i

ISOLASI DAN PENENTUAN AKTIVITAS ENZIM PROTEASE

DARI PANKREAS ATAU USUS HALUS IKAN NILA (Oreochromis
Niloticus)

LAPORAN

DISUSUN OLEH :

NADYA AULIA RIZKI 140210150013

SANDRA SAFIRA 140210150027
AYU NADILA SAFITRI 140210150033
GENTA AKBAR PRAMANA 140210150057
INTALIALLITA 140210150067
SYLVIA RATNASARI S 140210150085

UNIVERSITAS PADJADJARAN
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN
ALAM
DEPARTEMEN KIMIA
PROGRAM STUDI SARJANA KIMIA
JATINANGOR
2017
 i

ABSTRAK

Enzim protease berfungsi untuk memutuskan ikatan peptida pada protein. Penelitian

ini bertujuan untuk mengisolasi enzim proteolitik dari pankreas atau usus halus ikan

nila dengan sentrifugasi, menentukan aktivitas enzim proteoase dari pankreas atau usus

halus ikan nila, menentukan kadar protein dari pancreas atau usus halus ikan nila

dengan metode Lowry, dan memurnikan enzim protease dari pankreas atau usus halus

ikan nila dengan kromatografi pertukaran ion. Metode yang digunakan dalam

percobaan ini antara lain adalah, isolasi enzim protease dari usus halus ikan nila

(Oreochromis Niloticus) dengan cara sentrifugasi, pemisahan enzim protease dengan

metode sentrifugasi dan fraksionasi dan pemurnian enzim protease menggunakan

kromatografi pertukaran ion, dilanjutkan dengan penentuan aktivitas enzim protease,

dan pembuatan kurva baku standar protein serta penentuan kadar protein dengan

metode Lowry. Hasil dari percobaan ini adalah enzim protease dari usus halus ikan nila

dapat diisolasi, aktivitas enzim protease dari usus halus ikan nila dapat ditentukan dan

kadar protein dari usus halus ikan nila dengan metode Lowry, yaitu sebesar 1.2936

mg/ml pada ekstrak kasar, - mg/ml pada hasil pengendapan, dan hasil kromatografi

pada fraksi 5: 0.62427 mg/mL, fraksi 6: 1.21614 mg/mL, fraksi 7: 1.31654 mg/mL,

fraksi 7: 1.31654 mg/mL, fraksi 8: 0.55029 mg/mL, dan fraksi 12: 0.40761 mg/mL .

Kata kunci : Enzim Protease, Metode lowry, Oreochromis Niloticus

i
 ii

ABSTRACT

The function of enzyme protease is to break peptide bonds in proteins. This

research aims to isolate the protease enzymes from the intestine of parrot fish

with centrifugation, determines the activity of protease, determining the levels

of protein with the method of Lowry, and purify the protease enzymes with ion

exchange chromatography. The methods used in this experiment, among others, is the

isolation of protease enzyme from intestine parrot fish (Oreochromis Niloticus) by

using centrifugation, separation of the protease enzyme with centrifugation method and

purification of the protease enzyme using ion exchange chromatography, followed

by determination of the activity of the enzyme protease, and the manufacture

of raw protein standard curves as well as the determination of protein by the method

of Lowry. The result of this experiment is the enzyme protease can

be isolated, protease enzyme activity can be determined, and levels of protein

delicate method of Lowry, that of 1.2936 mg/ml on the extract of crude, - mg/ml on the

results of the deposition, and fraction 5: 0.62427 mg/mL, fraction 6: 1.21614 mg/mL,

fraction 7: 1.31654 mg/mL, fraction 8: 0.55029 mg/mL, and fraction 12: 0.40761

mg/mL on the results of fraction of chromatography.

Keywords : Protease enzyme, Lowry Method, Oreochromis Niloticus

 iii

KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah memberikan banyak

nikmat, taufik dan hidayahnya sehingga kami dapat menyusun laporan praktikum

biokimia yang berjudul “Isolasi dan Penentuan Aktivitas Enzim Proteolitik dari

Pankreas atau Usus Halus Ikan Nila” dengan baik. Laporan praktikum ini telah kami

susun semaksimal mungkin dan mendapatkan bantuan dari berbagai pihak sehingga

dapat memperlancar pembuatan laporan praktikum ini. Untuk itu kami mengucapkan

terima kasih kepada semua pihak yang telah berkontribusi dalam pembuatan laporan

praktikum ini. Dalam penyusunan laporan ini, kami menyadari bahwa hasil laporan

praktikum ini masih jauh dari kata sempurna baik dari segi susunan kalimat maupun

tata bahasanya. Oleh karena itu, kami selaku peyusun mengharapkan kritik dan saran

yang membangun dari pembaca sekalian. Akhir kata semoga laporan praktikum ini

dapat memberikan manfaat untuk kelompok kami khususnya dan masyarakat umum.

Jatinangor, 28 November 2017

Penyusun
 iv

DAFTAR ISI

ABSTRAK ................................................................................................................................ i

ABSTRACT ............................................................................................................................. ii

KATA PENGANTAR .............................................................................................................iii

DAFTAR ISI............................................................................................................................iv

DAFTAR GAMBAR .............................................................................................................. vii

BAB I PENDAHULUAN ........................................................................................................ 1

1.1 Latar Belakang .............................................................................................................. 1

1.2 Identifikasi Masalah ..................................................................................................... 2

1.3 Maksud dan Tujuan ..................................................................................................... 2

1.4 Manfaat Penelitian ........................................................................................................ 3

1.5 Metodologi ..................................................................................................................... 3

1.6 Waktu dan Tempat ....................................................................................................... 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA............................................................................................. 5

2.1 Enzim Secara Umum .................................................................................................... 5

2.2 Enzim Protease .............................................................................................................. 8

2.3 Taksonomi Ikan Nila Merah ........................................................................................ 9

 v

2.3.1 Klasifikasi Ikan Nila Merah .................................................................................. 9

2.3.2 Morfologi Ikan Nila Merah ................................................................................. 11

2.4 Kromatografi ............................................................................................................... 12

2.5 Metode Lowry ............................................................................................................. 14

2.6 Sentrifugasi .................................................................................................................. 15

BAB III ALAT BAHAN DAN METODE ........................................................................... 16

3.1 Alat ............................................................................................................................... 16

3.2 Bahan ........................................................................................................................... 18

3.2.1 Bahan Penelitian .................................................................................................. 18

3.2.2 Bahan-bahan Kimia ............................................................................................. 18

3.3 Metode.......................................................................................................................... 18

3.3.1 Isolasi Enzim Protease dengan Fraksionasi ....................................................... 18

3.3.2 Pemurnian Protein dengan Kromatografi Pertukaran Ion ............................. 19

3.3.3 Penentuan Aktivitas Enzim Protease ................................................................. 20

3.3.4 Penentuan Kadar Protein dengan Metode Lowry ................................................ 20

3.3.4.1 Pembuatan Kurva Baku Standar Protein................................................... 20

3.3.4.2 Penentuan Kadar Protein dari Sampel ....................................................... 21

3.3.5 Diagram Alir Penelitian....................................................................................... 22

 vi

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................................................. 24

4.1 Hasil Pengamatan ....................................................................................................... 24

4.1.1 Pengendapan Protein dengan Aseton ................................................................. 24

4.1.2 Pemurnian Protein menggunakan Kromatografi Penukar Ion ....................... 26

4.1.3 Penentuan Aktivitas Enzim Protease ................................................................. 29

4.1.4 Pembuatan Kurva Standar Protein.................................................................... 31

4.1.5 Penentuan Kadar Protein.................................................................................... 32

4.2 Grafik ........................................................................................................................... 34

4.3 Perhitungan ................................................................................................................. 37

4.4 Pembahasan ................................................................................................................. 50

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................................ 63

5.1 Kesimpulan .................................................................................................................. 63

5.2 Saran ............................................................................................................................ 64

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................................ 65

LAMPIRAN........................................................................................................................... 68
 vii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.3.1. 1 Ikan Nila ....................................................................................................... 10

Gambar 2.4. 1 Mekanisme kromatografi penukar ion (1) media kromatografi sebagai fase

diam, mengandung resin bermuatan (+) di dalam kolom dialiri buffer, (2) larutan molekul

yang bermuatan (+), (-), dan tidak bermuatan dialiri ke media, (3) molekul yang bermuatan

berlawanan berikatan dengan resin, (4) dielusi dengan buffer, atau larutan yang mempunyai

kekuatan ionik tertentu (fase bergerak), (5) buffer akan mengganti sampel yang bermuatan

untuk berikatan dengan media (fase diam). .......................................................................... 13

Gambar 3.1. 1 Spektrofotometer UV ...................................................................................... 16

Gambar 3.1. 2 Sentrifugator.................................................................................................... 17

Gambar 3.1. 3 Inkubator ......................................................................................................... 17

Gambar 3.3.5. 1 Diagram Alir Penelitian ............................................................................... 22

Gambar 3.3.5. 2 Diagram Alir: Penentuan Aktivitas Enzim (kiri) dan Penentuan Kadar Protein

(kanan) ......................... 23

Gambar 4.2. 1 Grafik Absorbansi terhadap fraksi .................................................................. 34

 viii

Gambar 4.2. 2 Grafik Absorbansi terhadap Fraksi pada Penentuan Aktivitas Enzim ............ 35

Gambar 4.2. 3 Grafik Kurva Baku Protein ............................................................................. 35

Gambar 4.2. 4 Grafik Absorbansi terhadap Fraksi Sampel pada Penentuan Kadar Protein

menggunakan Metode Lowry ................................................................................................. 36

 ix

DAFTAR TABEL

Tabel 4.1. 1 Data Absorbansi tiap fraksi λ=280nm ................................................................ 27

Tabel 4.1. 2 Data Absorbansi Uji Aktivitas λ=280 nm ........................................................... 30

Tabel 4.1. 3 Data Absorbansi Standar Protein λ=750 nm ....................................................... 32

Tabel 4.1. 4 Data Absorbansi Kadar Protein Sampel λ=750 nm ............................................ 33

 1

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Ikan nila (Oreochromis niloticus) merupakan salah satu ikan yang

dibutuhkan dalam kehidupan sehari-hari sebagai makanan. Pada usus halus ikan

nila terdapat enzim protease yang dapat memecah protein. Protease adalah

anggota dari kelompok yang sangat besar enzim yang memiliki berbagai fungsi

dalam tubuh. Yang utama adalah sebagai enzim pencernaan untuk memproses

protein. Tanpa protease, tubuh tidak akan mampu mencerna protein dalam

makanan. Jenis lain dari proteolik yang terlibat dalam regulasi peristiwa selular,

seperti pembekuan darah. Ini juga disebut enzim proteolitik atau proteinase.

Protease adalah jenis protein yang mempercepat degradasi lain. Mereka

berbeda dalam cara di mana mereka melaksanakan kegiatan ini. Exopeptidases

memecah lepas terminal asam amino dan menjepit menggerogoti protein.

Mereka memecah ikatan peptida untuk melepaskan asam amino. Sebaliknya,

endopeptidases bertindak dalam protein, dan juga membelah ikatan peptida,

memproduksi polipeptida sebagai hasil dari kegiatan mereka.

1
 2

1.2 Identifikasi Masalah

 Bagaimana mengisolasi enzim protease dari usus halus ikan nila (Oreochromis

niloticus)?

 Bagaimana memurnikan enzim protease ?

 Bagaimana dapat menentukan kadar protein usus halus ikan nila (Oreochromis

niloticus) dengan metode Lowry?

 Bagaimana mengetahui aktivitas enzim yang diisolasi dari usus halus ikan nila

(Oreochromis niloticus)?

1.3 Maksud dan Tujuan

Percobaan ini dimaksudkan untuk memperoleh informasi dan data yang

objektif yang berkaitan dengan isolasi, kemurnian, uji aktivitas enzim protease

dan penentuan kadar protein dari ikan nila dimana enzim protease ini dapat

digunakan dalam bidang industri terutama pada industri makanan. Tujuan dari

praktikum ini adalah :

 Mengisolasi enzim protease dari usus halus nila (Oreochromis

niloticus) dengan metode sentrifugasi.

 Memurnikan enzim protease dari usus halus ikan nila (Oreochromis

niloticus) dengan metode kromatografi penukar ion.

2
 3

 Menentukan kadar protein dari usus halus ikan nila (Oreochromis

niloticus) dengan metode Lowry.

 Menguji aktivitas protease dengan substrat N,N-dimetilkasein dari usus

halus ikan nila (Oreochromis niloticus).

1.4 Manfaat Penelitian

Enzim protease yang merupakan enzim yang memecah ikatan peptida

protein. Sehingga dapat digunakan dalam industri makanan, misalnya

pengolahan daging.

1.5 Metodologi

Langkah-langkah yang dilakukan dalam eksperimen yaitu:

 Ekstraksi enzim protease

 Pemurnian protein dengan kromatogafi pertukaran ion

 Penentuan aktivitas enzim protease

 Pembuatan kurva baku standar protein

 Penentuan kadar protein

 4

1.6 Waktu dan Tempat

Waktu : Kamis, 16 November 2017 dan 23 November 2017

Tempat : Laboratorium Biokimia, jurusan kimia

FMIPA Unpad. Jatinangor.

 BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Enzim Secara Umum

Enzim adalah katalis untuk reaksi-reaksi dalam sistem biologi (biokatalisator),

semua enzim adalah protein, kecuali ada sekelompok kecil molekul RNA yang juga

berperan sebagai enzim (riboenzim). Enzim utuh (holoenzim), terdiri atas (Lehninger,

1982) :

a. Bagian protein (apoenzim)

b. Bagian non-Protein (kofator-kofaktor ion anorganik, seperti Fe2+, Mg 2+

, Mn2+,

Zn2+, dan in-anorganik kompleks)

c. Koenzim tidak terikat kuat pada apoenzim, seperti NADH

d. Gugus prostetik terikat kuat dalam apoenzim seperti NADH, misalnya FADH2

Enzim adalah protein globular yang umumnya berfungsi sebagai biokatalis pada

semua proses kimia dalam makhluk hidup, sehingga disebut life is enzyme. Enzim

mampu meningkatkan reaksi kimia tetapi tidak diubah oleh reaksi yang dikatalisnya

serta tidak mengubah kedudukan normal dari kesetimbangan kimia. Enzim mempunyai

daya katalisis spesifik yang lebih besar dari katalisator lainnya (Toha, 2005).

Beberapa enzim seperti tripsin, pepsin, dan ribonuklease merupakan protein

sederhana yang hanya terdiri dari rantai asam amino. Enzim lain mengandung

5
 6

komponen non-protein yang penting untuk fungsi khusus dari enzim yang dikenal

sebagai kofaktor yang terbagi menjadi (Mckee & Mckee, 1999) :

a. Gugus prostetik merupakan komponen yang terikat pada enzim dan tidak mudah

lepas dari enzim, con tohnya FAD

b. Ion anorganik merupakan ion-ion logam yang terikat satu mudah dilepas dari

enzim, contohnya Fe2+, Mg 2+, Mn2+, Zn2+

c. Koenzim merupakn molekul organik kecil yang mudah terdisosiasi dan dapat

dipisahkan dari enzimnya, contohnya ATP, NADH, dan Koenzim A.

Sebagai katalis, enzim sangat luar biasa (Nelson & Michael, 2008) :

a. Mempunyai daya katalitik yang sangat baik; jauh.

b. Lebih baik dari katalis anorganik atau sintetik (kecepatan reaksi dapat meningkat

sampai sejuta kali).

c. Mempunyai spesifisitas tinggi terhadap substrat dan reaksi.

d. Dapat berfungsi baik dalam larutan pada pH dan suhu sedang (mild condition).

e. Hasil samping jarang terbentuk.

f. Karena strukturnya yang kompleks, enzim dapat diregulasi.

 7

Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim, diantaranya (Lehninger,

1982) :

1. Pengaruh pH

a. Enzim mempunyai pH optimum (rentang pH) dimana enzim mempunyai

aktivitas maksimal; di atas atau di bawah pH optimum aktivitas enzim

berkurang.

b. Konsentrasi ion hidrogen (pH) dapat mempengaruhi enzim dalam beberapa

cara:

- Perubahan pH dapat mempengaruhi ionisasi pada sisi aktif enzim.

- Perubahan pH dapat mempengaruhi struktur tersier dari apoenzim;

- Perubahan pH yang drastis dapat menyebabkan denaturasi protein.

2. Pengaruh suhu

a. Semua reaksi kimia dipengaruhi suhu; makin tinggi suhu makin tinggi

kecepatan reaksi.

b. Pada reaksi enzimatik, suhu tinggi dapat menyebakan denaturasi enzim;

aktivitas enzim akan berkurang. Suhu dimana enzim mempunyai aktivitas

maksimal dinamakan suhu optimum.

3. Pengaruh inhibitor

a. Inhibitor enzim : senyawa yang bersifat menghambat katalisis; memperlambat

atau menahan reaksi enzimatik.

 8

b. Inhibisi aktivitas enzim dapat bersifat irreversibel (biasanya terikat secara

kovalen pada enzim) atau reversibel (dapat terdisosiasi dari enzim).

c. Inhibitor reversibel yang umum adalah inhibitor kompetitif dan inhibitor

nonkompetitif.

2.2 Enzim Protease

Enzim protease merupakan biokatalisator untuk reaksi pemecahan protein.

Enzim ini akan mengkatalisis reaksi hidrolisis, yaitu reaksi yang melibatkan unsur air

pada ikatan spesifik substrat. Karena itu, enzim ini termasuk dalam kelas utama enzim

golongan hidrolase (Winarno, 1983).

Protease ialah enzim yang sangat kompleks, mempunyai sifat fisiko kimia dan

sifat katalitik yang sangat bervariasi. Prote-ase dapat dihasilkan secara ekstraseluler

dan intraseluler dan mempunyai peranan penting dalam metabolisme sel dan

keteraturan proses dalam sel (Ward, 1983).

Protease merupakan enzim yang sangat penting dalam industri pangan maupun

non pangan. Pemanfaatan protease dalam industri pangan diantaranya adalah untuk

mengurangi kekeruhan dalam industri bir, mengurangi gluten pada industri roti, dan

untuk menggumpalkan susu pada industri keju. Enzim protease dapat diperoleh dari

jaringan tanaman, hewan, maupun mikroba. Keterbatasan kemampuan hewan dan

 9

tumbuhan dalam memenuhi permintaan protease, telah mendorong berkembangnya

protease mikroba (Hame & Hooper, 2000).

Fungsi fisiologis protease diperlukan untuk semua organisme hidup, dari virus

ke manusia, dan enzim proteolitik dapat diklasifikasikan berdasarkan asalnya: mikroba

(bakteri, jamur dan virus), tanaman, hewan dan manusia enzim dapat dibedakan

(Motyan et al., 2013).

Protease merupakan kelompok enzim yang banyak digunakan dalam bidang

industri. Protease berfungsi menghidrolisis ikatan peptida pada pada protein menjadi

oligopeptida dan asam amino. Protease dibagi menjadi empat bagian, yaitu (Boyer,

2000) :

a. Protease Serin

b. Protease Tiol

c. Protease Aspartat

d. Protease Logam

2.3 Taksonomi Ikan Nila Merah

2.3.1 Klasifikasi Ikan Nila Merah

Klasifikasi ikan nila merah menurut Suyanto (2005) adalah sebagai

berikut:
 10

Gambar 2.3.1. 1 Ikan Nila

Filum : Chordata

Sub filum : Vertebrata

Kelas : Pisces

Sub kelas : Achanthoptherigii

Ordo : Perchomorphi

Sub ordo : Perchoidea

Family : Cichlidae

Genus : Oreochromis

Species : Oreochromissp.
 11

Ikan nila merah (Oreochromis sp.) merupakan ikan hasil persilangan dari

beberapa strain/ varietas Oreochromis.Asal mula munculnya ikan nila menurut

Watanabe dkk. (1997) adalah di Amerika Serikat pada tahun 1970. Ikan nila merah asal

florida (red tilapia florida) tersebut merupakan spesies mutan dengan kelebihan

pigmen merah kekuningan yang diperoleh dari persilangan inbreeding spesies

Oreochromis mossambicus (berwarna hitam). Untuk menciptakan spesies ikan nila

berwarna merah yang lebih berkualitas, hasil spesies mutan yang berwarna merah

kekuningan disilangkan dengan Oreochromis hornorum (berwarna hitam).

2.3.2 Morfologi Ikan Nila Merah

Berdasarkan morfologinya, kelompok ikan Oreochromis berbeda

dengan kelompok Tilapia. Secara umum, bentuk tubuh ikan nila panjang dan ramping,

dengan sisik berukuran besar. Matanya besar, mononjol dan bagian tepinya berwarna

putih. Gurat sisi (Linea literalis) terputus di bagian tengah badan kemudian berlanjut,

tetapi letaknya lebih ke bawah daripada letak garis yang memanjang di atas sirip dada.

Jumlah sisik pada gurat sisi jumlahnya 34 buah. Sirip punggung, sirip perut, dan sirip

dubur mempunyai jari-jari lemah namun keras dan tajam seperti duri. Sirip

punggungnya berwarna hitam dan sirip dadanya juga tampak hitam. Bagian pinggir

sirip punggung berwarna abu-abu atau hitam (Suyatno, 2005).

 12

Ikan nila memiliki lima buah sirip, yakni sirip punggung (Dorsal fin), sirip dada

(Pectoral fin), sirip perut (Venteral fin), sirip anus (Anal fin) dan sirip ekor (Caudal

fin). Sirip punggungnya memanjang, dari bagian atas tutup insang hingga bagian atas

sirip ekor. Ada sepasang sirip dada dan sirip perut yang berukuran kecil. Sirip anus

hanya satu buah dan berbentuk agak panjang. Sementara itu, sirip ekornya berbentuk

bulat dan hanya berjumlah satu buah (Khairuman dan Amri, 2007).

Ciri-ciri ikan nila jantan adalah warna badan lebih gelap dari ikan betina, alat

kelamin berupa tonjolan (papila) di belakang lubang anus, dan tulang rahang melebar

ke belakang. Sedangkan tanda-tanda ikan nila betina adalah alat kelamin berupa

tonjolan di belakang anus, dimana terdapat 2 lubang. Lubang yang di depan untuk

mengeluarkan telur, sedang yang di belakang untuk mengeluarkan air seni dan bila

telah mengandung telur masak perutnya tampak membesar (Suyanto, 2005).

2.4 Kromatografi

Proses pemurnian enzim dapat dilakukan menggunakan metode

kromatografi dan elektroforesis. Kromatografi didefinisikan sebagai sistem

pengaliran suatu fluida melalui kolom yang mengandung matriks bahan pengisi dan

substanta yang ingin dipisahkan menjadi beberapa komponen dengan adanya

perbedaan daya ikat terhadap bahan pengisi. Harris dan Angel membagi metode

kromatografi menjadi empat kelompok, yaitu:

a. kromatografi adsorbsi yang bekerja berdasarkan perbedaan polaritas

 13

komponen sampel;

b. kromatografi penukar ion untuk melakukan pemisahan berdasarkan perbedaan

jenis muatan adsorben dan komponen sampel;

c. kromatografi filtrasi gel yang memisahkan molekul berdasarkan ukurannya;

d. kromatografi afinitas yang memisahkan komponen sampel berdasarkan

interaksi biokimia antara sampel dengan ligan yang terlibat pada matriks

adsorban.

Mekanisme kromatografi penukar ion disajikan pada Gambar dibawah (Boyer,1993) :

Gambar 2.4. 1 Mekanisme kromatografi penukar ion (1) media kromatografi sebagai

fase diam, mengandung resin bermuatan (+) di dalam kolom dialiri buffer, (2)

larutan molekul yang bermuatan (+), (-), dan tidak bermuatan dialiri ke media,

(3) molekul yang bermuatan berlawanan berikatan dengan resin, (4) dielusi dengan

buffer, atau larutan yang mempunyai kekuatan ionik tertentu (fase bergerak), (5)
 14

buffer akan mengganti sampel yang bermuatan untuk berikatan dengan media (fase

diam).

Karboksimetil selulosa (CMC) merupakan merupakan eter polimer selulosa

linear dan berupa senyawa anion, yang bersifat biodegradable, tidak berwarna, tidak

berbau, tidak beracun, butiran atau bubuk yang larut dalam air namun tidak larut dalam

larutan organik, memiliki rentang pH sebesar 6.5 sampai 8.0, stabil pada rentang pH 2

– 10, bereaksi dengan garam logam berat membentuk film yang tidak larut dalam air,

transparan, serta tidak bereaksi dengan senyawa organik. Karboksimetil selulosa

berasal dari selulosa kayu dan kapas yang diperoleh dari reaksi antara selulosa dengan

asam monokloroasetat, dengan katalis berupa senyawa alkali. Karboksimetil selulosa

juga merupakan senyawa serbaguna yang memiliki sifat penting seperti kelarutan,

reologi, dan adsorpsi di permukaan. Selain sifat-sifat itu, viskositas dan derajat

substitusi merupakan dua faktor terpenting dari karboksimetil selulosa. (Boyer, 1993).

2.5 Metode Lowry

Metode Lowry penentuan total protein adalah salah satu tes kolorimetri yang

paling umum dilakukan oleh ahli biokimia. Prosedur ini terletak pada reaktivitas dari

ikatan peptida dengan Cu2+ pada kondisi basa dan reduksi berikutnya dari Folin

Ciocalteu- asam fosfomolibdat fosfotungstat untuk oksidasi asam aromatik. Metode

Lowry sensitif terhadap konsentrasi rendah protein. Kerugian utama dari metode

Lowry adalah rentang pH yang sempit di mana itu akurat. Namun, dalam percobaan ini
 15

volume yang sangat kecil dari sampel yang digunakan yang memiliki sedikit atau tidak

berpengaruh pada pH campuran reaksi. Berbagai senyawa (beberapa turunan asam

amino, buffer zwiterionik dan nonionik, obat, lipid, gula, garam, asam nukleat, reagen

sulfhidril, ion amonium dan senyawa tiol) dapat mengganggu prosedur Lowry (Pavel

et al., 2013).

2.6 Sentrifugasi

Sentrifugasi digunakan untuk preprasi contoh biologis dan pengukuran analitik

sifat-sifat hidrodinamik makromolekul yang telah dimurniakan atau organel sel. Pada

sentrifugasi suatu contoh biologis diberi suatu gaya yang besar dengan memutar contoh

tersebut pada kecepatan yang sangat tinggi. Pada keadaan seperti ini, menyebabkan

terjadinya sedientasi partikel organel sel, atau makromolekul pada suatu kecepatan

yang etrgantung pada masa, ukuran dan kerapatan (Boyer, 2000 ).

Pemisahan sentrifugal menggunakan prinsip dimana objek diputar secara

horizontal pada jarak tertentu. Apabila objek berotasi di dalam tabung atau silinder

yang berisi campuran cairan dan partikel, maka campuran tersebut dapat bergerak

menuju pusat rotasi, namun hal tersebut tidak terjadi karena adanya gaya yang

berlawanan yang menuju kearah dinding luar silinder atau tabung, gaya tersebut adalah

gaya sentrifugasi. Gaya inilah yang menyebabkan partikel-partikel menuju dinding

tanbung dan terakumulasi membentuk endapan (Zulfikar, 2011).

 BAB III ALAT BAHAN DAN METODE

3.1 Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu: alat-alat gelas, botol

vial, bulb pipet, inkubator, kaca arloji, kolom gelas, kuvet, neraca analitis, pipet tetes,

pipet volume, Potter Elvehjem, sentrifugator dengan pendingin, spatula,

spektrofotometer UV, tabung reaksi, dan tabung sentrifugasi.

Gambar 3.1. 1 Spektrofotometer UV

16
 17

Gambar 3.1. 2 Sentrifugator

Gambar 3.1. 3 Inkubator

 18

3.2 Bahan

3.2.1 Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian sebagai sampel yaitu usus halus

ikan nila (Oreochromis niloticus).

3.2.2 Bahan-bahan Kimia

Bahan-bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah:

akuades, asam trikloroasetat (TCA) 8%, aseton, Buffer fosfat (pH: 6,5; 7,4; 7,6; 7,8),

CMC (Carboxymethyl cellulose), es batu, N,N dimetil kasein (10 mg/mL), Pereaksi A

( larutan Na2CO3 2% dalam NaOH 0,1 N ), Pereaksi B ( larutan CuSO4 . 5 H2O 0,5%

dalam Na-K tartrat 1% ), Pereaksi C ( Campuran 50 mL A dan 1 mL B ), dan Pereaksi

D ( larutan folin ciocalteu (fosfomolibdat-fosfowolframat) ).

3.3 Metode

3.3.1 Isolasi Enzim Protease dengan Fraksionasi

Usus halus ikan nila dicuci bersih dengan air dingin, kemudian dipotong

menjadi irisan-irisan kecil (3-5 mm). Ditimbang sebanyak 10 gram sampel, kemudian

dengan buffer fosfat pH 7,4 ; 0,05 M dihomogenasi (membentuk suspensi menjadi 1

gram/10 mL). Dalam kondisi dingin jaringan usus halus ikan nila dipecah dengan alat

Potter Elvehjem selama 1-2 menit, suhu dijaga agar tetap di bawah 0 oC dengan

menggunakan es agar enzim tidak terdenaturasi.

 19

Setelah itu homogenat disentrifugasi pada kecepatan 6.000 rpm selama 30 menit.

Enzim akan berada pada supernatan, terpisah dari pengotor dan sisa-sisa jaringan usus

halus ikan nila. Enzim yang berada di bagian supernatan diendapkan dengan aseton

dingin sebanyak 10 kali volum homogenat. Enzim akan mengendap, kemudian

endapan dipisahkan dari supernatan dan kemudian dilarutkan dalam 5 mL bufer fosfat

pH 6,5; 0,05 M.

3.3.2 Pemurnian Protein dengan Kromatografi Pertukaran Ion

Kolom gelas disiapkan, diisi dengan matriks CMC sambil dielusi secara

terus-menerus dengan buffer fosfat pH 6,5 ; 0,05 M (sebagai buffer awal). Endapan

enzim/protein yang sebelumnya telah dilarutkan dalam 5 mL buffer fosfat pH 6,5; 0,05

M diambil sebanyak 3 mL dan dimasukkan ke dalam kolom penukar kation CMC

dengan pengelusi buffer awal (buffer fosfat pH 6,5 ; 0,05 M). Lalu ditampung dua

puluh fraksi dengan volume penampungan setiap fraksi sebanyak 3 mL (tiap botol

vial), dan kecepatan alir diatur 1 mL/menit. Setelah itu, setiap fraksi diukur serapannya

menggunakan alat spektrofotometer dengan panjang gelombang 280 nm. Kemudian

ditampung lagi sebanyak dua puluh fraksi dengan pengelusi buffer fosfat pH 7,8

dengan volume penampungan setiap fraksi sebanyak 3 mL (tiap botol vial), dan

kecepatan alir diatur 1 mL/menit. Kemudian, setiap fraksi diukur serapannya

menggunakan alat spektrofotometer dengan panjang gelombang 280 nm. Kemudian

setiap puncak protein diuji aktivitas proteasenya.

 20

3.3.3 Penentuan Aktivitas Enzim Protease

Sebanyak 0,5 mL sampel protein (enzim) ditambah dengan 1 mL substrat

kasein dan 0,9 mL buffer fosfat pH 7,6 ; 0,1 M. Campuran tersebut kemudian

diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37oC. Tahap inkubasi dihentikan dengan

menambahkan 0,5 mL larutan asam trikloroasetat (TCA) 8%. Kemudian campuran

tersebut disentrifugasi selama 30 menit. Supernatannya diukur serapannya pada

panjang gelombang 280 nm. Sebagai kontrol (blanko) dalam pengukuran serapan,

sampel enzim diganti dengan air (diperlakukan sama seperti perlakuan terhadap

sampel).

3.3.4 Penentuan Kadar Protein dengan Metode Lowry

3.3.4.1 Pembuatan Kurva Baku Standar Protein

Larutan standar protein (Bovine Serum Albumin) dibuat dengan berbagai

konsentrasi, yaitu: 0,1; 0,5; 1,0; 1,5; dan 2,0 mg/mL BSA dalam air. Pereaksi yang

digunakan adalah:

pereaksi A : larutan Na2CO3 2% (dalam NaOH 0,1 N)

pereaksi B : larutan CuSO4.5H2O 0,5 % (dalam Na-K tartrat 1%)

pereaksi C: Campuran 50 mL pereaksi A dan 1 mL pereaksi B (selalu dalam keadaan

segar)

pereaksi D : Larutan Folin Ciocalteu (fosfomolibdat-fosfowolframat)

 21

Untuk membuat kurva baku, sebanyak 0,1 mL larutan protein standar

ditambahkan 2,5 mL pereaksi C, dikocok dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu

ruang. Setelah itu ditambahkan 0,25 mL pereaksi D, dikocok dan dibiarkan selama 30

menit. Kemudian diukur masing-masing serapannya pada panjang gelombang 750 nm.

Sebagai blanko digunakan 0,1 mL air sebagai pengganti protein dan ditambahkan

dengan 2,5 mL pereaksi C dan 0,25 mL pereaksi D. Setelah diperoleh data pengamatan

berupa serapan masing-masing protein, dibuat kurva baku antara Absorbansi serapan

(A) dengan konsentrasi protein standar. Kurva baku ini akan digunakan lebih lanjut

untuk menentukan kadar protein dari sampel yang dianalisis.

3.3.4.2 Penentuan Kadar Protein dari Sampel

Dengan cara yang sama seperti perlakuan terhadap protein standar,

sebanyak 0,1 mL sampel ditambah dengan 2,5 mL pereaksi C, dikocok dan dibiarkan

selama 10 menit. Setelah itu ditambahkan 0,25 mL pereaksi D, dikocok dan dibiarkan

selama 30 menit. Kemudian serapan diukur pada panjang gelombang 750 nm dengan

blankonya adalah air sebagai pengganti sampel. Kadar protein dapat diperoleh dengan

memplotkan nilai Absorbansi serapan (A) sampel terhadap kurva baku protein standar.
 22

3.3.5 Diagram Alir Penelitian

Sampel

(usus halus)Persiapan Alat dan Bahan

Usus halus dipotong kecil-kecil

Isolasi enzim dengan metode

fraksionasi
Sentrifugasi
(Lisis Sel dengan Potter Elvehjem)

Supernatan Pengotor dan sisa-

Pengendapan dengan sisa jaringan usus

Aseton dingin halus (dibuang)

Sentrifugasi

Endapan Supernatan

Dicuci dengan aseton dingin

Dilarutkan dengan Buffer Fosfat pH 6,5

Kromatografi Pertukaran Ion

Penampungan Fraksi-fraksi

Uji Aktivitas Enzim Ukur Absorbansi Aktivitas Enzim

Fraksi-fraksi
(Spektrofotometri) Protease
Ukur Absorbansi Kadar Protein
Uji Kadar Protein
(Spektrofotometri) Sampel

Gambar 3.3.5. 1 Diagram Alir Penelitian

 23

0,1 mL sampel 0,1 mL sampel

+ 2,5 mL pereaksi C
+ 1 mL substrat N,N dimetil kasein
Diamkan 10 menit
+ 0,9 mL buffer fosfat pH 7,6 ; 0,05 M
+ 0,25 mL pereaksi D
Inkubasi (30 menit; 37ºC)
Diamkan 30 menit
+ 0,5 mL larutan TCA 8%
Ukur serapan (λ=750 nm)
Sentrifugasi
Hitung Kadar Protein
Ukur serapan supernatan (λ=280 nm)
Kadar protein
Hitung aktivitas enzim

Aktivitas Enzim

Gambar 3.3.5. 2 Diagram Alir: Penentuan Aktivitas Enzim (kiri) dan

Penentuan Kadar Protein (kanan)
 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

4.1.1 Pengendapan Protein dengan Aseton

Zat Perlakuan Hasil

- diambil usus halusnya

- ditambahkan buffer fosfat pH

6,5.

- Didinginkan

- dihancurkan menggunakan usus halus ikan nila

waring blender hingga halus hancur

- dipindahkan ke dalam tabung

Ikan Nila sentrifugasi

- ditambahkan 10 mL buffer

fosfat pH 6,5

- Ditimbang

- dibuat penyetimbang

menggunakan akuades

- dimasukan ke dalam alat

sentrifugasi secara

24
 25

bersebrangan

- dilakukan sentrifugasi pada terdapat 3 lapisan,

kecepatan 6000 rpm selama padatan lemak, lemak,

30 menit dan supernatan

- didekantasi diperoleh 10 mL

supernatant

- sebanyak 3 mL disimpan 3 mL ekstrak kasar

Supernatan sebagai ekstrak kasar dalam botol vial

- ditambahkan 70 mL aseton

- disentrifugasi selama 30

menit pada kecepatan 6000 terbentuk endapan

rpm

- dicuci menggunakan 20 mL

etanol

Endapan - disentrifugasi selama 15

endapan enzim dari
menit pada kecepetan 6000
usus ikan nila
rpm
 26

4.1.2 Pemurnian Protein menggunakan Kromatografi Penukar Ion

Zat Perlakuan Hasil

- dilarutkan dalam buffer

endapan larut
Endapan fosfat pH 6,5 sebanyak 5 mL

enzim dari 3 mL hasil

- diambil 3 mL untuk hasil
usu ikan nila pengendapan dalam
pengendapan
botol vial

Matriks
- dimasukan ke dalam kolom laju alir = 3 tetes/menit
CMC

- dielusi menggunakan buffer

fosfat 6,5 hingga kompak

Larutan - dimasukan ke dalam kolom

sampel dalam kolom
enzim hasil dengan cara dielusi

pengendapan - dielusi menggunakan buffer

fosfat pH 6,5

- ditampung 3 mL per tabung diperoleh 12 fraksi

vial eluat pH 6,5

- dielusi menggunakan buffer

fosfat pH 7,8
 27

- ditampung 3 mL per tabung diperoleh 17 fraksi

vial eluat pH 7,8

Fraksi eluat - diukur absorbansinya

absorbansi tiap-tiap
menggunakan spektrofotometer
fraksi didapat
UV pada λ=280nm

Tabel 4.1. 1 Data Absorbansi tiap fraksi λ=280nm

Fraksi Absorbansi / A

1 0,108

2 0,000

3 0,122

4 0,130

5 2,317

6 3,529

7 3,176

8 1,147

9 0,270

10 0,135

11 -0,087

12 1,812
 28

13 0,567

14 0,060

15 0,049

16 0,040

17 0,089

18 0,097

19 0,063

20 0,050

21 0,044

22 0,039

23 0,035

24 0,044

25 0,033

26 0,034

27 0,021

28 0,019

29 0,028
 29

4.1.3 Penentuan Aktivitas Enzim Protease

Zat Perlakuan Hasil

- diambil 0,5 mL masing-

sampel dalam tabung
masing ke dalam tabung
reaksi
reaksi

substrat dalam tabung

- ditambahkan substrat kasein
reaksi

- ditambahkan buffer fosfat pH buffer fosfat pH 7,6

7,6 dalam tabung reaksi

Ekstrak - Dikocok larutan tercampur

kasar, fraksi terjadi hidrolisis

- diinkubasi selama 30 menit
5-8 & fraksi substrat oleh enzim
pada suhu 37°C
12 protease

protein yang tidak

- ditambahkan 3 mL TCA terhidrolisis

mengendap

terdapat endapan
- didiamkan 10 menit
protein

diperoleh peptida-
- disaring hingga bening
peptida hasil
 30

pemotongan oleh

enzim protease

dalam kontrol sampel

- diulangi untuk control diganti menggunakan

air

Larutan - diukur absorbansinya

berisi peptida menggunakan absorbansi sampel

hasil spektrofotometer UV pada diketahui

hidrolisis λ=280nm

Tabel 4.1. 2 Data Absorbansi Uji Aktivitas λ=280 nm

Fraksi Absorbansi / A

Ekstrak
0,264
kasar

Fraksi 5 0,097

Fraksi 6 0,116

Fraksi 7 0,104

Fraksi 8 0,032

Fraksi 12 0,037

Kontrol 0,012
 31

4.1.4 Pembuatan Kurva Standar Protein

Zat Perlakuan Hasil

- dibuat dengan konsentrasi larutan standar protein

0,1;0,5;1,0;1,5;2,0 mg/mL siap

- diambil 0,5 mL ke dalam larutan standar protein

tabung reaksi dalam tabung reaksi

- ditambahkan 2,5 mL
Terlarut
pereaksi Lowry C

Standar - didiamkan 30 menit pada

Protein suhu kamar

(Bouvine - ditambahkan 0,25 mL

Serum pereaksi Lowry D, lalu Terlarut

Albumin) dikocok

warna larutan menjadi

- didiamkan 10 menit
berwarna biru gelap

- diukur absorbansinya

menggunakan
absorbansi terukur
spektrofotometer pada λ=750

nm
 32

diperoleh persamaan
- dibuat kurva bakunya
kurva baku

Tabel 4.1. 3 Data Absorbansi Standar Protein λ=750 nm

Konsentrasi
Absorbansi
/(mg/mL)

0 0

0,1 0,133

0,5 0,655

1 0,811

1,5 1,254

4.1.5 Penentuan Kadar Protein

Zat Perlakuan Hasil

- diambil masing-masing 0,5

Ekstrak larutan sampel dalam
mL ke dalam tabung reaksi
kasar, fraksi tabung reaksi
yang berbeda
5-8 & fraksi
- ditambahkan 2,5 mL
12 Terlarut
pereaksi Lowry C
 33

- didiamkan 30 menit pada

suhu kamar

- ditambahkan 0,25 mL

pereaksi Lowry D, lalu terlarut

dikocok

warna larutan menjadi

- didiamkan 10 menit
berwarna biru gelap

- diukur absorbansinya

menggunakan
absorbansi terukur
spektrofotometer pada λ=750

nm

Tabel 4.1. 4 Data Absorbansi Kadar Protein Sampel λ=750 nm

Fraksi Absorbansi

Ekstrak
0,806
kasar

Fraksi 5 0,426

Fraksi 6 0,762

Fraksi 7 0,819

Fraksi 8 0,384
 34

Fraksi 12 0,303

Kontrol 0,000

4.2 Grafik

Absorbansi Fraksi Enzim Protease dari Ikan

Nila hasil KPI
4

3.5

2.5
Absorbansi

1.5

0.5

0
0 5 10 15 20 25 30 35
-0.5
Fraksi

Gambar 4.2. 1 Grafik Absorbansi terhadap fraksi

 35

Absorbansi terhadap Fraksi Sampel

0.3
Ekstrak kasar,
0.25 0.264

0.2
Aktivitas Unit

0.15
Fraksi 6, 0.116

0.1 Fraksi 7, 0.104

Fraksi 5, 0.097
0.05
Fraksi 12, 0.037
Fraksi 8, 0.032
0 Kontrol, 0.012
Fraksi Sampel

Gambar 4.2. 2 Grafik Absorbansi terhadap Fraksi pada Penentuan Aktivitas Enzim

Kurva Standar BSA

1.4

1.2 y = 0.5677x + 0.0716

R² = 0.9681
1

0.8
A

0.6

0.4

0.2

0
0 0.5 1 1.5 2 2.5
C

Gambar 4.2. 3 Grafik Kurva Baku Protein

 36

Absorbansi terhadap Fraksi Sampel

0.9
Ekstrak kasar, Fraksi 7, 0.819
0.8
0.806 Fraksi 6, 0.762
0.7

0.6
Absorbansi

0.5

0.4 Fraksi 5, 0.426

Fraksi 8, 0.384
0.3 Fraksi 12, 0.303

0.2

0.1

0 Kontrol, 0
Fraksi

Gambar 4.2. 4 Grafik Absorbansi terhadap Fraksi Sampel pada Penentuan Kadar
Protein menggunakan Metode Lowry
 37

4.3 Perhitungan

V KP AU PT / AT / AS Perolehan Kemurnian
Tahapan
/ mL (mg/mL) (unit/mL) mg unit (unit/mg) /% / kali
EK 10 1.2936 16.8 12.9364 168 12.9866 100 1
HP 7.1428 - - - - - - -

Fraksi 5 4.7619 0.62427 5.6667 2.9727 26.9841 9.0772 16.0620 0.6990

Fraksi 6 4.7619 1.21614 6.9333 5.7911 33.0158 5.7011 19.6523 0.4390
Fraksi 7 4.7619 1.31654 6.1333 6.2692 29.2063 4.6587 17.3847 0.3587
Fraksi 8 4.7619 0.55029 1.3333 2.6204 6.3492 2.4230 3.7793 0.1866
Fraksi 12 4.7619 0.40761 1.6667 1.9410 7.9365 4.0889 4.7241 0.3149

1. Volume Sampel

a. Vekstrak kasar = 10 mL
10
b. Vhasil pengendapan = x 5 = 7,1428 mL
7

5 10
c. Vfraksi = 2 x 3 x = 4,7619 mL
7

2. Kadar Protein (KP) / mg/mL

Penentuan kadar protein menggunakan persamaan kurva baku dari standar

protein (Bovine Serum Albumin) yakni :

y=bx+ay

dimana, b = 0,5677 dan a = 0,0716

 38

jadi, kurva bakunya : y = 0,5677x + 0,0716

dimana, y adalah absorbansi dan x adalah kadar protein

 Ekstrak Kasar

y = absorbansi pembacaan

y = 0,806

y = 0,5677x + 0,0716

0,806 = 0,5677x + 0,0716

x = 1,293641008 mg/mL

 Fraksi 5

y = absorbansi pembacaan

y = 0,426

y = 0,5677x + 0,0716

0,426 = 0,5677x + 0,0716

x = 0,624273384mg/mL

 Fraksi 6

y = absorbansi pembacaan

y = 0,762

y = 0,5677x + 0,0716

0,762 = 0,5677x + 0,0716

x = 1,216135283 mg/mL
 39

 Fraksi 7

y = absorbansi pembacaan

y = 0,819

y = 0,5677x + 0,0716

0,819 = 0,5677x + 0,0716

x = 1,316540426 mg/mL

 Fraksi 8

y = absorbansi pembacaan

y = 0,384

y = 0,5677x + 0,0716

0,384 = 0,5677x + 0,0716

x = 0,550290646 mg/mL

 Fraksi 12

y = absorbansi pembacaan

y = 0,303

y = 0,5677x + 0,0716

0,303 = 0,5677x + 0,0716

x = 0,407609653 mg/mL

3. Aktivitas Unit (AU)

absorbansi sampel−absorbansi kontrol

AU = 0,001 ×waktu hidrolisis (menit) ×volume enzim (mL)
 40

Waktu hidrolisis = 30 menit

Volume enzim = 0,5 mL

Absorbansi kontrol = 0,012

 Ekstrak Kasar

Absorbansi ekstrak kasar = 0,264

0,264−0,012
AU = 0,001 × 30 × 0,5 = 16,8 unit/mL

 Fraksi 5

Absorbansi fraksi 5 = 0,097

0,097−0,012
AU = 0,001 × 30 × 0,5 = 5,667 unit/mL

 Fraksi 6

Absorbansi fraksi 6 = 0,143

0,116−0,012
AU = 0,001 × 30 × 0,5 = 6,933 unit/mL

 Fraksi 7

Absorbansi fraksi 7 = 0,104

0,104−0,012
AU = 0,001 × 30 × 0,5 = 6,133 unit/mL

 Fraksi 8

Absorbansi fraksi 8 = 0,032

0,032−0,012
AU = 0,001 × 30 × 0,5 = 1,333 unit/mL

 Fraksi 12
 41

Absorbansi fraksi 12 = 0,037

0,037−0,012
AU = 0,001 × 30 × 0,5 = 1,667 unit/mL

4. Protein Total (PT) / mg

PT = Vsampel x KP

Vsampel = Va (ekstrak kasar), Vb (hasil pengendapan), Vc (tiap fraksi)

Va = 10 mL

Vb = 7,1428 mL

Vc = 4,7619 mL

 Ekstrak Kasar

Kadar Protein (KP) ekstrak kasar = 1,2936 mg/mL

PT = Va x KP

PT = 10 mL x 1,2936 mg/mL

PT = 12,936 mg

 Fraksi 5

Kadar Protein (KP) fraksi 5 = 0,62427 mg/mL

PT = Vc x KP

PT = 4,7619 mL x 0,62427 mg/mL

PT = 2.9727 mg

 Fraksi 6
 42

Kadar Protein (KP) fraksi 6 = 1,21614 mg/mL

PT = Vc x KP

PT = 4,7619 mL x 1,21614 mg/mL

PT = 5,7911 mg

 Fraksi 7

Kadar Protein (KP) fraksi 7 = 1,31654 mg/mL

PT = Vc x KP

PT = 4,7619 mL x 1,31654 mg/mL

PT = 6.2692 mg

 Fraksi 8

Kadar Protein (KP) fraksi 8 = 0,55029 mg/mL

PT = Vc x KP

PT = 4,7619 mL x 0,55029 mg/mL

PT = 2,6204 mg

 Fraksi 12

Kadar Protein (KP) fraksi 12 = 0,40761 mg/mL

PT = Vc x KP

PT = 4,7619 mL x 0,40761 mg/mL

PT = 1,9410 mg
 43

5. Aktivitas Total (AT) / unit

AT = Vsampel x AU

Vsampel = Va (ekstrak kasar), Vb (hasil pengendapan), Vc (tiap fraksi)

Va = 10 mL

Vb = 7,1428 mL

Vc = 4,7619 mL

 Ekstrak Kasar

Aktivitas Unit (AU) ekstrak kasar = 16,8 unit/mL

AT = Va x AU

AT = 10 mL x 16,8 unit/mL

AT = 168 unit

 Fraksi 5

Aktivitas Unit (AU) fraksi 5 = 5,6667 unit/mL

AT = Vc x AU

AT = 4,7619 mL x 5,6667 unit/mL

AT = 26,9841 unit

 Fraksi 6

Aktivitas Unit (AU) fraksi 6 = 6,9333 unit/mL

AT = Vc x AU

AT = 4,7619 mL x 6,9333 unit/mL

 44

AT = 33,0158 unit

 Fraksi 7

Aktivitas Unit (AU) fraksi 7 = 6,1333 unit/mL

AT = Vc x AU

AT = 4,7619 mL x 6,1333 unit/mL

AT = 29,2063 unit

 Fraksi 8

Aktivitas Unit (AU) fraksi 8 = 1,3333 unit/mL

AT = Vc x AU

AT = 4,7619 mL x 1,3333 unit/mL

AT = 6.3492 unit

 Fraksi 12

Aktivitas Unit (AU) fraksi 12 = 1.6667 unit/mL

AT = Vc x AU

AT = 4,7619 mL x 1.6667 unit/mL

AT = 7.9365 unit

6. Aktivitas Spesifik (AS) / unit/mg

AT
AS = PT
 45

 Ekstrak Kasar

AT
AS = PT

168 𝑢𝑛𝑖𝑡
AS = 12.9364 𝑚𝑔

AS = 12,9866 unit/mg

 Fraksi 5

AT
AS = PT

26,9841 𝑢𝑛𝑖𝑡
AS = 2,9727 𝑚𝑔

AS = 9,0772 unit/mg

 Fraksi 6

AT
AS =
PT

33,0158 𝑢𝑛𝑖𝑡
AS = 5,7911 𝑚𝑔

AS = 5,7011 unit/mg

 Fraksi 7

AT
AS = PT

29,2063 𝑢𝑛𝑖𝑡
AS = 6,2692 𝑚𝑔

AS = 4,6587 unit/mg

 Fraksi 8

AT
AS = PT
 46

6,3492 𝑢𝑛𝑖𝑡
AS = 2,6204 𝑚𝑔

AS = 2,4230 unit/mg

 Fraksi 12

AT
AS = PT

7,9365 𝑢𝑛𝑖𝑡
AS = 1,9410 𝑚𝑔

AS = 4,0889 unit/mg

7. Perolehan (%)

AT′
Perolehan = x 100 %
AT

AT’ adalah aktivitas total dari sampel dan AT adalah aktivitas total dari

ekstrak kasar

AT = 54,4 unit

 Ekstrak Kasar

Ekstrak kasar terhadap ekstrak kasar

AT′
Perolehan = x 100 %
AT

168 unit
Perolehan = 168 unit x 100 %

Perolehan = 100 %
 47

 Fraksi 5

Fraksi 5 terhadap ekstrak kasar

AT′
Perolehan = x 100 %
AT

26,9841 unit
Perolehan = x 100 %
168 unit

Perolehan = 16,0620 %

 Fraksi 6

Fraksi 6 terhadap ekstrak kasar

AT′
Perolehan = x 100 %
AT

33,0158 unit
Perolehan = x 100 %
168 unit

Perolehan = 19,6523 %

 Fraksi 7

Fraksi 7 terhadap ekstrak kasar

AT′
Perolehan = x 100 %
AT

29,2063 unit
Perolehan = x 100 %
168 unit

Perolehan = 19,6523 %

 Fraksi 8

Fraksi 8 terhadap ekstrak kasar

AT′
Perolehan = x 100 %
AT
 48

6,3492 unit
Perolehan = x 100 %
168 unit

Perolehan = 3,7793 %

 Fraksi 12

Fraksi 12 terhadap ekstrak kasar

AT′
Perolehan = x 100 %
AT

7,9365 unit
Perolehan = x 100 %
168 unit

Perolehan = 4,7241 %

8. Kemurnian

AS′
Kemurnian = AS

AS’ adalah aktivitas spesifik dari sampel dan AS adalah aktivitas spesifik dari

ekstrak kasar

AS = 1,43103 unit/mg

 Ekstrak Kasar

Ekstrak kasar terhadap ekstrak kasar

AS′
Kemurnian =
AS

12,9866 unit/mg
Kemurnian = 12,9866 unit/mg

Kemurnian = 1
 49

 Fraksi 5

Fraksi 5 terhadap ekstrak kasar

AS′
Kemurnian = AS

9,0772 unit/mg
Kemurnian = 12,9866 unit/mg

Kemurnian = 0,6990

 Fraksi 6

Fraksi 6 terhadap ekstrak kasar

AS′
Kemurnian = AS

5,7011 unit/mg
Kemurnian = 12,9866 unit/mg

Kemurnian = 0,4390

 Fraksi 7

Fraksi 7 terhadap ekstrak kasar

AS′
Kemurnian = AS

4,6587 unit/mg
Kemurnian =
12,9866 unit/mg

Kemurnian = 0,3587

 Fraksi 8

Fraksi 8 terhadap ekstrak kasar

AS′
Kemurnian = AS
 50

2,4230 unit/mg
Kemurnian = 12,9866 unit/mg

Kemurnian = 0,1866

 Fraksi 12

Fraksi 12 terhadap ekstrak kasar

AS′
Kemurnian = AS

4,0889 unit/mg
Kemurnian = 12,9866 unit/mg

Kemurnian = 0,3149

4.4 Pembahasan

Pada percobaan kali ini mengenai Isolasi dan Penentuan Akrivitas Enzim

Proteolitik dari Usus Halus Ikan Nila. Tujuan dari percobaan kali ini yaitu antara lain

untuk mengisolasi enzim protease dari usus halus ikan nila (Oreochromis niloticus)

dengan sentrifugasi, untuk memurnikan enzim protease dari usus halus ikan nila

(Oreochromis niloticus) dengan metode kromatografi penukar ion, untuk menentukan

kadar protein dari usus halus ikan nila (Oreochromis niloticus) dengan metode lowry,

serta untuk menentukan aktivitas enzim protease dari usus halus ikan nila

(Oreochromis niloticus) dengan menggunakan substrat N-N dimetilkasein.

 51

Beberapa enzim protease yang terdapat dalam usus halus ikan nila diantaranya:

1. Tripsin; memotong protein pada urutan asam amino setelah

asam amino basa: Lys dan Arg

2. Kimotripsin; memotong protein pada urutan asam amino setelah

asam aminoaromatik: Phe, Tyr, dan Trp

3. Elastase; memotong protein pada urutan asam amino setelah

asam amino non- polar kecil: Alanin dan serin

4. Amino peptidase; memotong protein pada asam amino ujung-N.

5. Karboksi peptidase; memotong protein pada asam amino ujung-

C.

Prosedur yang pertama kali dilakukan yaitu mengisolasi enzim protease dari

usus halus ikan nila dengan metode sentrifugasi. Pertama usus halus ikan nila dicuci

bersih dengan menggunakan air. Air yang digunakan adalah air dingin. Pencucian ini

dilakukan bertujuan untuk mencegah terjadinya kontaminasi mikroba, digunakan air

dingin bertujuan untuk pengodisiaan awal agar selama proses penghancuran usus ikan

nila masih dalam keadaan dingin. Pada dasarnya, mikroba akan sulit tumbuh pada

temperatur yang dingin. Selain itu hal ini dilakukan untuk mencegah denaturasi protein

(enzim) yang terdapat didalamnya (enzim stabil) atau juga dapat menyebabkan enzim-

enzim tersebut kehilangan aktivitasnya atau dengan kata lain, enzim tidak aktif pada

suhu rendah.
 52

Setelah itu,usus halus ikan nila dipotong kecil-kecil dan ditimbang sebanyak 10

gram dan dimasukan kedalam tabung sentrifugasi. Setelah itu, usus halus ikan nila

ditambahkan buffer fosfat pH 7,4. Penambahan buffer pH 7,4 bertujuan untuk menjaga

agar enzim protease pada usus halus ikan nila ini tetap stabil. Jika pH terlalu rendah

maka akan mendenaturasi protein. Enzim mempunyai pH optimum dimana enzim ini

akan bekerja maksimum, jika di bawah atau di atas pH optimum maka enzim akan

mengalami denaturasi dan akan berkurang kereaktifannya. Dengan penambahan

larutan buffer pH 7,4 maka enzim tidak akan mengalami perubahan pH yang berarti

pada penambahan sedikit asam maupun basa.

Setelah itu, usus halus yang telah dihomogenkan dipecah dengan blender yaitu

waring blender sampai halus. Hal ini bertujuan untuk memecah sel dari usus halus.

Kemudian ditambahkan buffer fosfat pH 6,5 kedalam usus halus yang berada dalam

tabung sentrifugasi tersebut. Saat proses pemecahan menggunakan blender, tabung

sentrifugasi ditaruh diatas ice bath. Hal ini bertujuan untuk menjaga agar enzim tidak

terdenaturasi akibat perubahan struktur enzim yang tadinya folding menjadi unfolding,

karna pada saat proses pemecahan menggunakan blender akan timbul efek panas,

sehingga untuk mencegahnya, tabung berisi usus halus tersebut dijaga suhunya agar

tetap rendah.

Setelah itu, tabung sentrifugasi berisi homogenat dimasukan kedalam alat

sentrifugasi. Sebelumnya, dibuat penyetimbang menggunakan akuades dengan

 53

dimasukan ke dalam alat sentrifugasi secara bersamaan dan bersebrangan. Kemudian

disentrifugasi selama 30 menit dengan kecepatan 6000 rpm. Proses sentrifugasi

dilakukan pada putaran 6.000 rpm karena merupakan putaran optimum apabila kurang

dari 6.000 rpm maka proses sentrifugasi tidak maksimal sehingga antara supernatan

dan endapan tidak terpisah dengan baik. Apabila lebih dari 6.000 rpm maka akan

merusak enzim secara mekanik sehingga enzim tersebut dapat terdenaturasi juga.

Sentrifugasi ini dilakukan dengan menempatkan partikel dan medium

suspensinya dalam medan sentrifugal. Medan sentrifugal menyebabkan partikel

bermigrasi lebih cepat ke arah luar dari sumber rotasi. Dalam operasinya, sentrifugasi

dijalankan dengan menaruh partikel dan medium suspensinya pada ujung dari alat yang

berputar yaitu rotor. Prinsip dari pemisahan ini adalah perbedaan kecepatan

sedimentasi partikel atau molekul yang disebabkan oleh medan sentrifugal. Kecepatan

sentrifugasi enzim dengan kecepatan sedimentasi komponen lainnya berbeda, sehingga

pada saat disentrifugasi dalam medan sentrifugasi terjadi pemisahan.

Setelah dilakukan sentrifugasi, supernatan dipisahkan dari endapannya. Pada

proses ini, enzim akan berada pada supernatan, karena enzim memiliki densitas lebih

kecil dibandingkan densitas pelarutnya dan enzim lebih larut pada air karena

kepolarannya relatif sama dengan air. Hal ini sesuai dengan prinsip like dissolved like

dimana senyawa akan cenderung larut dalam pelarut yang memiliki kepolaran yang

relatif sama.
 54

Kemudian,supernatan yang telah dipisahkan dipipet sebanyak 3 mL sebagai

ekstrak kasar untuk kemudian disimpan didalam lemari es. Kemudian protein

diendapkan dengan penambahan aseton dingin dengan jumlah pelarutan sampai 10 kali

jumlah homogenat. Homogenat yang diperoleh pada percpobaan ini adalah 7 ml

sehingga dilarutkan dalam aseton sebanyak 70 mL. Tujuannya adalah untuk

mengendapkan enzim protease yang ada dalam supernatan tersebut. Penambahan

pelarut organik yaitu aseton dapat menyebabkan reduksi dari sifat aktifitas air.

Kekuatan solvasi air terhadap molekul enzim atau protein hidrofil akan berkurang

dengan meningkatnya keonsentrasi aseton. Hal ini disebabkan oleh reduksi konstanta

dielektrik dari air, penggantian molekul dari air, serta mobilisasi partikel dari molekul

air tersebut melalui pelarut organik. Air akan lebih tertarik pada pelarut organik karena

kepolaran keduanya relatif sama. Selain itu aseton bersifat semipolar. Setelah itu

dilakukan lagi sentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 6000rpm. Setelah itu

dipisahkan supernatan dan endapannya. Setelah itu dipisahkan lagi endapan dan

supernatan. Terakhir, endapan dilarutkan dengan buffer fosfat pH 6,5 sebanyak 5mL.

Kemudian dipipet sebanyak 2 mL dan dimasukan ke botol vial sebagai hasil

pengendapan untuk kemudian dimasukan kedalam lemari es namun dikarenakan

terjadinya kesalahan dan kurang ketelitian fraksi pengendapan nya tidak disimpan

sehingga tidak diperoleh datanya. Sedangkan untuk 3 mL sisanya akan dimurnikan

dengan proses kromatografi penukar ion.

 55

Prosedur yang selanjutnya yaitu pemurnian enzim dengan kromatografi penukar

ion. Kromatografi penukar ion memanfaatkan perbedaan afinitas antara molekul

bermuatan di dalam larutan dengan senyawa yang tidak reaktif yang bermuatan

berlawanan sebagai pengisi kolom. Permukaan protein terdiri dari muatan positif dan

negatif tergantung dari rantaisamping asam amino asan dan basa. pH protein dengan

jumlah muatan positif dan negatif sama disebut titik isoelektrik (pI). pI sebagian besar

protein di antara pH 5-9. Protein yang ditambahkan pH di bawah pI akan bermuatan

positif sedangkan yang ditambahkan pH dibawah pI akan bermuatan negatif.

Pertama, disiapkan kolom yaitu kapas dimasukkan ke dalam ujung kolom yang

berguna untuk menahan resin agar tidak keluar dari kolom. Kapas juga tidak akan

beraksi dengan fase gerak maupun sampel sehingga aman untuk digunakan. Setelah itu

resin yaitu CMC dimasukkan sampai setinggi 5 cm. Semakin panjang kolom maka

resolusi nya akan semakin baik. Tetatapi laju dari protein akan menurun begitu pula

waktu yang dibutuhkan akan semakin lama. Sehingga tinggi kolom perlu disesuaikan

untuk memperoleh keuntungan terbesar. Keadaan resin dalam kolom harus rata dan

tidak berongga sehingga pemisahan berjalan optimum. Oleh karena itu dielusi dengan

buffer fosfat 6,5 hingga kolom padat dan kompak. Setelah dihasilkan tetesan yang

konstan yang merupakan salah satu tanda resin sudah rata lalu ekstrak hasil

pengendapan dimasukkan sebanyak 3 ml ke dalam kolom yang sebelumnya telah berisi

matriks CMC (Carboxymethyl cellulose) yang telah padat dan kompak tersebut.CMC
 56

ini berfungsi sebagai fase diam pada proses kromatografi ini. CMC merupakan matriks

penukar kation yang artinya bermuatan positif. CMC mengandung gugus-gugus

bermuatan negatif yang dapat menukarkan kation. Digunakan CMC karena, pada

prinsip kerjanya, enzim yang akan dimurnikan, harus dibuat melekat terlebih dahulu

pada matriks, sehingga muatannya harus sama. Maka dari itu sebelumnya mengapa

hasil pengendapan ditambahkan buffer fosfat pH 6,5 terlebih dahulu yang

menyebabkan enzim bermuatan positif karena penambahan pH dibawah titik

isoelektriknya. Buffer Fosfat 6,5 ini berfungsi sebagai fase geraknya yang akan

mengelusi. Sebelumnya matriks CMC juga dilarutkan dengan buffer fosfat pH 6,5.

Setelah ekstrak hasil pengendapan telah masuk kedalam ke kolom dan terserap

seluruhnya, dielusi dengan buffer fosfat pH 6,5. Enzim yang bermuatan negatif yang

akan dipisahkan akan turun keluar dari kolom. Ditampung sebanyak 12 fraksi dengan

3mL/botol.

Setelah itu, pengelusi diganti dengan buffer fosfat pH 7,8. Protein yang

sebelumnya terikat pada kolom akan dilepaskan dengan cara mengubah gradien pH

nya, dimana pada percobaan ini adalah pH 7,8. Protein yang tadinya bermuatan positif

akan menjadi bermuatan negatif karena penambahan pH diatas titik isoelektriknya,

sehingga tidak akan terikat pada matriks yang bermuatan positif, dan keluar dari kolom.

Ditampung hingga fraksi ke 29 dengan 3mL/botol.

 57

Setelah itu fraksi yang telah didapat diukur absorbansinya dengan menggunakan

spektrofotometer dengan blanko masing-masing hasil fraksi yaitu buffer fosfat pH 6,5

dan 7,8. Fraksinya di ukur serapannya pada panjang gelombang 280 nm karena protein

memilki asam-asam amino yang spesifik yang memilki gugus aromatik terkonjugasi

yang dapat menyerap spektra pada panjang gelombang 280 nm, yaitu

fenilalanin,tyrosin, dan tryptophan. Didapatkan hasil pada pH 6,5 fraksi paling murni

yaitu pada fraksi 5,6,7,8, dan 12 sedangkan pada pH 7,8 paling murni pada fraksi 13.

Prosedur selanjutnya yang dilakukan yaitu penentuan aktivitas enzim dengan

menggunakan substrat kasein substrat N-N dimetilkasein. Mula-mula sampel protein

dipipet sebanyak 0,5 mL dan dimasukan kedalam tabung reksi, Kemudian ditambahkan

2,5mL substrat N-N dimetilkasein ke dalam masing-masing tabung reaksi yang bersisi

fraksi 5,6,7,8,dan 12. Kasein ini berfungsi sebagai substrat yang akan terikat pada sisi

aktif enzim sehingga pengukuran aktivitas enzim dapat dilakukan.

Kemudian,ditambahkan buffer fosfat pH 7,6 sebanyak 4,5 mL. Hal ini bertujuan untuk

mempertahankan pH karena enzim bekerja pada pH optimum (tertentu). Jika pH asam

atau basa maka enzim akan rusak. Enzim protease akan memecah ikatan peptida

substrat membentuk asam amino penyusunnya. Banyaknya asam amino yang terbentuk

itulah yang menentukan aktivitas enzim protease. Semakin banyak asam amino yang

terbentuk maka aktivitasnya semakin besar.

 58

Kemudian diinkubasi pada suhu 37˚C selama 30 menit. Tujuan dari inkubasi

yaitu untuk mempercepat reaksi,karena enzim akan bekerja optimal pada suhu

optimum. Setelah diinkubasi, kemudian ditambahkan larutan TCA (trikloroasetat) 8 %

sebanyak 2,5 mL yang berfungsi untuk mengendapkan protein yang telah terpotong-

potong karena adanya akifitas enzim protease. Dengan adanya TCA 8% maka protein

akan terdenaturasi sehingga terbentuk endapan. TCA berfungsi sebagai inhibitor yang

menghentikan reaksi antara enzim dan substrat yaitu kasein. Setelah itu, dipisahkan

endapan dan supernatannya dengan menggunakan corong saring dan kertas saring.

Supernatannya diukur serapannya pada panjang gelombang 280 nm karena protein

memilki asam-asam amino yang spesifik yang memilki gugus aromatik terkonjugasi

yang dapat menyerap spektra pada panjang gelombang 280 nm, yaitu

fenilalanin,tyrosin, dan tryptophan. Untuk prosedur ini dilakukan juga untuk air

sebagai kontrol. Dan untuk blanko yang digunakan yaitu buffer fosfat pH 7,6.

Didapatkan hasil aktivitas unit yang didapat yaitu:

 Ekstrak kasar : 16,8 unit/mL

 Fraksi 5 : 5,6667 unit/mL

 Fraksi 6 : 6,9333 unit/mL

 Fraksi 7 : 6,1333 unit/mL

 Fraksi 8 : 1,3333 unit/mL

 Fraksi 12 : 1,6667unit/mL
 59

Unit aktivitas adalah jumlah enzim yang menyebabkan kenaikan 0,001 A

unit/menit diatas blanko. Suatu aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah yang

menyebabkan pengubahan 1,0 mmol substrat permenit pada keadaan pengukuran

aktivitas spesifik jumlah unit enzim per milligram protein. Pada uji Aktivitas enzim ini

diaplikasikan prinsip penentuan aktivitas Enzim yaitu “Inducted Fit” dimana suatu

enzim akan bereaksi dengan substrat ataus enyawa yang mirip dengan substratnya

sehingga akan menghasilkan suatu produk.

Dari hasil percobaan didapatkan hasil Protein Total (PT) / mg yaitu Ekstrak Kasar

PT sebesar 12,9364 mg, Fraksi 5 PT sebesar 2,9727mg, Fraksi 6 PT sebesar 5,7911

mg, Fraksi 7 PT sebesar 6,2692 mg, Fraksi 8 PT sebesar 2,6204 mg dan Fraksi 12 PT

sebesar 1,9410 mg.

Prosedur selanjutnya yaitu penentuan kadar protein metode Lowry. Pada

prosedur ini dilakukan 2 percobaan yaitu pengukuran protein standar dan penentuan

kadar protein sampel. Pada prosedur pengukuran protein standar yaitu mula mula

membuat larutan standar (Bovine Serum Albumin).Padatan BSA ditimbangs ebanyak

0,04 gram dan dilarutkan dengan akuades 10 ml didalam labu ukur. Kemudian

dihomogenkan dengan cara direfluks.Selanjutnya,dilakukan pengenceran dengan

konsentrasi 0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/mL BSA. Selain itu pengenceran ,dibuat pula

blanko yaitu dengan menggunakan akuades. Blanko dan pengenceran BSA 0,1; 0,5;

1,0;1,5;2,0 mg/ml diambil sebanyak 0,5 ml dan dimasukkan kedalam tabung reaksi
 60

yang berbeda.Kemudian ditambahkan 2,5 mL pereaksi C (campuran 50 mL pereaksi A

dan 1mL pereaksi B). Pereaksi A adalah larutan natrium karbonat 2% dalam natrium

hidroksida 0,1M yang berfungsi sebagai pemberi suasana basa pada reaksi

pembentukan senyawa kompleks antara 𝐶𝑢2+ dengan gugus -NH dari rantai peptida

pada protein. Pereaksi B adalah larutan tembaga (II) sulfat pentahidrat 0,5% dalam Na-

K-tartrat 1% yang berfungsi sebagai sumber ion 𝐶𝑢2+ dalam percobaan.

Kemudian,direfluks hingga larut sempurna. Larutan dibiarkan 10 menit supaya proses

dapat berlangsung. Selanjutnya ditambahkan pereaksi D yaitu pereaksi Folin-Ciocalteu

(fosfomolibdat dan fosfowolframat) sebanyak 0,25 ml yang akan direduksi oleh asam

amino tirosin dan triptofan yang berasal dari molekul protein. Kemudian, direfluks

hingga larut sempurna. Larutan didiamkan 30 menit agar proses reduksi berlangsung

sempurna. Kompleks biru yang terbentuk menandakan bahwa proses ini telah selesai.

Penentuan kadar protein dengan metoda Lowry adalah untuk menentukan kadar

protein terlarut berdasarkan warna yang timbul karena adanya reaksi biuret disamping

warna yang disebabkan oleh reduksi fosfomolibdat-fosfowolframat karena adanya

reduksi asam amino tyrosin dan triptophan dalam molekul protein. Dengan adanya

𝐶𝑢2+ dalam suasana basa, biuret akan membentuk kompleks berwarna ungu.

Pada penentuan akdar protein ini, diaplikasikan prinsip reaksi pembentukan

kompleks Uji Biuret yaitu reaksi yang terjadi antara atom pusat(logam) denagn ligan

dari suatu protein dalm suasana basa yang dihubungkan dengan ikatan kovalen
 61

koordinasi dengan membentuk kompleks biru. Prinsip ini diaplikasikan apda saat

penambahan pereaksi C.Selain itu diaplikasikan pula prinsip Reakasi Reduksi

Fosfomolibdat-fosfomulframat yaitu reaksi reduksi atau penangkapan elektron dan

penurunan bilangan oksidasi pada ter-fosfomolibdat karena adanya asam amino tyrosin

dan triptophan. Prinsip ini diaplikasikan pada saat penambahan Pereaksi D pada

metode Lowry.

Absorpsi warna dari reaksi biuret dalam penentuan kadar protein diukur pada

panjang gelombang maksimum 750 nm maka absorbansinya diketahui. Penentuan

kadar protein ini dilakukan dengan melakukan metode spektrofotometri dimana untuk

metode ini sampel terlebih dahulu dibuat dalamlarutan berwarna karena

spektrofotometri dapat mengabsorpsi sinar tampak padalarutan yang berwarna. Oleh

karena itu, protein direaksikan dengan pereaksi D(pereaksi folin ciocalteu) yang

mengandung senyawa fosfomolibdat danfosfowolframat yang akan membentuk

senyawa kompleks biru bila bereaksi dengan protein dan warna biru yang timbul

mempunyai panjang gelombang maksimum pada 750 nm. Pada prosedur pengukuran

standar protein ini menggunakan blanko yaitu air. Kemudian dibuat kurva baku standar

protein dengan memplotkan serapan (Absorbansi) terhadap konsetrasi standar.

Selanjutnya kurva baku ini digunakan untuk menentukan kadar protein sampel yang

dianalisis. Pada absorbansi ini diaplikasikan prinsip Hukum Lambert-Beer yaitu bila

suatu sinar monokromatik dilewatkan pada medium transparan,maka intensitas sinar

 62

yang diteruskan akan berkurang dengan bertambahnya ketebalan medium dan

konsentrasi larutan yang mengabsorpsi.

Prosedur yang kedua pada penentuan kadar protein yaitu sama dengan penentuan

kadar protein standar hanya saja larutan standar protein diganti dengan sampel. Sebagai

blanko, sampel diganti dengan air. Kadar protein sampel ditentukan dengan

memplotkan absorbansi sampel hasil uji lowry terhadap kurva baku protein. Pada

prosedur ini juga diaplikasikan prinsip yang sama dengan pennetuan kadar protein

standar.

Pada percobaan kali ini diperoleh hasil kemurnian sebagai berikut Ekstrak Kasar

kemurnian nya sebesar 1kali , Fraksi 5 Kemurnian sebesar 0,6990kali , Fraksi 6

Kemurnian sebesar 0,4390kali , Fraksi 7 kemurnian sebesar 0,3587kali, Fraksi 8

kemurnian sebesar 0,1866kali dan Fraksi 12 kemurnian sebesar 0,3149kali.

Dari seluruh hasil yang didapat sesuai dengan yang diharapkan karena adanya

peningkatan kemurnian dari tiga tahapan yang dilakukan. Yang menunjukkan bahwa

tahapan tersebut dapat memurnikan protein yang ingin diisolasi, sesuai dengan grafik

absorbansinya semakin besar fraksi maka persentase perolehan akan semakin kecil.

Sementara pada kemurnian, akan semakin besar sesuai dengan grafik absorbansi

dimana semakin tinggi puncak/semakin menurun puncak kemurnian juga semakin

tinggi/semakin menurun.
 63

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

1. Enzim protease dapat diisolasi dari usus halus ikan Nila (Oreochromis

niloticus) dengan metode sentrifugasi.

2. Enzim protease dari usus halus ikan Nila (Oreochromis niloticus) dapat

dimurnikan dengan metode Kromatografi Penukar Ion, yaitu:

 Ekstrak kasar : 1 Kali

 Sampel dari kolom :

1. Fraksi 5 : 0.6990 Kali

2. Fraksi 6 : 0.4390 Kali

3. Fraksi 7 : 0.3687 Kali

4. Fraksi 8 : 0.1866 Kali

5. Fraksi 12 : 0.3149 Kali

3. Kadar protein dari usus halus ikan Nila (Oreochromis niloticus) yang

diperoleh melalui metode Lowry, yaitu:

 Ekstrak kasar : 1.2936 mg/mL

 Sampel dari kolom :

1. Fraksi 5 : 0.62427 mg/mL

2. Fraksi 6 : 1.21614 mg/mL

3. Fraksi 7 : 1.31654 mg/mL

 64

4. Fraksi 8 : 0.55029 mg/mL

5. Fraksi 12 : 0.40761 mg/mL

4. Aktivitas enzim protease dari usus halus Ikan Nila (Oreochromis niloticus)

dapat di uji dengan substrat N,N-dimetilkasein sehingga diperoleh hasil, yaitu:

 Ekstrak kasar : 16.8 unit/mL

 Sampel dari kolom :

1. Fraksi 5 : 5.6667 unit/mL

2. Fraksi 6 : 6.9333 unit/mL

3. Fraksi 7 : 6.1333 unit/mL

4. Fraksi 8 : 1.3333 unit/mL

5. Fraksi 12 : 1.6667 unit/mL

5.2 Saran

Dari hasil percobaan yang telah dilakukan, ternyata tidak mudah untuk

mendapatkan isolat yang murni karena memerlukan kondisi-kondisi tertentu. Oleh

karena itu, sebelum mengisolasi suatu enzim harus diketahui terlebih dahulu

karakteristik dari enzim tersebut, seperti pH optimum, suhu optimum, tipe enzim, dll.

Setelah diketahui karakteristiknya barulah dapat ditentukan metode yang tepat untuk

mengisolasi dan memurnikan enzim tersebut.

 65

Berdasarkan hasil yang diperoleh dari percobaan kali ini, disarankan:

1. Ada studi singkat terlebih dahulu mengenai organ-organ hewan yang akan diisolasi

enzimnya, dalam hal ini ikan mas, ikan lele dan nila sehingga praktikan dapat lebih

mengenal dan membedakan bagian-bagian yang akan diisolasi (pankreas dan usus

halus).

2. Lebih banyak fraksi yang ditampung akan menghasilkan pemisahan yang lebih

baik.

3. Pada waktu mengisolasi enzim seharusnya dilakukan di ruangan yang dingin

supaya enzim tidak kehilangan aktivitasnya.

4. Hendaknya diperhatikan dalam penggunaan peralatan keselamatan seperti sarung

tangan dan masker karena menggunakan larutan yang cukup berbahaya dan
berbau.
5. Kesabaran dan ketelitian diperlukan dalam melakukan percobaan ini. Setiap hasil
perlakuan yang dilakukan segera dicatat karena dibutuhkan dalam prosedur
selanjutnya.
Dengan demikian diharapkan proses isolasi dan pemurnian enzim serta penentuan

aktivitasnya dapat memberikan hasil yang lebih baik pada percobaan-percobaan

selanjutnya.

DAFTAR PUSTAKA
 66

Boyer, R. 2000. Modern Experimental Biochemistry. Benjamin Cummings. San

Fransisco.

Hame, B.D. & N. M. Hooper. 2000. Biochemistry the Instant Notes. Second

Edition. Spinger- Verlag. Hongkong .

Khairuman & A.Khairul. 2007. Budidaya Ikan Nila Secara Intensif.

Agromedia Pustaka, Jakarta.

Lehninger,A.L. 1982. Dasar-Dasar Biokimia, diterjemahkan oleh M. Theniwidjaja.

Erlangga. Jakarta.

Mckee,T. & J.K. Mckee. 1999. Biochemistry an Introduction. Mc Graw Hill Company,

Inc. Boston.

Motyan, J. A., F. Toth & J. Tozser. 2013. Research Applications of Proteolytic

Enzymes in Molecular Biology. Journal of Biomolecules, vol.3, page 924.

Nelson, D.L. & M.C. Michael. 2008. Principle of Biochemistry. Fifth edition.

W.H. Fremann and Company. New York.

Pavel, C. I., L. A. Marghitas., V. Bonta., C. M. Mihai & L. I. Tomos. 2013.

 67

Determination Of Total Protein Content In Royal Jelly: A Comparison Of

The Kjeldahl, The Bradford And The Lowry Methods. Journal of Agricultural

Sciences and Veterinary Medicine, vol.59, page 210.

Suyanto, S. Rachmatun, 2005. Nila. Penebar Swadaya, Jakarta.

Toha, A.H.A. 2005. Deoxyribosa Nucleac Acid. Alfabeta. Bandung.

Ward, O.P. 1983. Proteinases In Fogatory Microbial Enzymes and Biotechnology.

Applied Science Publisher. New York.

Winarno, F.G. 1983. Enzim Pangan. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

Zulfikar, A. 2011. “Sentrifugasi” . diakses pada 28 November 2017 19.50.

http://www.chem-is-try.org/materi_kimia/kimia-kesehatan /pemisahan-

kimia-dan-analisis/sentrifugasi/
 68

LAMPIRAN

Gambar 1. Ikan Nila Gambar 2. Kolom Kromatografi

Penukar Ion
 69

Gambar 3. Fraksi Enzim Proteolitik

Gambar 4. Penentuan Kadar

Protein