Tanaman bioteknologi bergantung pada dua pendekatan untuk pengiriman dan

ekspresi gen heterolog pada tanaman: transformasi genetik yang stabil dan ekspresi
transien menggunakan vektor virus. Meskipun jauh lebih cepat, rute transien dibatasi oleh
infektivitas rendah vektor virus yang membawa gen berukuran rata-rata atau besar. Kami
telah mengembangkan konstruksi untuk pengiriman yang efisien dari vektor virus RNA
sebagai prekursor DNA dan menunjukkan di sini bahwa pengiriman Agrobacterium-
dimediasi hasil konstruksi ini di amplifikasi gen dalam semua daun dewasa dari tanaman
secara bersamaan (transfeksi sistemik). Proses ini, disebut 'magnifection', dapat dilakukan
pada skala besar dan dengan spesies tanaman yang berbeda. Teknologi ini
menggabungkan keunggulan tiga sistem biologis (efisiensi transfeksi A. tumefaciens, hasil
ekspresi tinggi yang diperoleh dengan vektor virus, dan kemampuan pasca-translasi dari
tanaman), tidak memerlukan modifikasi genetik tanaman dan lebih cepat dari yang ada
lainnya metode.
Vektor virus yang dirancang untuk ekspresi protein rekombinan pada tanaman
menjanjikan besar karena hasil absolut dan relatif tinggi, dan karena kecepatan yang
disediakan oleh ekspresi sementara. Sebagian besar hasil kepentingan praktis yang dicapai
sejauh ini telah diperoleh dengan vektor dibangun di atas tulang punggung virus RNA plus-
akal seperti virus mosaik tembakau (TMV) atau virus kentang X1-4.
Hasil
Replikasi virus berikut agroinfiltration vektor berbasis TMV Agroinfiltration dari vektor
virus berbasis TMV mengandung gen yang mengkode protein fluorescent hijau (GFP) ke N.
benthamiana daun mengarah ke pembentukan fokus dari GFP fluoresensi 3 d post-infiltrasi
(dpi). Untuk mengukur proporsi sel memulai replikasi virus, penghapusan 489-bp dibuat
dalam protein gerakan (MP) coding urut, sehingga membangun pICH14833. Replikon
berasal dari konstruk ini tidak bisa bergerak dari sel ke sel tetapi mampu mereplikasi secara
mandiri dalam setiap sel yang terinfeksi. Tiga hari setelah agroinfiltration dari pICH14833 di
daun N. benthamiana (OD600of A. tumefaciens dalam larutan infiltrasi adalah 0,7), sejumlah
kecil sel mengekspresikan GFP muncul, dan pola yang sama masih terlihat 2 minggu
setelah infiltrasi. Dengan menghitung protoplas disiapkan dari daerah menyusup, disini
ditemukan bahwa 0,6-1,6% dari sel dimulai replikasi virus.
Ada beberapa alasan mengapa vektor virus RNA mungkin memiliki kesulitan
memulai siklus replikasi. Pertama, virus RNA, seperti TMV, bereplikasi dalam sitoplasma
dan tidak pernah masuk ke inti, dan karena itu telah berevolusi dalam lingkungan di mana
mereka tidak terkena mesin pengolahan pra-mRNA nuklir. Akibatnya, pra-mRNA transkrip
dibuat dalam inti dari konstruksi virus mungkin tidak kembali cognized dan diproses dengan
benar. Kedua, konstruksi vektor virus mengkodekan transkrip yang sangat besar (B7.6 kb
untuk transkrip primer dari vektor virus yang mengandung gen GFP), ukuran yang jauh lebih
besar dari ukuran rata-rata (1-2 kb) gen tanaman. Selain itu, di alam, gen eukariotik besar
sering mengandung banyak intron yang memfasilitasi pengolahan dan ekspor pra-mRNA
dari nucleus6 tersebut. Oleh karena itu dapat dihipotesis bahwa modifikasi dari konstruksi
yang akan meningkatkan efisiensi pengolahan dan ekspor transkrip primer dari nukleus ke
sitoplasma dapat menyebabkan peningkatan jumlah sel-sel yang akan memulai replikasi
virus. Dua jenis modifikasi yang dilakukan: (i) penghapusan urut fitur yang mungkin tidak
benar diakui oleh mesin pengolahan RNA (seperti situs sambatan samar dan intron-seperti
urutan kaya timin), dan (ii) penambahan intron.