LAPORAN PPDH GELOMBANG XXII

PENGUKURAN TITER ANTIGEN DAN ANTIBODI VIRUS NEWCASTLE DISEASE

(ND) PADA SPESIMEN DARAH AYAM LAYER DAN SERUM DARAH MENTHOK
DENGAN UJI ELISA
PERIODE 17 – 26 MARET 2014

Oleh :

Kelompok IV:
Diar Riztiardhana 061323143020
Dedi Meldiarsani 061323143022
Novia Cahya Andina 061323143023
Habib Syaiful AT. 061323143024
Syahrial K. Bimantaka 061323143028
Ria Sylviana S. 061323143031
Wining Astini 061323143038
Ndariani Masziah 061323143061
Yana Pangestu 061323143067
Mutiaratih Kusumo D. 061323143070

DEPARTEMEN MIKROBILOGI VETERINER

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
UNIVERSITAS AIRLANGGA
2014
 2

I. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Enzyme-linked Immunosorben Assay (ELISA) merupakan salah satu uji
serologik yang saat ini banyak dimanfaatkan secara luas untuk keperluan riset,
diagnosis maupun pengujian berbagai jenis analit. Teknik ELISA pertama kali
dilaporkan oleh Eva Engvall dan Peter Perlmann dari Universitas Stockholm di
Swedia pada tahun 1971 untuk mengukur kadar imunoglobulin (Ig) kelinci.
Sejak teknik ELISA ditemukan, ELISA banyak diterapkan sebagai
teknik pada endokrinologi, imunopatologi, hematologi, mikrobiologi,
parasitologi, biologi molekuler dan berbagai bidang ilmu yang berkaitan dengan
imunologi

1.2. Permasalahan
Ayam layer dari suatu peternakan berumur 47 minggu berasal dari satu
kandang, terakhir kali diberi vaksin pada tanggal 20 februari 2014. Tanggal
sampel diterima pada 12 Maret 2014. Yang ingin diketahui dari uji ELISA adalah:

1. Berapa titer antibodi yang dapat diketahui dari hasil uji ELISA dengan
spesimen darah ayam layer tersebut?
2. Apa serum ayam layer yang diuji dengan teknik ELISA memiliki titer antibodi
yang protektif terhadap virus ND?
3. Apakah uji HI ataukah ELISA, uji serologis yang paling tepat untuk uji ND?

1.3. Tujuan
Enzyme-linked Immunosorben Assay (ELISA) memiliki banyak sekali
tujuan, dan dibandingkan dengan uji serologis lainnya ELISA memiliki beberapa
keunggulan. Deteksi Antigen, virus dapat dideteksi secara utuh karena berbentuk
partikel yang sangat kecil, tetapi agen infeksius lainnya, seperti bakteri, parasit
atau jamur hanya dapat dideteksi jika telah dipecah menjadi partikel subunit.
Deteksi Antibodi, antibodi terhadap berbagai jenis agen infeksius
maupun non-infeksius dapat dideteksi dengan ELISA. Pengujian antibodi hasil
vaksinasi dapat dilakukan dengan teknik indirect-ELISA. Antibodi hasil infeksi
dapat dideteksi dengan teknik competitive-ELISA atau capture-ELISA.
 3

Beberapa tujuan uji ELISA lainnya adalah untuk menentukan kadar

antigen dan antibodi, stadium penyakit, kadar Ig E dan histamin pada penderita
alergi, subklas imunoglobulin, antibodi asal infeksi atau hasil vaksinasi, penentuan
serotype spesifik, penentuan spesies asal daging.

1.4. Manfaat
Uji ELISA ini berkemampuan untuk menguji analit dalam jumlah kecil
dan memiliki sensitivitas yang sangat tinggi untuk mendeteksi analit yang tidak
diketahui. Di bidang kesehatan dan kedokteran hewan secara luas dipakai untuk
mendeteksi antigen atau antibodi pada berbagai jenis penyakit (infeksius, non-
infeksius, kanker, autoimun), vektor penyakit, hormon, alergen atau kontaminan
makanan, pemalsuan daging, deteksi dini kebuntingan ataupun toksikologi pada
obat-obat tertentu. Di bidang pertanian banyak dimanfaatkan untuk mendeteksi
residu antibiotik, pestisida, toksin dan patologi tanaman.

II. MATERI DAN METODE

2.1. Bahan
 Larutan PZ
 Eritrosit 5%
 Creamer (Blocking Water)
 Antibody (anti chicken)
 Antibody standart
 Antibody anti-ND

2.2. Alat
Alat-alat yang diperlukan untuk pengujian ELISA antara lain berupa:
 Mikroplat ELISA
 Pipet multichannel 20-200 µl
 Pipet mikro 20-200 µl
 Pipet mikro 0,5-10 µl
 Pipet ukur berbagai ukuran
 Gelas ukur 100 ml
 Erlenmeyer 100 ml
 4

 Becker glas 50 ml
 Botol media
 Timbangan digital
 Inkubator
 Yellow tip
 Mesin ELISA reader dan perangkat komputer.

2.3. Spesimen
 Serum ayam layer

2.4. Metode
 Siapkan mikroplet ELISA
 Buat larutan yang mengandung antigen newcastle disease dengan kadar 1 HA
unit/100µl dalam pelarut bufer karbonat (coating buffer) sebanyak 10 ml
 Masukan larutan tersebut pada semua well masing-masing sebanyak
100µl/well
 Tutup permukaan mikroplat dengan plastik kemudian inkubasi pada suhu
37°C selama 1 jam
 Cuci masing-masing well dengan buffer pencuci(washing buffer) masing-
masing sebanyak 200µl/well sebanyak 3 kali
 Masukkan buffer blocking 4% (mengandung creamer 4%) pada semua well
masing-masing sebanyak 200µl/well
 Tutup permukaan mikroplat dengan plastik kemudian inkubasi pada suhu
37°C selama 1 jam
 Cuci masing-masing well dengan buffer washing masing-masing sebanyak
200µl/well sebanyak 3 kali
 Buat larutan mengandung anti-ND standart dalam pelarut bufer blocking 1%
mengandung creamer 1%
 Masukkan larutan anti body standart masing-masing sebanyak 100µl/well
pada kolom 11 dan 12 (pengerjaan secara duplo) mulai dari well A sampai
well H dari pengenceran tinggi sampai rendah. Masukkan pula kontrol
negatif pada kolom 10 dari well A sampai H
 Encerkan sampel serum yang akan diperiksa pada pengenceran 1:10 dengan
buffer blocking 1%
 Masukkan sampel serum masing-masing sebanyak 100µl/well pada kolom 1
sampai 8 tergantung jumlah sampel
 Masukkan larutan buffer blocking 1% sebagai kontrol PZ masing-masing
100µl/well pada kolom 9 mulai well A sampai H
 5

 Tutup permukaan mikroplat dengan plastik,ikubasi pada suhu 37° selama 1

jam
 Cuci masing-masing well dengan buffer washing masing-masing sebanyak
200µl/well sebanyak 3 kali
 Tambahkan larutan anti body anti chicken yang berlabel enzim alkali
fosfatase dan telah diencerkan dengan buffer blocking 1% pada pengenceran
1:4000 pada semua well masing-masing sebanyak 100µl/well
 Tutup permukaan mikroplat dengan plastik,ikubasi pada suhu 37° selama 1
jam
 Cuci masing-masing well dengan buffer washing masing-masing sebanyak
200µl/well sebanyak 3 kali
 Tambahkan substrat p-NPP (1mg/ml) yang telah dilarutkan dalam buffer
substrat pada semua well masing-masing sebanyak 100µl/well dan di
inkubasi selama 30 menit
 Tambahkan larutan penghenti atau stoper 3N NaOH pada semua well
masing-masing sebanyak 50µl/well
 Baca mikroplat pada elisa reader pada panjang gelombang 405 nm
 Buat rata-rata nilai optical density (OD) pada masing-masing larutan anti
body standart maupun sampel
 Bandingkan titer anti body pada pemeriksaan Hi dan ELISA

III.HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1. Hasil
Tabel 1. ELISA Reader dengan panjang gelombang 405 nm.
A B C D E F G H
7 0.039 0.047 0.218 0.215 0.387 0.615 0.652 0.651
8 0.039 0.085 0.155 0.240 0.380 0.602 0.548 0.649
9 0.458 0.432 0.394 0.03 0.532 0.465 0.467 0.489
10 0.447 0.474 0.418 0.509 0.559 0.467 0.476 0.525
11 0.519 0.511 0.487 0.533 0.552 0.501 0.455 0.511
12 0.576 0.508 0.527 0.575 0.609 0.552 0.500 0.525
 6

Gambar 1. Hasil uji ELISA

3.2. Pembahasan
OD K (+) = 0,651+0,649+0,652+0,548 = 0,625
4
OD K (-) = 0,615+0,387+0,602+0,380 = 0,496
4

OD Sampel 1 = 0,525+0,511+0,525+0,489 = 0,5125

4
OD Sampel 2 = 0,500+0,455+0,476+0,467 = 0,4745
4
OD Sampel 3 = 0,552+0,501+0,467+0,465 = 0,49625
4
OD Sampel 4 = 0,609+0,552+0,559+0,532 = 0,563
4
OD Sampel 5 = 0,575+0,533+0,509+0,503 = 0,53
4
OD Sampel 6 = 0,527+0,487+0,418+0,394 = 0,4565
4
OD Sampel 7 = 0,508+0,511+0,479+0,432 = 0,48125
4
OD Sampel 8 = 0,576+0,519+0,447+0,459 = 0,50025
4
 7

Penghitungan s/p menggunakan hasil OD (Optical Density) diatas didapatkan

beberapa yang negative, maka diganti dengan menggunakan OD kontrol yang
terkecil dan OD sampel terbesar, maka hasil perhitungan s/p :
s/p 1 = 0,525 – 0,380 = 0,863095238
s/p = OD Sampel – OD K (-)
0,168
OD K (+) – OD K(-)
s/p 2 = 0,500 – 0,380 = 0,714285714
0,168
s/p 3 = 0,552 – 0,380 = 1,023809524
0,168
s/p 4 = 0,609 – 0,380 = 1,363095238
0,168

s/p 5 = 0,575 – 0,380 = 1,160714286

0,168
s/p 6 = 0,527 – 0,380 = 0,875
0,168
s/p 7 = 0,511 – 0,380 = 0,779761904
0,168
s/p 8 = 0,576 – 0,380 = 1,16666667
0,168

Dari hasil tersebut, kemudian dilanjutkan dengan menghitung titer antibody

dengan rumus = 1.09 (log s/p) + 3.36 dan hasilnya di anti-log. Maka ditemukan
hasil:
Titer sampel 1 = 1775.870004
Titer sampel 2 = 1587.524516
Titer sampel 3 = 2350.384369
Titer sampel 4 = 3210.951567
Titer sampel 5 = 2694.949363
Titer sampel 6 = 1980.56353
Titer sampel 7 = 1746.781544
Titer sampel 8 = 2710.016909
Keterangan: Standart ELISA – ND positif jika s/p ≥ 0.2 atau titer ≥ 396, negative jika
≤ 0.2 atau titer ≤ 396, protektif jika s/p ≥ 1 atau titer ≥ 2290
 8

Tabel 2. Perbandingan uji HI dan ELISA terhadap titer ND

Sampel Titer HI - ND Titer ELISA –ND
1 26 1775.870004
2 26 1587.524516
3 27 2350.384369
4 27 3210.951567
5 26 2694.949363
6 25 1980.56353
7 26 1746.781544
8 26 2710.016909
Keterangan : warna merah menunjukkan titer protektif terhadap ND

IV. KESIMPULAN
4.1. Kesimpulan
Dari hasil uji ELISA pada serum ayam layer yang telah diberi vaksin ND, vaksin
nomer 3, 4, 5, dan 8 menunjukkan titer yang protektif terhadap virus ND.
Dari data yang didapat dari perbandingan uji HI dan ELISA terhadap titer ND
diperoleh hasil yang terbaik pada uji HI karena semua sampel yang di dapat
protektif. Dan karena virus ND (paramyxovirus) memiliki protein structural
(hemaglutinin) yang berfungsi untuk perlekatan virus ke sel host maka uji HI
merupakan uji yang terbaik untuk pemeriksaan virus ND.

4.2. Saran
Untuk pengerjaan uji ELISA di harapkan lebih aseptis