Lipasa termotolerante de Penicillium sp.

Sección Gracilenta CBMAI 1583: Efecto de las

fuentes de carbono en la producción de enzimas, propiedades bioquímicas de Enzimas
purificadas y purificadas y especificidad de sustrato.

1. Introducción
Las lipasas (triacilglicerol acil hidrolasas, E.C. 3.1.1.3) constituyen una

Clase importante de enzimas que catalizan la hidrólisis de triacilglicol.

enlaces de éster de cerol en la interfaz aceite / agua (Manoel et al., 2015). Microbiano

Las lipasas destacan en el escenario industrial actual debido a su amplia

Espectro de aplicación, que puede estar relacionado con sus diversas funciones.
Además de la hidrólisis de los triglicéridos de cadena larga, estas enzimas pueden

catalizar la reacción inversa en medios orgánicos, realizando esterificación

de ácidos grasos y glicerol en triglicéridos, además de actuar sobre

transesterificación y reacciones de alcoholisis, entre otras (Tan et al.,

2015; Kumar et al., 2016).
Las lipasas son consideradas una alternativa ambientalmente amiga para

muchos procesos industriales, contribuyendo a reducir la cantidad de

Productos químicos empleados. En detergentes, pueden ser utilizados como biodegradables.
y aditivos no tóxicos, que dan como resultado residuos inocuos (Sharma et al.,
2017). En la producción y refinamiento de productos oleoquímicos, las lipasas son
Aplicado eficientemente para liberar ácidos grasos y glicerol de los lípidos.

(Ibrahim et al., 2008). En la industria alimentaria, las lipasas se aplican a

Sabor a los lácteos y en el procesamiento de carnes, verduras, frutas y

cerveza; Además, también se pueden utilizar para reducir las calorías de los lípidos mediante
transesterificación de ácidos grasos (Houde et al., 2004; Aravindan et al.,
2007). En las industrias farmacéutica y cosmética, las lipasas se utilizan para

obtener mono-, di- y triglicéridos que pueden actuar como colorantes,

Grances, y protectores solares o aditivos de maquillaje. Las lipasas también pueden ser
aplicada a la fabricación de cuero para la eliminación de lípidos (Gandhi, 1997)

Los hongos filamentosos son excelentes productores de enzimas en

Condiciones de cultivo fusionadas y en estado sólido. Lipasas De Penicillium

Las especies muestran un alto potencial en plataformas de fermentación: lipasa de

Penicillium simplicissimum se produjo con trioleína como fuente de carbono,

y la enzima purificada mostró un peso molecular de 56 kDa y

bilidad en el pH de 5 a 7 y a 50 ° C (Sztajer et al., 1992). En otra

estudios, la lipasa de P. simplicissimum se obtuvo después del estado sólido

Cultivo utilizando sustrato mixto y fuentes de nitrógeno de bajo costo.
(Gutarra et al., 2007; Vargas et al., 2008) y la enzima se purificó

e inmovilizados utilizando soportes hidrófobos bajo activaciones interfaciales.

Condiciones de cion (Cunha et al., 2009). Penicillium wortmanii fue proyectado

como el mejor productor de lipasa usando 5% (w v − 1

) El aceite de oliva como el carbono.

fuente; y la lipasa cruda presentó una actividad óptima a pH 7.0 y

45 ° C; además, la enzima era altamente estable a 40 y 45 ° C y se recuperó.

mantuvo el 55% de la actividad a 50 ° C (Costa y Peralta, 1999). Lipasa de

Penicillium restrictum se obtuvo en residuos sólidos del aceite de babassu

Industria complementada con peptona, aceite de oliva o almidón. Actividad de la lipasa
fue muy sensible al tipo y nivel de suplementación, y fue
disminuyó al aumentar el nivel de proteasa y el pH de los medios (Gombert
et al., 1999). Un análisis económico de la producción de lipasa por P. restrictum.
En fermentaciones tanto sumergidas como en estado sólido realizadas a 100 m3.
escala de producción de lipasa / año, mostró que el proceso sumergido es
económicamente inviable, con el costo unitario del producto un 68% más alto que
El precio de venta del producto, sin embargo, la fermentación en estado sólido es muy
Atractivo desde el punto de vista económico con el costo del producto 47%.
más bajo que el precio de venta, presentando 1.5 años de tiempo de amortización, 68%
retorno de la inversión de y tasa de rendimiento interno del 62% en un proyecto de 5 años
La vida (Castilho et al., 2000).
La cepa de Penicillium utilizada en este trabajo fue aislada del Atlántico.
suelo de bosque y previamente seleccionado como productor de lipasa (Tauk-Tornisielo

et al., 2005). La inmovilización se evaluó previamente utilizando

soportes drófobos, es decir, butilo- (But), fenil- (Phe) a base de agarosa y

octil-sefarosa (oct), acrílico Toyopearl (Toyo) y le-

watit VP OC 1600 (Lew) y octadecyl Sepabeads (septiembre): para obtener

Biocatalizadores altamente activos y estables. Las propiedades de los inmovilizados.

enzima se compararon con el derivado de bromuro de cianógeno que
Emula las propiedades de la enzima soluble, pero sin problemas.
causada por la interacción molecular. Los derivados fueron caracterizados.
y aplicado en reacciones para obtener ácidos grasos omega-3 y ésteres etílicos.
De aceite de pescado, un muy apreciado.

Producto en alimentos y farmaceuticos.

Industrias (Turati et al., 2017). Los objetivos de este trabajo fueron evaluar.
Las condiciones de cultivo utilizando fuentes de carbono puro y complejo para la lipasa.
Producción en cultivos sumergidos. La lipasa cruda se purificó.
Usando la estrategia de activación interfacial en la interacción hidrófoba.

La cromatografía y la enzima purificada fueron bioquímicamente caracterizadas.

actuado

2. Materiales y métodos
2.1. Microorganismo
 La cepa Penicillium se aisló del suelo de Atlantic Rainforest, en Estación Ecológica
Juréia-Itatins, São Paulo, Brasil (Ruegger y Tauk- Tornisielo, 2004), y identificado
preliminarmente como productor de lipasa. (Almeida 2013). La taxonomía morfológica y
molecular reveló que La cepa Penicillium pertenece a la sección Gracilenta; sin embargo,
fue No es posible clasificar a nivel de especie. La cepa está disponible en la Colección
Brasileña de Microorganismos Ambientales e Industriales - CBMAI / CPQBA - UNICAMP,
Paulínia, São Paulo, Brasil, bajo registro número de registro CBMAI 1583.
2.2. Mantenimiento de la cepa y preparación del inóculo.
La cepa de Penicillium se cultivó periódicamente en un 3% (w v − 1 ) agar de avena
Inclinados durante cinco días a 28 ° C y almacenados a 4 ° C. Se preparó el inóculo
suspendiendo los conidios de cultivos de cinco días de vida en destilados estériles
agua. Un mililitro de suspensión de conidios ajustado a 107.
Conidia mL-1 se utilizó para inocular los medios de cultivo.
2.3. Produccion de enzimas
Los cultivos se llevaron a cabo en matraces Erlenmeyer (125 ml) que contenían
25 ml de medio de cultivo (g L − 1

): KH2PO4 2.0, bacto-peptona 5.0, levadura

extracto 1.0, NaNO3 0.5, KCl 0.5, MgSO4 · 7H2O 0.5, aceite de oliva 10.0, pH
ajustado a 5,5 (Dheeman et al., 2011). El cultivo se realizó en

160 rpm, durante 120 hy 28 ° C. El extracto crudo se obtuvo

Parar el micelio por filtración. El filtrado se utilizó como enzima.

La fuente y la biomasa se secaron a 105 ° C hasta peso constante.

2.4. Efecto de las fuentes de carbono.

Fuentes de carbono puro (glucosa, lactosa, glicerol, ácido cítrico,

tirina, trioleína, trioctanoato y láurico, palmítico, mirístico, esteárico, oleico

y ácidos linoleicos) y triacilglicerol natural (canola, ricino, maíz,

Aceites de linaza, oliva, palma, soja y girasol, grasa de pollo, manteca de cerdo y
sebo de buey) fueron evaluados individualmente al 1.0% (w v − 1
). Ácidos grasos,
La manteca de cerdo y el sebo de res se emulsionaron previamente con 0.1% (w v − 1
)
Tween 80 bajo agitación vigorosa durante 5 min. Los controles fueron preparados
Sin fuente de carbono. El aceite de oliva se evaluó adicionalmente a 0,25%, 0,5%,
1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5% y 3.0% (w v − 1

). El cultivo se realizo

en pH 5.5, 160 rpm durante 72 horas a 28 ° C.

2.5. Influencia de la temperatura.

El cultivo se realizó a 24, 26, 28, 30 y 32 ° C; a pH 5,5,
160 rpm durante 72 h.
2.6. Actividad de lipasa y ensayos de proteínas.
La actividad de la lipasa se ensayó de acuerdo con Almeida et al. (2012),

utilizando p-nitrofenil-palmitato (Sigma-Aldrich). La reacción fue

Se eliminó en tampón de McIlvaine a pH 7,0 a 37 ° C durante 5 min e interrumpido por

choque térmico (90 ° C, 1 min) seguido de la adición de 1 ml saturado

Solución de tetraborato de sodio. El p-nitrofenolato liberado (pNP) fue
medido a 405 nm (ε = 18,033 M − 1 cm − 1

). Los controles fueron preparados

sin enzima Una unidad de actividad enzimática se definió como la
Cantidad de enzima capaz de liberar 1 μmol de producto por minuto.
La proteína se determinó con el método de Bradford modificado.

(Sedmak y Grossberg, 1977), utilizando albúmina de suero bovino como

dard Todos los ensayos se realizaron por duplicado.

2.7. Purificación enzimática por cromatografía de interacción hidrófoba.

El filtrado de cultivo se dializó frente a acetato de amonio 0,05 M

Tampón pH 6.9 (6 h, 3 cambios, 4 ° C). Después de la diálisis, la muestra fue

aplicado a la columna HiprepTM 16/10 Octyl Sepharose FF (GE Healthcare)

previamente equilibrado en el mismo tampón. El caudal se estableció en

Se recogieron 2,5 mL min − 1 y 3,0 mL de fracciones. Después de la columna de lavado
con el mismo tampón, las proteínas adsorbidas se eluyeron con 100 ml de un
0.0–1.0% (w / v) gradiente lineal Triton X-100 preparado en el mismo
buffer. Se agruparon las fracciones con alta actividad de lipasa.
2.8. Electroforesis
2.8.1. preparación de la muestra
Triton X-100 se retiró de la muestra por precipitación con
cloroformo 1: 1 (v v − 1

). Después del vórtice, las muestras se centrifugaron a

3000 rpm durante 30 min a 4 ° C. La fase superior que contiene la enzima.
Solución con menos de 0.03% (w v − 1

) Se recuperó el Triton X-100.

(Horikawa y Ogawara, 1979). El Triton X-100 residual fue adicional
eliminado con el kit de columna de centrifugado de eliminación de detergente HiPPRTM (Thermo
Fisher Scientific), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

3. SDS-PAGE La electroforesis desnaturalizante se realizó según Hames. (1987) con un

gel de apilamiento de poliacrilamida al 3,75% y 8 a 18% de polietileno. Gel de resolución
de gradiente de acrilamida. Los geles se tiñeron con 0,1%. (w v − 1 ) Coomassie Brilliant
Blue R-250 (Hames, 1990). 3.1. Zimograma La electroforesis no desnaturalizante se llevó
a cabo siguiendo Protocolo SDS-PAGE, sin embargo, el tampón de carga se preparó con
0.05% (w v − 1 ) SDS y sin β-mercaptoethanol. Apilamiento y re Los geles de solución, así
como el tampón de funcionamiento se prepararon sin SDS. Después de la ejecución, el
gel se lavó con 1% (w v − 1 ) Triton X-100 para eliminar SDS seguido de abundante
lavado con agua destilada. Los zimogramas se basaron en reacciones de hidrólisis y
esterificación. por hidrólisis, acetato de 1 y 2 naftilo (Sigma-Aldrich) se utilizaron como
Sustratos según Mueller et al. (1975) con modificaciones. los El medio de reacción estaba
compuesto por 25 mg de cada sustrato solubilizado. en 1 ml de 1-propanol y luego se
diluye a 50 ml con tampón de McIlvaine pH 7.0 que contiene 25 mg de tinte Fast Blue RR
(Sigma-Aldrich). El gel era incubado a 37 ° C hasta la visualización de las bandas y la
reacción fue Parado empapando en 7.5% (v v − 1 ) ácido acético. Para la esterificación,
un Modificación del método propuesto por Kwon et al. (2011) fue uti- lized El medio de
reacción contenía 1.5% (w v − 1 ) ácido oleico (18: 1 Δ9 ) y 1.5% (v v − 1 ) octanol en
tampón de McIlvaine pH 6.0. Para sustrato En la emulsificación, el medio se sometió a
ultrasonido durante 2 horas a temperatura ambiente. temperatura. Las bandas se
visualizaron después de la incubación del gel en este Solución para 13 h a 37 ° C
3.2. Caracterización enzimática
3.2.1. Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad y estabilidad de la lipasa.
El pH óptimo se determinó realizando ensayos de actividad en el pH
oscilan entre 2.0 y 8.5, con intervalos de 0.5 unidades, a 37 ° C. La reacción
El tiempo fue de 5 min. Se utilizaron los siguientes sistemas de tampón: 0.05 M
glicina – HCl pH 2.0–3.0; McIlvaine pH 3.0–7.5; 0.05 M Tris – HCl pH

7.5–8.5. El efecto del pH sobre la estabilidad de la enzima se analizó mediante

Asegurando la actividad residual después de incubar muestras de enzimas, previamente 1: 2

(v v − 1
) diluidos en los sistemas de tampón mencionados anteriormente, durante 24 horas a 4 ° C.

La temperatura óptima se determinó llevando a cabo una enzima

Dice en temperaturas de 40 a 80 ° C, con intervalos de 5 ° C. La reacción

El tiempo fue de 5 min. La estabilidad térmica se evaluó incubando el

Filtrado de cultivo a 40, 50, 60 y 70 ° C, sin sustratos. Alícuotas
fueron retirados periódicamente, inmediatamente transferidos a un baño de hielo
y se determinó la actividad residual. Todos los ensayos se realizaron en
duplicados Constante de desactivación térmica (Kd) y tiempo de vida media (T1 / 2)
Se calcularon a cada temperatura según las ecs. (1) y (2):
lnA lnA - = 0 dx K t (1)
donde A es actividad de lipasa en el tiempo t (min) y A0 es actividad de lipasa en
tiempo cero;
= Kd
T1 / 2 ln2

(2)

3.3. Efecto de compuestos químicos e iones.

La actividad de la lipasa se ensayó en presencia de NH4Cl, HgCl2,
CaCl2, BaCl2, CuCl2, MgSO4, MnSO4, ZnSO4 y Pb (CH3COOH), sodio
Dodecil sulfato (SDS), tetra sodio etilendiaminotetracetato
(EDTA), fenilmetanosulfonilfluoruro (PMSF), β-mercaptoetanol
y 1,4-ditiotreitol (DTT) a una concentración final de 2 y 10 mM. los

La actividad se expresó en relación con el control (sin ningún

postura).
3.4. Efecto de los surfactantes y emulsionantes sobre la estabilidad de la lipasa.
La lipasa purificada se incubó con 0.5%, 1.0% y 5.0%.
(w v − 1
) dodecil sulfato de sodio (SDS), desoxicolato de sodio, goma

Arabic, Triton X-100, Tween 20 y Tween 80, a 25 ° C sin subcomisión

estrato Después de 1 h, la actividad residual se determinó y se expresó en

Relación con el control (sin ninguna sustancia). Todos los ensayos fueron realizados
Formado en duplicado.

3.5. La cinética de enzimas

La actividad de la lipasa se ensayó con palmitato de p-nitrofenilo a
Concentraciones de 0.0 a 1.0 mM. La constante de Michaelis-Menten.
(Km) y la velocidad de reacción máxima (Vmax) se estimaron a partir del
Lineweaver-Burk plot (Lineweaver y Burk, 1934). Los experimentos
se realizaron con muestras que contenían 0.5% (w v − 1

) Triton X-100

y en ausencia de este surfactante.

4. Resultados y discusión
4.1. Producción de lipasa
Inicialmente, el curso temporal de Penicillium sp. seccion Gracilenta CBMAI
Se evaluó el crecimiento de 1583 y la producción de lipasa durante siete días.
160 rpm y 28 ° C (Fig. 1). La producción de enzimas estaba directamente relacionada con
El crecimiento microbiano, aumentando hasta el tercer día, cuando alcanzó
la producción máxima (0.849 ± 0.15 U mL − 1 y 0.223 ± 0.01 g).
La alta producción de lipasa por otras Penicillium spp se obtiene generalmente después de
cinco días de cultivo (Costa y Peralta, 1999; Vargas et al., 2008;
Dheeman et al., 2011). Después del tercer día, el crecimiento de hongos disminuye.

Probablemente esté asociada a la falta de nutrientes y / o acumulación de

de metabolitos tóxicos, y la disminución de la actividad enzimática puede ser

relacionado con un aumento en la producción de proteasas, lo que comúnmente se asocia

Ciado a la fase de crecimiento estacionario.

4.2. Efecto de las fuentes de carbono puro.

La adición de fuentes de carbono puro se evaluó para verificar si la lipasa
producción de Penicillium sp. secta Gracilenta CBMAI 1583 está bajo el
Control de promotores inductivos o constitutivos. La producción de lipasa fue
Verificado en fuentes de carbono tales como carbohidratos, alcoholes, orgánicos.
Ácidos, ácidos grasos y triacilgliceroles puros (Tabla 1). Lipasa superior
la producción fue inducida por ácido esteárico (0.585 U mL − 1

), seguido por
ácidos palmítico, oleico y mirístico (0.294, 0.133 y 0.115 U mL − 1

respectivamente). En particular, la producción de lipasa con ácido esteárico fue de 32,5 veces.

Mayor que la observada en un medio suplementado con glucosa,

Diciendo que la producción de lipasa es inducible por las fuentes de carbono lipídico.

Algunas fuentes de carbono no lipídicas, a su vez, actuaron como inductores débiles de

Producción de lipasa (0.018 U mL − 1

–0.056 U mL − 1

). Estos resultados sugieren

que la producción de lipasa por esta cepa fúngica es inducida por la cadena larga
ácidos grasos. Fojan et al. (2000) relataron que las esterasas se rompen preferentemente.
enlaces éster de ácidos grasos de cadena corta, mientras que las lipasas muestran mucho

Gama más amplia de sustratos que las esterasas. El estado físico de los sub-
El estrato es un factor probable que contribuye a la especificidad del sustrato.

Los ácidos grasos de cadena larga son típicamente insolubles o al menos poco solubles.
Así, la lipasa debe poder identificar insolubles o fuertemente agregadas.
sustratos Dado que la lipasa es activa hacia sustratos agregados, la lipasa
la actividad está directamente relacionada con el área total del sustrato y no con la
Concentración de sustrato (Verger, 1997).

Una posible relación entre la producción de lipasa y la cadena de ácidos grasos.

También se evaluó la longitud y el nivel de insaturación (Fig. 2). Pro lipasa
la inducción fue inducida por ácidos grasos saturados de cadena larga, por ejemplo, esteárico

y ácidos palmíticos (C18: 0 y C16: 0, respectivamente), mientras que 12 y 14

ácidos grasos saturados de carbono, así como linoleico insaturado (C18: 2) y
Los ácidos oleicos (C18: 1) dieron como resultado una baja producción de lipasa. Un análisis de la
Los parámetros de fermentación indicaron la eficiencia de las grasas saturadas.
ácidos en la producción de lipasa; ya que el ácido esteárico mostró YP / X 76.50 U.g
de biomasa − 1 y PL 1.10 U.g de biomasa − 1 h − 1

, seguido de palmítico

ácido (YP / X = 27.38 U.g de biomasa − 1

; PL = 0.76 U.g de biomasa − 1

h−1
). Actividades específicas, medidas para purificación adicional de enzimas.
procedimientos, fue mayor en el cultivo con ácido esteárico (0.265 U.μg de
proteína − 1
), seguido de ácido palmítico (0,150 U μg de proteína − 1
).

4.3. Efecto de las fuentes de carbono complejas.

Cuando se evaluaron complejos triacilgliceroles para la producción de lipasa
(Fig. 3), el aceite de oliva fue el mejor inductor natural para la producción de lipasa.
(1.139 U mL − 1

), seguido de aceite de linaza (0,865 U mL − 1

). Bajo estas
En estas condiciones, los valores más altos usando aceite de oliva también se observaron
Actividad específica (1.62 U μg de proteína − 1

), rendimiento de lipasa en biomasa

(115.96 U g de biomasa − 1

) y productividad (0.324 U g de biomasa − 1

h−1
) (Tabla 2). El aceite de linaza presentó valores de actividad específica (1.03
U.μg de proteína − 1
), rendimiento de lipasa en biomasa (86.859 U g de biomasa − 1
)

y productividad (0.264 U g de biomasa − 1 h − 1

) (Tabla 2). Micelial

El crecimiento no difirió entre los cultivos con diferentes

Cilgliceroles (no mostrados), lo que indica que esta variedad pudo usar

Estos materiales complejos como fuentes de energía y carbono. El aceite de oliva es

ampliamente reconocido como un buen inductor para la producción de lipasa debido a la alta
concentración de ácido oleico (~ 80%) y otros compuestos lipídicos, por ejemplo,
Vitaminas y tocoferoles, que suelen estimular el crecimiento microbiano.
y la producción de lipasa por hongos filamentosos y levaduras (Almeida et al.,
2012). El aceite de linaza presenta aproximadamente un 20% de ácidos grasos insaturados.
(18: 1, ácido oleico 18: 2, ácido linoleico) y 53% de ácido graso poliinsaturado
(18: 3, ácido linolénico). Estos ácidos grasos (18: 1 y 18: 2) mostraron
Disminución moderada en la producción de lipasa cuando se evalúa grasa pura.
Ácidos para la producción de lipasa. En consecuencia, otras fuentes de triacilgliceroles
tales como aceites de mayze, canola, soja, girasol, ricino, palma
que también presentan altos niveles de ácido linoleico (18: 2) y ácido oleico (18: 1) en

su composición, pueden haber contribuido a disminuir el pro-

Conducción por Penicillium sp. secta Gracilenta CBMAI 1583. Almeida et al.

(2012) también verificaron una disminución en la producción de lipasa por Candida viswa-
nathii usando aceite de linaza bajo condiciones sumergidas. En esa obra, la C.

La cepa viswanathii no produjo lipasa usando ácido linoleico. aceite de castor

Se considera un inhibidor de la producción de lipasa debido a la acción anti-nutricional.
Efecto del ácido ricinoleico (90% de la composición total) e insaturado.
Ácido graso omega-9 que mantiene en su estructura un hidroxilo inusual.
Vinculado al 12-carbono. Teniendo en cuenta que el sebo y la manteca de res son sólidos en

temperatura ambiente, la emulsión mecánica no pudo promover un

la dispersión de estos sustratos en el medio líquido, dando como resultado

Baja producción de lipasa.

La producción de lipasa se vio fuertemente afectada por la concentración de lípidos en
El medio (fig. 4). Baja concentración de lípidos en el medio no puede
Apoyar el crecimiento celular y la producción de enzimas debido al rápido consumo de

fuente de carbono por el hongo; Por otro lado, alta concentración lipídica.
puede causar la represión de la producción de lipasa debido al exceso de

ácidos grasos libres en el cultivo o debido a la transferencia de oxígeno más débil a la

medio, que puede alterar el metabolismo de los hongos y, por consiguiente,

Producción de pases (Elibol y Ozer, 2000). La producción de lipasa por Pe-
nicillium sp. sección Gracilenta CBMAI 1583 utilizando medios con diferentes

La concentración de lípidos mostró que los valores más altos se encontraron con
0.5% de aceite de oliva (1.62 U mL − 1
). Este resultado muestra un aumento de 1,82 veces en
Producción de lipasa. En estas condiciones, los parámetros de fermentación.
también fueron más altos en comparación con las otras concentraciones de lípidos (YP / X =
354.65 U g − 1
; PL = 4.92 U g de biomasa − 1 h − 1 y actividad específica de
1.83 U μg de proteína − 1

). Así, una alta concentración de aceite de oliva en el

El medio de cultivo aumenta la biomasa pero disminuye la producción de lipasa.
4.4. Purificacion de lipasa
El filtrado extracelular dializado de Penicillium sp. sección
Gracilenta CBMAI 1583 producido en condiciones optimizadas fue
sometido a cromatografía en octil sefarosa usando acetato de amonio
buffer. La mayoría de las proteínas no diana se eluyeron en las fracciones iniciales,

y la elución de proteínas unidas se realizó con un Triton X-

Gradiente de 100 Las fracciones que presentaban alta actividad de lipasa se agruparon.

y sometido a electroforesis no desnaturalizante y SDS-PAGE. Por

Siguiendo este procedimiento cromatográfico, purificación parcial del
Se obtuvo lipasa, y dos bandas de proteína (65.4 y 52.9 kDa) pudieron
Observarse en el gel (fig. 5). Un zimograma realizado con esta muestra.
mostró que ambas enzimas hidrolizaron el acetato de α y β naftilo, mientras que
solo la proteína de 52,9 kDa presentó actividad de esterificación en octilo
oleato En este sentido, se puede concluir que el hongo produce una
65,4 kDa esterasa y una lipasa de 52,9 kDa con especificidad reducida, ya que
esta enzima podría hidrolizar los ésteres de cadena corta y esterificar la cadena larga
ácido graso y octanol (tabla 3).

Ambas enzimas presentaron propiedades similares en términos de hidro-

Fobicidad y MW, luego, se realizó otra etapa cromatográfica.

Para purificar esta lipasa. El extracto dializado se sometió a fenilo.

Cromatografía de sefarosa utilizando un tampón de acetato de amonio (0,05 M,
pH 6.9). La elución de proteínas unidas se realizó con un Tritón al 0,75%.
Gradiente X-100. Las fracciones con alta actividad de lipasa se agruparon y
presentado a SDS-PAGE (Fig. 6). La enzima fue purificada con 80.8%.
Rendimiento y enriquecimiento de 516 veces (Tabla 4). Almeida et al. (2016) utiliza un

paso de purificación similar para aislar una lipasa producida por Candida vis-
Wanathii. Después de seleccionar la resina octil sefarosa y amonio 0,02 M

tampón de acetato pH 6.9 como condiciones iniciales, dos picos de proteínas se

Sponding a proteínas no unidas eluyó en las fracciones iniciales y la

segundo pico eluido con 1.0% (w w − 1

) Triton X-100 con alta lipolítica

actividad. En ese proceso, la purificación enzimática presentó un rendimiento del 84.5%.

y enriquecimiento 47.0 veces. El uso de resinas hidrófobas como afinidad.

Un proceso similar para purificar las lipasas es posible debido a la activación interfacial.

fenómeno que se produce en presencia de sustratos naturales gotas, al-

baja adsorción de estas enzimas a la interfaz hidrófoba a través de una
área muy hidrófoba formada por la cara interna de la tapa y / o
entorno del sitio activo (Bastida et al., 1998; Manoel et al.,
2015).
4.5. Caracterización enzimática
4.5.1. Actividad de pH y estabilidad.
Los efectos del pH y la temperatura sobre la lipasa cruda y purificada.
se presentan en la Fig. 7. Se observó una actividad óptima en pH 4.0, y

el aumento del pH a condiciones alcalinas disminuyó gradualmente

Actividad hasta pH 8.5 (Fig. 7a). Actividad óptima en el rango de pH 4.0 - 6.0

También se encontraron para la lipasa de Penicillium simplicissimum, Peni-

Cillium chrysogenum y Penicillium roqueforti (Mase et al., 1995;

Bancerz et al., 2005; Gutarra et al., 2009). Sin embargo, las especies de Penicillium
Con frecuencia produce lipasas alcalinas con actividad óptima en el pH.
van de 7.0 a 9.0 (Druet et al., 1992; Pimentel et al., 1994; Lima
et al., 2003; Tan et al., 2004; Menoncin et al., 2010).

La estabilidad de la lipasa cruda y purificada se evaluó por

muestras de enzimas en cubos a diferentes pH en ausencia de sustrato para

24 h a 4 ° C. La enzima cruda retuvo completamente su actividad en el rango de pH

de 5.0 a 7.0, mientras que en los rangos de pH 2.0–4.5 y 7.5–8.5 la actividad
Se mantuvo entre el 80% y el 90%. La enzima purificada era completamente estable.
en un rango de pH más amplio (de pH 2.5 a 7.5) y actividades no inferiores a
El 80% se verificó en pH 2.0, 8.0 y 8.5 (Fig. 7b). Estabilidad en pH ácido.
Es muy importante para la aplicación industrial en el sector de productos oleoquímicos en
que la hidrólisis del triacilglicerol se produce en condiciones alcalinas y
requiere la acidificación de los jabones formados para obtener ácidos grasos (Lee y
Foglia, 2000). Además, la actividad hidrolítica y la estabilidad en ácido.

Las condiciones pueden ser consideradas como una ruta alternativa sin la
Clasificación del jabón formado para obtener ácidos grasos.
4.6. Actividad de temperatura y estabilidad.
La actividad de la lipasa se evaluó de 40 a 80 ° C (Fig. 8). Lipasa bruta
actividad máxima presentada a 70 ° C; mientras que la lipasa purificada presentada

Actividad máxima a 65–70 ° C. A 50 ° C, la enzima presentó 80% de

su actividad, mientras que por encima de 70 ° C la actividad disminuyó bruscamente. Esta operación
la temperatura del tiempo es más alta que la de otras lipasas de Penicillia tales

como el de Penicillium simplicissimum producido bajo cultivo de estado sólido.

tivación, que presenta una actividad máxima a 45–50 ° C (Gutarra et al.,

2009) o la de Penicillium aurantiogriseum con actividad óptima en

60 ° C. Según Sharma et al. (2001), la mayoría de los pro-

Los procesos en los que se pueden emplear lipasas funcionan por encima de los 45 ° C, entonces,

La enzima que se pretende aplicar debe exhibir una actividad óptima alrededor de
50 ° C.
Se realizó inactivación térmica de la lipasa cruda y purificada.
incubando muestras de enzimas sin sustrato a 40, 50, 60 y
70 ° C. Ambas formas de enzimas eran completamente estables hasta 40 ° C. Encima de esto
temperatura, se observó un patrón de inactivación bifásica, como se describe
por un modelo cinético de primer orden para la inactivación de enzimas, indicando el
Presencia de regiones termolábiles y termoestables en la enzima.
estructura (no se muestra). Los parámetros Kd y T1 / 2 de la enzima.
mostró que la enzima cruda era 22, 11 y 12 veces más estable
que la enzima purificada a 50, 60 y 70 ° C, respectivamente (Tabla 5).
4.7. Efecto de los compuestos químicos e iones metálicos sobre la actividad enzimática.
El efecto de los iones y otros compuestos químicos sobre la actividad de
la lipasa purificada se muestra en la Tabla 6. En general, la mayoría de las sustancias químicas
los compuestos a 2 mM no mostraron ninguna influencia sobre la actividad enzimática.
Excepcionalmente, los detergentes no iónicos como Tween 20 y Tween 80
activó la enzima en un 15%, mientras que PMSF inhibió la actividad enzimática por
57%. A 10 mM, EDTA DTT también mostró un ligero efecto negativo en
Actividad enzimática. PMSF fue un inhibidor fuerte y SDS completamente desnaturalizado
la enzima

A 2 mM, Ba2 + era un activador fuerte, mientras que Ca2 + era un inter-
Inhibidor mediato. Mn2 +, Mg2 +, NH4 +, Na + y Co2 + activados por 10

- 20% la lipasa de Penicillium sp. seccion Gracilenta CBMAI 1583.At

10 mM, el efecto inhibidor de Ca2 + fue mucho más pronunciado, y el
la actividad estaba casi totalmente agotada; Además, mostró un opuesto.
Efecto Co2 + inhibiendo parcialmente la enzima mientras que tanto Hg2 + como Zn2 +
Fueron inhibidores fuertes. Entre los iones monovalentes, solo NH4Cl y NaCl
A ambas concentraciones presentó un ligero efecto estimulante.

El efecto de diferentes iones y compuestos químicos varía

considerablemente entre diferentes lipasas y cualquier generalización puede ser bastante

difícil. En general, el Ca2 + estimula la actividad de las lipasas según lo verificado

los de Penicillium candidum (Bancerz et al., 2005), Penicillium

Chrysogenum (Li y Zong, 2010). Sin embargo, al igual que nuestro trabajo, el P. aur-
La lipasa antiogriseum fue inhibida por este ion, así como por otros divalentes.

Cationes como Cu2 + y Ba2 + (Lima et al., 2003). Hg2 + inhibe nu-
Enzimas numerosas, incluyendo muchas lipasas. Este efecto está asociado a su

interacción con grupos tiol de cisteína, que puede ser importante para
Catálisis (Sugihara et al., 1996).
4.8. Efecto de los disolventes orgánicos sobre la actividad enzimática.
Los disolventes orgánicos son ampliamente utilizados en reacciones con lipasas porque
Facilitan la manipulación de sustratos hidrófobos, y pueden
También modular y / o mejorar la actividad y selectividad de las lipasas.
El efecto de los disolventes orgánicos sobre la estabilidad de la lipasa purificada es
mostrados en la Tabla 7. Los solventes se clasificaron de acuerdo con el aumento de
log P, que es el coeficiente de partición del disolvente entre n-octanol

y el agua, un parámetro cuantitativo útil para representar las

Naturaleza fóbica o hidrófila de una sustancia (Sangster, 1989). Por lo tanto, la

cuanto más negativo sea el valor log P, más hidrófila es la sustancia,

y viceversa.
La enzima fue estable en la mayoría de los solventes, reteniendo más del 70% de
Actividad después de la incubación durante 1 hora a 25 ° C. Con n-butanol y xilol el
La enzima mostró una pérdida de actividad del 62,1% y 63,7%, respectivamente. En general,
Los disolventes polares son más desestabilizadores para la estructura de las proteínas debido al agua.
Eliminación de la capa de hidratación, que ayuda a proteger la enzima.
Estructura nativa (Castro-Ochoa et al., 2005). Cabe destacar que el Penicillium sp.
La lipasa CBMAI 1583 era más estable que la lipasa de P. aurantiogriseum

que es poco estable cuando se incuba en metanol, etanol, 1-pro-

Panol, acetona y n-butanol durante 1 hora a 28 ° C (Lima et al., 2003).

Disolventes más hidrófobos como n-hexano (log P = 3.50) y

isooctano (log P = 4.51) actividad de lipasa ligeramente estimulada. Esta en-

pliegue puede estar asociado a una activación interfacial de la lipasa en el

presencia de superficies hidrófobas, que altera el equilibrio entre

Las formas abiertas y cerradas de la enzima, lo que hace que la estabilización a la
Cambios de forma abierta en el sustrato y la solubilidad del producto en la reacción.
medio (Guncheva y Zhiryakova, 2011). Activación de lipasa en la
También se verificó la presencia de disolventes hidrófobos para las lipasas de
P. aurantiogriseum (Lima et al., 2004) y P. chrysogenum (Bancerz et al.,

2005). Se pudo observar una relación entre el registro de datos.

lues y la actividad lipasa residual, pero la estabilidad en diversos orgánicos

Los solventes sugieren el uso de esta enzima en reacciones no acuosas.

Medios tales como para la síntesis orgánica.
4.9. Especificidad para sustratos.
La especificidad para los sustratos de la lipasa purificada se estudió usando
Sustratos de ésteres de p-nitrofenil-alquilo de varias longitudes de cadena (Fig. 9). los
La actividad más alta se verificó con decanoato de p-nitrofenilo. La actividad
en laurato, palmitato y estearato ésteres de p-nitrofenilo estaban alrededor

80–90%, mientras que el 66% de la actividad se verificó contra p-nitrofenilo

miristato La actividad contra los ésteres de cadena corta no pudo ser evaluada.
Debido a la hidrólisis de los sustratos espontáneos en las condiciones de ensayo. los
la especificidad para sustratos de diferentes lipasas es variable, es decir, mientras que P.
La candidasa lipasa tiene preferencia por los ácidos grasos de cadena larga p-nitrofenilo.
ésteres (C16) (Ruiz et al., 2001), la lipasa de P. roqueforti tiene preferencia por
ésteres p-nitrofenílicos de cadena corta (C4 y C6) (Mase et al., 1995).

4.10. Cinética de la lipasa purificada.

Las reacciones de hidrólisis del sustrato se llevaron a cabo para

Pase con p-NPP (0.0–1.0 mM) para determinar Km y Vmax. A partir de estos

valores, el número de facturación (kcat) y la eficiencia catalítica (kcat / Km)

en presencia y ausencia de Triton X-100 (0.5% w.v − 1

) fueron calculados

(Tabla 8). La hidrólisis p-NPP en presencia y ausencia de Triton X-

100 presentaron una curva hiperbólica siguiendo la clásica
Modelo menten. Algunas lipasas siguen el modelo de Michael como se observa.

para los de Rhizopus oryzae, Mucor miehei, Candida rugosa, Candida

antártica A, mientras que otras como las de Thermomyces lanuginosus
y Penicillium camemberti presentan curvas no hiperbólicas sigmoidales
(Nini et al., 2001).
La enzima, en ausencia de Triton X-100, mostró Km 0.024 mM,
Vmax 1281 μmol.min − 1

.mg de proteína − 1

, kcat 1129.4 s − 1 y kcat / Km

4.7 × 107 M − 1 s
−1
, mientras que en presencia de Triton X-100 se observó

Km 0.018 mM, Vmax 1050.4 μmol min − 1

.mg de proteína − 1

, kcat 886.3 s − 1

y kcat / Km 4.9 × 107 M − 1 s

−1
. Schaffner et al. (1978) relataron que
Los experimentos cinéticos en diferentes concentraciones de Triton X-100 indican

que se requiere una proporción aparentemente óptima de detergente: sustrato para

Mantener las tasas máximas de hidrólisis. Un exceso de detergente resulta en com-
inhibición petitiva de la enzima, mientras que cantidades subóptimas de
Los tergentes también reducen la velocidad de hidrólisis. El surfactante excesivo puede

actuar como un inhibidor competitivo por dos razones: (1) una cantidad dada de

Sustrato distribuido sobre las superficies de un mayor número de

Celles disminuye su concentración efectiva y por lo tanto la tasa de enzima

interacción sustrato a nivel molecular; (2) unión reversible de la

El sitio activo de la enzima al detergente puede ocurrir. Redondo et al. (1995)
estudió el efecto de Triton X-100 en las lipasas A y B de Candida
rugosa. Parámetros cinéticos para el experimento realizado en el molar.
fracción de fijación de sustrato y la concentración en masa de sustrato y
Triton X-100 fue variado, un comportamiento similar a Michaelis-Menten fue
observado con ambas lipasas; la curva de ajuste dio valores de kcat / km de
3.0 × 105 y 5.6 × 105 s

-1 M-1 para las lipasas A y B, respectivamente.

5. Conclusiones
En este trabajo, la producción de lipasa por Penicillium sp. sección

Gracilenta CBMAI 1583 fue casi 2 veces mayor al estudiar

Condiciones de cultivo y cultivo. Estudios iniciales de purificación revelados.
el hongo produce una enzima de 65.4 kDa con actividad esterasa y una

52.9 kDa de enzima con actividad lipolítica. La purificación de lipasa fue

cessful usando cromatografía de fenil sefarosa bajo condiciones interfaciales
dition La enzima purificada es óptimamente activa en pH ácido (4.0) y

Altas temperaturas (70 ° C). La enzima presenta baja especificidad,

Drolizar ésteres de p-nitrofenilo con una longitud de cadena de 10 a 18 carbonos.

La actividad máxima se observó con decanoato de p-nitrofenilo,

una posible preferencia por p-nitrofenilo es-
ters Las características observadas indican potenciales aplicaciones industriales.
en procesos que operan en pH ácido, como el tratamiento de lácteos y

efluentes de la industria, resolución de ésteres en la industria farmacéutica o

En la industria alimentaria. La estabilidad de la lipasa en disolventes orgánicos también.
Sugiere que esta enzima es candidata a actuar en síntesis orgánica.
Reacciones en medios no acuosos.

Expresiones de gratitud
Los autores agradecen a São Paulo Research
Fundación - FAPESP, Brasil, por la beca otorgada a la primera.
autor y Ministerio de Ciencia e Innovación de España - MICINN, España
(Proyecto BIO-2012–36861).
Conflictos de interés
Los autores confirman que no existen conflictos de interés conocidos.

asociado con esta publicación y no ha habido ninguna fi-

Apoyo financiero para este trabajo que podría haber influido en su resultado.