,3544 b 156,3544

= 7,464 ppm = 11,182 ppm


= 7,464 mg/mL = 11,182 mg/mL

 20 mg/ 25 mL = 0,05 mL/ 1,5 mL  20 mg/ 25 mL = 0,075 mL/ 1,5 mL


= 1,5 mL/ 0,05 mL = 1,5 mL/ 0,075 mL
= 30 mL = 20 mL

 7,464 mg/mL × 30 mL = 223, 92


 11,182 mg/mL × 20 mL = 223, 64
 223, 92 × 25 mL = 5598 µg
 223, 64 × 25 mL = 5591 µg
= 5,598 mg
= 5,591 mg
 Berat Tablet = 0,841 gram
 Berat Tablet = 0,841 gram
= 841 mg
= 841 mg
841 𝑚𝑔
= x 5,598 mg 841 mg
20 𝑚𝑔
= × 5,591 𝑚𝑔
20 mg
= 235, 3959 mg
= 235,10155 mg
235,3959 mg
 𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 % = × 100% 235,10155 mg
600 mg  𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 % = × 100%
600 mg
= 39,232 %
= 39,184 %
100 𝝁𝑳
Area − a 2093,36060−0,988948
 =
b 156,3544

= 13,382 ppm
= 13,382 mg/mL

 20 mg/ 25 mL = 0,1 mL/ 1,5 mL = 1,5mL/ 0,1 mL = 15 mL


 13,382 mg/mL × 15 mL = 200,73

 200,73 × 25 mL = 5018,25 µg
= 5,01825 mg

 Berat Tablet = 0,841 gram


= 841 mg
841 mg
= × 5,01825 𝑚𝑔
20 mg
= 211,017412
211,017 mg
 𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 % = × 100%
600 mg

= 35,17 %

KAFEIN
50 𝝁𝑳 75 𝝁𝑳
Area − a 56,52762−154,723488 Area – a 83,89502−154,723488
 =  =
b 29,95360554 b 29,95360554

= 3,278 ppm = 2,364 ppm


= 3,278 mg/mL = 2,364 mg/mL

 20 mg/ 25 ml = 0,05 ml/ 1,5 ml  20 mg/ 25 ml = 0,075 ml/ 1,5 ml


= 1,5 ml/ 0,05 ml = 1,5 ml/ 0,075 ml
= 30 mL = 20 mL

 3,278 mg/mL x 30 𝑚𝐿 = 98,34  2,364 mg/mL × 20 mL = 47,28

 98,34 𝑥 25 mL = 2458,5 µg
= 2,4585 mg  47,28 𝑥 25 𝑚𝐿 = 1182 µg

 Berat Tablet = 0,841 gram = 1,182 mg

= 841 mg  Berat Tablet = 0,841 gram


841 𝑚𝑔
 = x (2,4585) mg = 841 mg
20 𝑚𝑔
841 mg
= 17,103 mg = × (1,182) 𝑚𝑔
20 mg
17,103 𝑚𝑔
 Kadar % = x 100 %
50 𝑚𝑔 = 49,7031 mg

= 34,206 %  𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 % =
49,7031 𝑚𝑔
× 100%
50 𝑚𝑔

= 99,4062 %
100 𝝁𝑳
Area – a 99,95150−154,723488
 =
b 29,95360554

= 1,828 ppm
= 1,828 mg/mL

 20 mg/ 25 mL = 0,1 mL/ 1,5 mL


= 1,5 mL/ 0,1 mL
= 15 mL
 1,828 mg/mL 𝑥 15 = 27,42

 27,42 𝑥 25 = 685,5 μg = 0,6855 mg

 Berat Tablet = 0,841 gram


= 841 mg
841 mg
= × (0,6855 ) 𝑚𝑔
20 mg
= 28,825 mg
28,825 𝑚𝑔
 𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 % = × 100% = 57,65 %
50 𝑚𝑔
VI. PEMBAHASAN
Praktikum kali ini bertujuan untuk menentukan kadar parasetamol dan
kafein dalam sampel obat dengan instrumen HPLC (High Performance Liquid
Chromatography). Sampel obat yang digunakan adalah jenis obat sakit kepala
yaitu “Bodrex”. Prinsip dasar HPLC yaitu berdasarkan perbedaan distribusi
komponen-komponen dalam sampel di antara dua fase, fase gerak dan fase
diam. Fase gerak yang digunakan berupa campuran senyawa Metanol dan air
dengan perbandingan 90:10. Sedangkan fase diam yang digunakan adalah
kolom C-18 yang bersifat non polar. Oleh karena itu percobaan kali ini
menggunakan metode HPLC fase terbalik, karena fase gerak yang digunakan
bersifat polar sedangkan fase diamnya bersifat non polar, dengan sistem elusi
isokratik, artinya selama analisis digunakan fase gerak dengan perbandingan
pelarut yang tetap.
Langkah pertama yang dilakukan adalah membuat larutan induk
parasetamol dan kafein. Parasetamol dan kafein berupa serbuk berwarna putih
yang ditimbang masing-masing 10 mg. Untuk melarutkan parasetamol dan
kafein digunakan pelarut, pelarut yang digunakan adalah campuran dari
metanol dan air dengan perbandingan 90:10. Kandungan utama fase gerak
pada kromatografi fase terbalik adalah air. Kecenderungan air untuk
melarutkan sampel dapat diubah dengan menambahkan garam untuk
menimbulkan pengaruh penggaraman, asam, basa, dapar untuk melarutkan
atau mengendapkan asan atau basa, pereaksi pengompleks untuk
menimbulkan jenis pengaruh pelarutan yang khas untuk gugus fungsi tertentu
atau golongan senyawa tertentu, atau pelarut organik yang dapat bercampur
dengan air. Dalam fase gerak ini, metanol memiliki jumlah yang paling besar
karena didasarkan pada kelarutan paracetamol dan kafein yang besar pada
etanol. Pada praktikum ini tidak digunakan etanol namun metanol karena
metanol dapat melarutkan kedua komponen tersebut dan memiliki viskositas
yang lebih rendah daripada etanol sehingga dapat mengurangi tekanan pada
kolom dan meningkatkan efisiensi kolom untuk memisahkan komponen
campuran.
Pelarut yang digunakan dikombinasikan komposisinya bertujuan untuk
memberikan faktor kapasitas yang cocok sehingga faktor human error dapat
dihindarkan. Fase gerak yang digunakan sudah memenuhi persyaratan fasa
gerak HPLC yaitu: jernih, murah, mudah diperoleh, dan tidak kental. Proses
degassing dilakukan untuk menghomogenkan dan menghilangkan gelembung-
gelembung gas pada larutan induk. Karena dengan adanya gas dalam larutan
sampel dapat menghambat pergerakan eluen sehingga terganggunya
pemisahan pada kolom karena larutan sampel tidak merata dan akan
menyebabkan terjadinya pelebaran puncak kromatogram. Selain itu,
penghilangan gas ini juga diperlukan untuk menghindari noise pada detektor
terutama fase organik berair.
Langkah berikutnya yaitu pembuatan larutan baku dan standar. Larutan
baku paracetamol dan kafein dibuat dengan melarutkan 10 mg masing-masing
paracetamol dan kafein kemudian dilarutkan dalam 100 mL pelarut metanol-
air. Sehinggan diperoleh larutan baku paracetamol dan kafein 100 ppm.
Selanjutnya dilakukan pembuatan larutan standar campuran paracetamol-
kafein. Campuran paracetamol:kafein dibuat dengan berbagai perbandingan
yaitu 4:5, 6:10, 8:15, 10:20, 12:25 dan 14:30. Pembuatan larutan standar
tersebut dilakukan secara kuantitatif. Oleh karena itu, penimbangan larutan
baku parasetamol dan kafein harus tepat, pemipetan larutan induk harus tepat,
pengenceran larutan baku menjadi larutan standar harus pas sampai tanda
batas. Pembuatan masing – masing konsentrasi dan pelabelan harus dilakukan
secara teliti untuk mencegah terjadinya kekeliruan. Larutan standar
diinjeksikan secara berurutan dari konsentrasi terendah sampai konsentrasi
tertinggi.
Langkah selanjutnya dilakukan pembuatan larutan sampel. Dalam
membuat larutan sampel sampel obat ditimbang dalam 10 kali penimbangan
per tablet dan dihasilkan rata rata penimbangan tablet bodrex adalah 841 mg.
Hal ini dilakukan karena massa masing-masing tablet tidak sama, sehingga
digunakan massa rata-rata dari kesepuluh tablet. Selanjutnya tablet dihaluskan
dan ditimbang sebanyak 20 mg dilarutkan dengan pelarut metanol-air dalam
labu ukur 25 mL. Kemudian disaring menggunakan syringe membrane
selulosa nitrat. Untuk membebaskan larutan sampel dari kotoran partikulat
maka larutan standar tersebut disaring dengan Syringe membrane selulosa
nitrat. Digunakan membran selulosa nitrat untuk menyaring karena komponen
yang akan dipisahkan (parasetamol dan kafein) bersifat polar. Selanjutnya
diambil larutan sebanyak 50 µL, 75 µL, dan 100 µL ke dalam 3 vial dan
ditambahkan pelarut sampai 1,5 mL. Kemudian sampel dianalisis dengan
instrumen HPLC.
Instrumen HPLC diset sesuai dengan kebutuhan pengukuran yaitu
dengan panjang gelombang 257 nm, laju alir 1mL/menit. Sebelum digunakan,
syringe harus dibilas dengan mengunakan metanol agar terbebas dari kotoran.
Pada proses pemasukan cuplikan kedalam alat HPLC dilakukan dengan
menggunakan alat injeksi syiringe. Syringe disuntikan melaui septum (seal
karet), cuplikan yang masuk kemudian dialirkan oleh fasa gerak dengan
bantuan pompa. Dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen
campuran. Dalam praktikum ini, fase diam bersifat non polar, sedangkan fase
geraknya bersifat polar. Karena hal itu, maka senyawa yang cenderung non
polar akan lebih lama keluar dari kolom atau memiliki waktu retensi yang
lebih besar. Interaksi senyawa dengan fase diam terjadi pada bagian senyawa
yang non polar. Kafein memiliki lebih banyak gugus non polar dibandingkan
dengan paracetamol. Hal ini lah yang menyebabkan kafein akan lebih tertahan
pada fase diam. Sehingga setelah keluar kolom akan dideteksi oleh detector
yang kemudian direkam dalam bentuk kromatogram yang menghasilkan
puncak.
Kolom yang digunakan dalam percobaan ini adalah kolom yang berisi
fasa diam C-18 denagna panjang 15 cm yang bersifat nonpolar dan
merupakan hasil reaksi antara silika dengan alkilklorosilana dimana gugus
alkilnya (R) adalah n-oktadesil. Fasa diam tersebut terikat pada fasa
pendukung yaitu silika. Dalam hal ini, fasa diam lebih nonpolar dari fasa
geraknya sehingga mode yang digunakan adalah mode fasa terbalik. HPLC
fasa terbalik ini baik untuk memisahkan campuran komponen-komponen yang
bersifat polar seperti parasetamol dan kafein. Fasa diam yang digunakan
dalam HPLC harus tahan terhadap tekanan tinggi, karena apabila digunakan
struktur dengan pori yang besar akan mudah rusak. Hal ini disebabkan
menurunnya permeabilitas akibat tekanan tinggi. Sementara proses elusi yang
digunakan adalah isokratik. Mode isokratik dilakukan pada temperature tetap
dan komposisi fasa geraknya sama selama pengukuran berlangsung yaitu pada
suhu 27 C dan laju alirnya 1 mL/menit.
Dalam pengelusian, parasetamol terelusi lebih awal dengan waktu
retensi lebihh pendek yaitu 3,080 menit dibbandingkan kafein yaitu 3,355
menit. Kepolaran dapat dilihat dari struktur senyawanya dimana parasetamol
hanya memilki satu ikatan CH3 sementara kafein 3 ikatan CH3. Oleh
karenanya, senyawa-senyawa kafein akan menghabiskan dalam kolom lebih
lama dan mempunyai waktu retensi yang besar. Sementara, molekul
parasetamol dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak
bersama dengan pelarut sehingga akan keluar terlebih dahulu dan mempunyai
waktu retensi yang kecil.
Analisis kuantitatif dari pengukuran diperoleh dari luas area peak
dalam kromatogram yang memiliki waktu retensi sama. Pengukuran larutan
standar dengan meningkatnya konsentrasi diperoleh luas area yang meningkat
pula. Pada analisis kuantitatif, dilakukan perhitungan kadar paracetamol dan
kafein dalam sampel berdasarkan luas area puncak menggunakan metode
kurva kalibrasi larutan derat standar yang dibuat. Kadar analit dapat
ditentukan dengan menghitung konsentrasi analit menggunakan persamaan
garis y = mx + b yang diperoleh dari kurva kalibrasi deret standar. Namun,
apabila luas area puncak analit tidak masuk dalam area deret standar maka
digunakan perbandingan konsentrasi dan luas area deret standar dengan
sampel. Dari semua larutan standar yang diukur diperoleh persamaan regresi
dengan nilai korelasi R pada paracetamol sebesar 0,988948 dan nilai R pada
kafein sebesar 0,964136839. Paracetamol memiliki nilai korelasi R yang baik
dibandingkan kafein karena nilai R mendekati 1.
Perhitungan kadar paracetamol dan kafein dalam campuran
paracetamol-kafein dibuat dalam 3 konsentrasi yaitu 50 µL, 75 µL, dan 100
µL. Area yang diperoleh sampel paracetamol dalam 3 konsentrasi berturut-
turut sebesar 1168,07849 ; 1749,47058 ; 2093,36060. Sedangkan area yang
diperoleh kafein yaitu 56,52762 ; 83,89502 ; 99, 95150. Jadi dapat dikatakan
semakin besar konsentrasi sampel maka AUC atau area yang diperoleh akan
semakin besar. Kadar paracetamol yang diperoleh dari masing-masing
konsentrasi sebesar 39,232 % ; 39,184 % ; 35,17 %. Kemudian kadar kafein
yang diperoleh dari 3 konsentrasi sebesar 34,206 % ; 99,4062 % ; 57,65 %.
Farmakope Indonesia Edisi V (2015) dimana kadar kafein tidak kurang dari
98,5% dan tidak lebih dari 101,0% sedangkan kadar paracetamol tidak kurang
dari 98% dan tidak lebih dari 101,0%. Hasil praktikum yang memenuhi
standar Farmakope Indonesia Edisi V terdapat pada kafein dengan konsentrasi
75 µL.
Kesalahan-kesalahan yang mungkin terjadi selama analisis pada
percobaan ini di antaranya, masih terdapat sisa sampel yang telah ditimbang
yang tidak ikut dilarutkan sehingga kadar yang diperoleh kurang akurat, masih
terdapat gelembung setelah dilakukan penginjeksian, atau pengoperasian
instrument yang kurang tepat sehingga mempengaruhi hasil kromatogram
yang didapat.
VII. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil praktikum diperoleh kesimpulan sebagai berikut:
1. Perhitungan kadar paracetamol dan kafein dalam campuran paracetamol-
kafein dibuat dalam 3 konsentrasi yaitu 50 µL, 75 µL, dan 100 µL.
2. Kadar paracetamol yang diperoleh dari masing-masing konsentrasi sebesar
39,232 % ; 39,184 % ; 35,17 %.
3. Kadar kafein yang diperoleh dari 3 konsentrasi sebesar 34,206 % ;
99,4062 % ; 57,65 %.
4. Hasil praktikum yang memenuhi standar Farmakope Indonesia Edisi V
terdapat pada kafein dengan konsentrasi 75 µL.
DAFTAR PUSTAKA
Al Anshori, J. 2007. Diktat Pelatihan HPLC. Sfat Laboratorium Kimia Bahan
Alam dan Lingkungan Jurusan Kimia FMIPA Universitas Padjadjaran.
Bandung.

Budhiraja, R. P., 2004, Separation Chemistry, 82, New Age International (P) Ltd.
Publishers, New Delhi.

Budiasih, Endang, dkk. 1999. Analisis Instrumentasi. Malang: Universitas Negeri


Malang.

Damin Sumardjo. 2009. Pengantar Kimia: Buku Panduan Kuliah Mahasiswa


Kedokteran dan Program Strata I Fakultas Bioeksakta. Jakarta: EGC.

Ellis, Frank. dkk. 2002. Paracetamol: A Curriculum Resource Paperback. London:


Royal Society of Chemistry.

Gandjar, I.G., dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, cetakan II,
Yogyakarta Pustaka Pelajar.

Johnson, E.L., dan Stevenson, R., 1991, Dasar Kromatografi Cair Kinerja Tinggi,
Penerbit ITB Bandung.

Munson, J.W., 1991, Analisis Farmasi Metode Modern, Airlangga University


Press Surabaya.

Putra, Effendy De Lux. (2004). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang
Farmasi, 8.
Sudjadi dan Rahman, A. 1994. Analisis Obat dan Makanan. Yogyakarta: Pustaka
Pelajar.

Tim Dosen Kimia Analitik. 2013. Penuntun Kimia Analitik. Makassar: UNM.

Tim Dosen Praktikum Pemisahan dan Pengukuran. 2015. Instruksi Kerja


Penentuan Kadar Parasetamol dan Kafein dengan Teknik HPLC.
Bandung: UPI.
LAMPIRAN
1. Hasil kromatogram larutan standar
a) Paracetamol : Kafein (4:5)
b) Paracetamol : Kafein (6:10)
c) Paracetamol : Kafein (8:15)
d) Paracetamol : Kafein (10:20)
e) Paracetamol : Kafein (12:25)
f) Paracetamol : Kafein (14:30)
2. Hasil Kromatogram Sampel
a) Sampel 50 𝝁L
b) Sampel 75 𝝁L
c) Sampel 100 𝝁L
Alat yang dibutuhkan selama praktikum Pelarut/ Fasa Gerak

Pelarut/ Aquabides Instrumen HPLC

Instrumen HPLC tampak samping Penimbangan Sampel untuk


membuat larutan Induk dan
Larutan sampel
Sampel Obat Bodrex Data pnimbangan 10 tablet obat bodrex

Penambahan pelarut (aquadest Hasil pembuatan deret larutan


/fase gerak) untuk membuat standar
larutan induk, larutan sampel

Hasil penambahan pelarut


Proses Sonifikasi pada Ultrasonic Vibrator
(aquabides) pada sampel obat,
hingga setengah volume
ukuran labu ukur
Larutan Sampel Obat Penyaringan Sampel Obat
menggunakan kertas saring

Hasil Penyaringan Penyaringan kedua


menggunakan kertas menggunakan membran
saring selulosa nitrat

Hasil penyaringan menggunakan Penginkjeksian Deret larutan


membran selusosa nitrat standar/ Larutan sampel
Deret Larutan Standar/ Larutan
Proses Penginjeksian
sampel siap diinjeksikan, sudah tidak
terdapat gelembung dalam syringe.

Hasil Pemisahan ditunjukan


dalam bentuk kromatogram
dalam komputer