Anda di halaman 1dari 7

Formalin Embeding Pengambilan Antigen di Formalin-tetap, parafin-tertanam

Jaringan: Metode Peningkatan untuk


Pewarnaan Imunohistokimia Berbasis Microwave
Bagian Oven Pemanasan Jaringanjaringan, antigen retrival pada fiksasi formalin

Kami menggambarkan pendekatan baru untuk pengambilan antigen dari jaringan yang terikat
formalin, parafin, dan selanjutnya
pewarnaan dengan teknik imunohistokimia. Metode pengambilan antigen ini didasarkan pada
pemanasan gelombang mikro dari bagian-bagian jaringan yang melekat pada slide mikroskop
hingga suhu hingga 100 ı dengan adanya larutan logam. Di antara 52 antibodi monodonal dan
polydonal diuji dengan metode ini, 39 antibodi menunjukkan peningkatan yang signifikan
dalam imunostaining, sembilan antibodi menunjukkan tidak ada perubahan, dan empat
antibodi menunjukkan penurunan immunostaining. Secara khusus, hasil immunostaining
yang sangat baik diperoleh dengan antibodi monodonal terhadap vimentin serta beberapa
berbeda. Antibodi keratin pada bagian-bagian jaringan tetap formalin rutin setelah pra-
perawatan slide dengan metode ini. Hasil ini menunjukkan bahwa setelah pengambilan
antigen: (a) predigestion enzim dari jaringan dapat dihilangkan; (B) waktu inkubasi antibodi
primer dapat dikurangi secara signifikan, atau pengenceran antibodi primer dapat
ditingkatkan; (c) pewarnaan yang memadai dapat dicapai dalam jaringan formalin-tetap
jangka panjang yang gagal diwarnai dengan metode konvensional; dan (d) antibodi tertentu
yang biasanya tidak reaktif dengan jaringan yang terikat formalin memberikan pewarnaan
yang sangat baik. (Jhisrochem Cytochem 39: 741-748, 1991)

pengantar
Meningkatnya minat dalam prosedur pewarnaan imunohistokimia telah menyebabkan
pengembangan berbagai imunostains sangat spesifik yang bernilai bagi ahli patologi bedah
dalam studi diagnostik dan investigasi (1,2). Meskipun formalin tetap menjadi fiksatif yang
paling populer digunakan dalam patologi, jelas bahwa fiksatif ini tidak selalu merupakan
pilihan terbaik untuk menjaga antigenisitas jaringan yang akan digunakan dalam prosedur
imunohistokimia. Meskipun banyak penelitian tentang ikatan silang antarmolekul yang
terbentuk antara formalin dan protein (3,4), mekanisme molekuler yang mendasari fiksasi
jaringan tidak dipahami dengan baik (5). Permintaan untuk pemilihan antibodi yang lebih
luas yang dapat digunakan untuk pewarnaan imunohistokimia pada jaringan formalin-fix,
parafin-embedded rutin telah merangsang upaya untuk mengembangkan antibodi yang dapat
mengenali epitop yang tahan formalin. Meskipun strategi ini telah efektif dalam
mengembangkan banyak antibodi yang bermanfaat, itu belum sepenuhnya memuaskan dalam
menyelesaikan semua masalah. Perhatian yang terus-menerus dalam imunopatologi adalah
memilih fiksatif yang tepat dan durasi fiksasi yang akan memberikan pengawetan morfologi
jaringan yang maksimal dengan hilangnya antigenisitas yang minimal. Salah satu pendekatan
untuk menyelesaikan dilema ini adalah pengenalan pencernaan protease dari bagian-bagian
yang diikat formalin untuk membuka kedok situs-situs antigen yang disembunyikan oleh
protein-protein yang saling terkait (6,7). Namun, Leong et al. (8) menunjukkan bahwa, selain
dari cytokeratin dan desmin, pencernaan dengan trypsin tidak secara substansial
meningkatkan imunostaining antigen lain yang diteliti. Saat ini tidak jelas apakah pengikatan
silang yang diinduksi formalin atau tidak merupakan reaksi kimia yang dapat dibalikkan.
Namun, sebuah studi baru-baru ini mengenai sensitivitas formalin dari epitop GFAP
mendukung hipotesis bahwa sensitivitas beberapa epitop bukan karena efek langsung dari
aldehida melainkan karena pengikatan struktur molekul lain dengan epitop (9).
Jelas, kemampuan pengambilan epitop kedap suara dapat secara signifikan memperluas
kisaran antibodi yang berguna dalam imunohistokimia serta mengurangi insiden pewarnaan
negatif-palsu pada jaringan yang diperbaiki. Selain itu, pengambilan antigen dapat
memberikan akurasi diagnostik yang lebih besar dengan meningkatkan prosedur
imunohistokimia. Dengan tujuan ini dalam pikiran, kami mempelajari efek pemanasan oven
microwave dari bagian jaringan di hadapan solusi logam. Kami menemukan efek peningkatan
dramatis dari perawatan ini pada pemulihan banyak antigen, yang sangat menarik mengingat
efek buruk yang diduga berasal dari suhu tinggi pada antigen protein.

Materials and Methods


Jaringan dan Blok Parafin. Jaringan segar diperoleh dari Jaringan Jaringan Manusia Koperasi
(CHTN; Columbus, OH), dan segera diperbaiki baik dalam formalin buffered 10% netral atau
etanol 90%. Fixedtissue didehidrasi dalam etanol, dibersihkan dalam xylene, dan blok
inparaffin tertanam. Beberapa jaringan yang telah diperbaiki dalam formalin dari 24 jam
hingga 2 tahun diperoleh dari Departemen Patologi, Pusat Medis Nasional City ofHope
(Duarte, CA) dan Rumah Sakit Hartford (Hartford, CT). Bagian lima ıtm dipotong dan
dipasang pada slide yang dilapisi poli-Llysine (Sigma; St Louis, MO). Penggunaan perekat
jaringan itu penting, karena tanpa jaringan perekat cenderung terlepas dari slide selama
proses pengambilan antigen

Oven Microwave. Model Toshiba ER-855BT yang beroperasi pada frekuensi 2,45 GHz
dengan sembilan pengaturan level daya digunakan pada pengaturan daya tertinggi (720 w).
Tiga stoples Coplin diisi dengan air dc-ionized, seng sulfat 1%, atau tiosianat timbal jenuh,
dan ditempatkan di tengah oven microwave. Karena jumlah stoples Coplin yang ditempatkan
dalam oven microwave dapat mempengaruhi suhu, tiga stoples selalu digunakan, dan mereka
selalu ditempatkan di posisi yang sama. Ketika dipanaskan pada pengaturan yang
ditunjukkan, titik didih (100 ± 5'C) untuk larutan encer ini dicapai dalam 140-145 detik.

Protokol untuk Pengambilan Antigen. Meskipun antigen yang berbeda mungkin berperilaku
berbeda di bawah kondisi pengobatan yang serupa, protokol berikut ditemukan dapat diterima
untuk sebagian besar antigen yang diuji dalam penelitian ini. Langkah-langkah untuk
pengambilan antigen adalah sebagai berikut
1. Bagian jaringan dideparafininasi dan direhidrasi menjadi air.
2. Peroksidase endogen diblok dengan 3% H202 selama 5 menit.
3. Slide dicuci dengan air suling selama 5 mm.
4. Slide kemudian ditempatkan di dalam wadah plastik Coplin yang mengandung salah satu
air suling, larutan logam tiosianat timbal jenuh, atau 1%zinc sulfat.
5. Stoples ditutup dengan sekrup penutup yang longgar dan dipanaskan dalam microwave
oven untuk 5 atau 10 mm. Terkadang waktu pemanasan 10 mm
dibagi menjadi dua siklus 5-mm dengan interval antara 1 mm
siklus untuk memeriksa level cairan dalam stoples.
6. Setelah pemanasan, stoples Coplin dikeluarkan dari oven dan dibiarkan
dingin selama 15 mm.
7. Slide kemudian dibilas dalam air suling dua kali dan dalam PBS selama 5 mm.
8. perawatan slide pada pewarnaan imunohistokimia seperti yang dijelaskan di bawah ini.

Sebagai perbandingan, oven konvensional juga digunakan untuk memanaskan slide.


Solusinya dipanaskan sampai suhu yang ditentukan. Slide ditempatkan dalam larutan pra-
panas selama 5-10 mm dan kemudian diperlakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya untuk
prosedur gelombang mikro.

lmmunohistochemixtry. Semua antibodi poliklonal dan monoklonal yang tercantum dalam 1


ligble 1 diperoleh dari Laboratorium BioGenex (San Ramon, CA). Kecuali ditentukan lain,
sistem deteksi untuk pewarnaan imunohistokimia adalah sistem Super Sensitif, juga dari
BioGenex. Dalam beberapa
mempelajari sistem deteksi MukiLink (BioGenex) juga dievaluasi. Baik peroksidase lobak
dengan kromogen AEC dan alkali fosfatase dengan kromogen Merah Cepat digunakan.

Pewarnaan imunohistokimia dilakukan sesuai dengan instruksi pabrik. Secara singkat, semua
inkubasi dilakukan pada suhu kamar sebagai berikut: (a) antibodi primer diinkubasi dari 30
mm hingga 24 jam sesuai dengan instruksi pabrik; (B) link antibodi diinkubasi selama 20
mm; (c) enzim terkonjugasi streptavidin diinkubasi selama 20 mm; (d) substrat peroksidase
diinkubasi selama 5 mm, atau alkali fosfatase diinkubasi selama 20 mm. Setelah
irununaining, slide dihilangkan dengan hernatoxylin dan ditutup dengan media pemasangan
berair.

Serum non-imun kelinci atau tikus yang tidak spesifik digunakan sebagai kontrol negatif
untuk masing-masing antibodi primer kelinci dan tikus. Kontribusi pewarnaan primer
antibodi nonspesifik dievaluasi dengan substitusi antibodi primer dengan kontrol negatif atau
dengan PBS.

Pencernaan enzim. Dalam beberapa kasus, jaringan deparaffinisasi dilakukan pra-perlakukan


dengan pencernaan protease sebelum aplikasi antibodi primer. Bagian jaringan diinkubasi
dengan 0,1% trypsin (Sigma) dalam PBS selama 30 mm pada suhu 37C. Setelah pencernaan
enzim, slide dibilas dalam PBS dan tidak dinamai
seperti yang dijelaskan sebelumnya.

Hasil
Pewarnaan Imunohistokimia Menggunakan
Microwave Panas

Hasil imunostaining menggunakan 52 antibodi primer yang berbeda pada jaringan yang
dirawat untuk pengambilan antigen dirangkum dalam l # {224} ble 1. Sebagian besar
antibodi yang diuji menunjukkan peningkatan intensitas imunostaining setelah pemanasan
dengan oven microwave dengan adanya air suling atau larutan logam. Secara umum,
intensitas imunostaining lebih kuat dengan larutan logam, terutama menggunakan larutan
timah (Gambar i). Dalam beberapa kasus, seperti dengan antibodi monoklonal terhadap IgD,
penggunaan larutan seng sulfat menyebabkan pewarnaan latar belakang yang kuat pada epitel
amandel dan beberapa pewarnaan nukleus limfosit positif-palsu. Jenis pewarnaan positif
palsu ini tidak diamati dengan larutan timbal (Gambar 2).

Hasil terbaik diperoleh ketika slide dipanaskan dalam oven microwave menggunakan metode
pemanasan intermiten dari dua siklus 5-mm dengan interval 1 mm antara siklus pemanasan.
Keuntungan lain dari metode ini adalah bahwa solusi tambahan dapat ditambahkan ke stoples
jika perlu.

Pewarnaan Imunohistokimia Menggunakan


Panas Konvensional

Pemanasan slide dalam air suling atau larutan logam konvensional panas dalam oven juga
menghasilkan beberapa pewarnaan immuno yang meningkat; Namun, ada perbedaan nyata
dibandingkan dengan pemanasan microwave (Tabel 2).
Untuk jaringan yang difiksasi dalam formalin selama 24 jam atau lebih, lakukan pemanasan
slide dengan microwave oven jelas lebih unggul daripada memanaskan slide dengan panas
konvensional. Demikian pula, penggunaan larutan timbal menghasilkan hasil yang lebih baik
daripada larutan seng, yang pada gilirannya lebih baik daripada air (Gambar 2).

Sensitivitas Metode Pengambilan Antigen

Untuk menunjukkan peningkatan sensitivitas yang dapat dicapai dengan metode ini, antibodi
terpilih diuji pada titer yang gagal menghasilkan noda positif ketika diuji dengan prosedur
immunostaining konvensional. Selain itu, immunoreaktivitas tidak dapat ditunjukkan dengan
antibodi ini, bahkan dengan penggunaan trypsin pra-pencernaan jaringan. Ketika antibodi ini
kemudian diuji pada jaringan yang sama setelah pengambilan antigen, immunostaining yang
kuat diamati (Gambar 1, 2, dan 3; Tabel 3).

Kekhususan Metode Pengambilan Antigen

Spesifisitas metode pengambilan antigen diuji dengan jaringan immunostaining yang


diketahui mengandung atau kekurangan antigen tertentu. Untuk penelitian ini, jaringan
diimunisasi dengan antibodi monoklonal menjadi cytokeratin 7 atau protein yang
berhubungan dengan reseptor estrogen p29. Kedua antibodi ini mendeteksi epitop yang
sensitif terhadap formalin tetapi resisten etanol. Jaringan pertama kali dikategorikan sebagai
antigen positif atau antigen negatif dengan imunostaining beku 5 kation dari setiap jaringan
difiksasi dalam etanol. Sisa jaringan kemudian difiksasi dalam formalin dan disematkan
dalam parafin. Ketika parafin. Jaringan tertanam yang diketahui mengandung antigen diuji
dengan antibodi terhadap sitokeratin 7, tidak ada pewarnaan yang terjadi pada jaringan yang
difiksasi formalin terlepas dari lamanya waktu offixasi. Demikian pula, dengan antibodi
terhadap p29 tidak ada pewarnaan yang terjadi pada jaringan antigen-positif yang telah
difiksasi dalam formalin selama 48 jam atau lebih lama. Meskipun tidak ada antibodi yang
mendeteksi antigen di jaringan formalin-tetap sebelum pengambilan antigen, setelah
pengambilan keduanya memberikan pewarnaan yang kuat dari antigen masing-masing
(Gambar 4). Selanjutnya, ketika formalin diperbaiki, parafin tertanam jaringan yang negatif
untuk antigen ini diimunisasi untuk sitokeratin 7 atau p29, tidak ada pewarnaan baik dengan
atau tanpa pengambilan antigen.

Pengambilan Antigen di Jaringan Tetap Berformalin Jangka Panjang

Tiga puluh sembilan jaringan berbeda yang telah difiksasi dalam formalin untuk periode
waktu mulai 2-4 minggu dan satu jaringan yang telah disimpan dalam formalin selama 2
tahun diuji untuk imunoreaktivitas terhadap vimentin dan pan-sitokeratin (Gambar 3). Seperti
yang ditunjukkan pada Tabel 4, tanpa perawatan hanya sebagian kecil dari jaringan yang
ternoda, dan pewarnaan yang terjadi biasanya lemah. Namun, setelah pengambilan antigen
dengan larutan timbal, imunoreaktivitas untuk dua antibodi ini meningkat secara signifikan,
menunjukkan bahwa pengambilan antigen dalam jaringan formalin-tetap jangka panjang
adalah mungkin.

potongan dan masing-masing bagian diperbaiki dalam formalin selama 22 jam pada suhu 4C,
2YC, atau 37 # {176} BCe. Karena proses fiksasi formal tergantung pada suhu, suhu yang
lebih tinggi menghasilkan fiksasi lebih cepat (5). Setelah parafin menanamkan jaringan-
jaringan ini menjadi sasaran imunostaining untuk vimentin. Karena epitop yang dikenali oleh
antibodi vimentin ini (klon V9) sebagian sensitif formalin (10), sistem ini digunakan untuk
menyelidiki apakah pengambilan antigen dapat digunakan untuk membalikkan efek buruk
dari fiksasi dalam formalin. Seperti ditunjukkan pada Tabel 5 dan Gambar 3, penurunan yang
diamati dalam viorein imunoreaktivitas secara langsung berkaitan dengan peningkatan suhu
fiksatif formalin. Namun, setelah pengambilan antigen dengan adanya larutan timbal,
vimentin immunostaining sepenuhnya dikembalikan ke tingkat yang bahkan melebihi yang
diamati pada tumor yang tetap pada 4C tanpa perawatan selanjutnya (Thble 5). Hasil ini
menunjukkan bahwa, setidaknya untuk beberapa epitop, efek buruk dari fiksasi formalin
adalah reversibel.

Kontrol
Untuk sebagian besar antibodi yang diencerkan ke titer optimalnya, rasio signal-tonoise
biasanya jauh lebih baik dengan jaringan yang dirawat untuk pengambilan antigen
dibandingkan dengan jaringan yang tidak diobati, karena latar belakang biasanya lebih rendah
setelah pengambilan antigen. Namun, pada beberapa jaringan yang sudah rentan terhadap
latar belakang tinggi (pewarnaan tanpa adanya)

antibodi primer), pengobatan dengan pengambilan antigen selanjutnya meningkatkan


pewarnaan latar belakang. Jenis latar belakang ini dikaitkan dengan pengikatan langsung
antibodi biotinilasi sekunder ke jaringan, dan biasanya dapat dihilangkan dengan
pengenceran yang sesuai dari antibodi sekunder.
Fiksasi alkohol

Ketika pengambilan antigen dilakukan pada bagian-bagian jaringan yang difiksasi dengan
alkohol, tidak ada peningkatan imunoreaktivitas, sedangkan semua bagian difiksasi dalam
formalin 10%, terlepas dari lamanya waktu fiksasi, menunjukkan peningkatan
imunoreaktivitas.

Diskusi
Oven microwave telah digunakan untuk fiksasi jaringan (8,11,12) dan untuk pewarnaan
histokimia dan imunohistokimia yang cepat (13-20). Satu laporan baru-baru ini juga
mengamati pewarnaan imunohistokimia yang ditingkatkan setelah pengeringan microwave
dengan longsor (21). Namun, dalam kasus ini hanya periode iradiasi singkat dan suhu rendah
yang digunakan. Sejauh pengetahuan kami, belum ada laporan yang dipublikasikan tentang
pengambilan antigen dengan menggunakan oven microwave dan larutan logam. Demikian
pula, tidak ada penelitian yang menunjukkan bahwa intensitas pewarnaan imunohistokimia
dapat ditingkatkan dengan memanaskan slide ke suhu tinggi. Dari sudut pandang ini, the
hasil immunostaining yang sangat baik yang ditunjukkan dalam penelitian ini tidak dapat
diprediksi berdasarkan pengetahuan saat ini.

Meskipun mekanisme pemulihan oven microwave dari antigen tidak jelas, karena perawatan
ini tidak mempengaruhi bagian parafin alcoholfixed adalah mungkin bahwa ikatan silang
protein yang disebabkan oleh formaldehida dapat diubah oleh pemanasan gelombang mikro.

Penggunaan garam logam berat dalam kombinasi dengan formalin untuk fiksasi jaringan
baru-baru ini telah diperkenalkan (22,23). Beberapa penelitian telah menunjukkan
keunggulan seng-formalin sebagai fiksatif untuk pengawetan antigen (23). Lebih lanjut,
ketika jaringan rutin formalin diperbaiki kembali pada zinc-formalin, imunoreaktivitas
ditingkatkan (24). Solusi logam yang digunakan dalam penelitian ini diformulasikan
berdasarkan pada hipotesis bahwa garam logam berat bertindak sebagai pengendapan protein,
membentuk kompleks yang tidak larut dengan polipeptida (22), dan bahwa bahan pengawet
pengendap protein sering menampilkan pelestarian yang lebih baik dari antigen daripada
melakukan pengikatan aldehida pengikat silang. (23)

Dalam penelitian ini kami menemukan bahwa penggunaan larutan logam dalam kombinasi
dengan pemanasan oven microwave, dan pada tingkat yang lebih rendah pemanasan
konvensional, secara substansial dapat meningkatkan imunoreaktivitas di atas yang dapat
dicapai tanpa pengolahan atau dengan pengolahan yang terdiri dari air suling dan panas. Ini
sangat jelas dalam jaringan yang telah diperbaiki dalam formalin selama lebih dari 24 jam.
Studi pendahuluan kami telah menunjukkan bahwa larutan timbal lebih baik daripada larutan
seng selama perawatan oven microwave, karena larutan timbal menunjukkan
imunoreaktivitas yang lebih kuat dengan latar belakang yang lebih sedikit.

Bila dibandingkan dengan pencernaan protease, pengaruh pra-perawatan gelombang mikro


jelas lebih unggul, terutama dengan antigen, seperti vimentin, yang biasanya tidak
ditingkatkan oleh proteolisis. Battifora dan Kopinski (7) telah melaporkan bahwa lamanya
waktu optimal untuk pencernaan proteolitik meningkat dalam proporsi langsung dengan
lamanya waktu jaringan diperbaiki dalam formalin. Dalam penelitian ini kami menemukan
bahwa jaringan yang difiksasi dalam formalin untuk periode mulai dari 2 minggu hingga 2
tahun masih bisa di imunostrasi untuk pan-cytokeratin dan vimentin setelah pengambilan
antigen, meskipun enzim pra-pencernaan gagal mengembalikan imunoreaktivitas. Hasil ini
menunjukkan bahwa jaringan lain yang sebelumnya dianggap tidak cocok untuk analisis
imunohistokimia berpotensi dapat diselamatkan dan berhasil dievaluasi dengan berbagai
antibodi.

Meskipun metode yang dijelaskan dalam laporan ini relatif


sederhana dan mudah, beberapa tindakan pencegahan harus diperhatikan.
Pertama, data kami menunjukkan bahwa pewarnaan latar belakang dapat ditingkatkan dengan
metode ini pada jaringan tertentu yang sudah rentan terhadap latar belakang tinggi. Karena
itu, penting ketika mengevaluasi metode ini untuk secara hati-hati membandingkan
pewarnaan positif dengan kontrol negatif yang sesuai. Kedua, penggunaan garam logam
tertentu, seperti timbal, berpotensi menimbulkan risiko kesehatan yang harus dikurangi
dengan tindakan yang tepat. Di laboratorium kami, kami menggunakan oven microwave
dalam lemari asam tematis untuk mengurangi paparan lingkungan terhadap aerosol timbal.

Metode pewarnaan imunohistokimia merupakan alat diagnostik yang relatif baru yang dapat
berkontribusi pada pemahaman kita tentang patologi manusia. Penyempurnaan berkelanjutan
dari alat-alat ini telah secara signifikan memperluas kemampuan ahli patologi bedah dalam
prosedur diagnostik. Terlepas dari kemajuan penting ini, tidak ada metode fiksasi standar
yang dapat diterapkan pada jaringan yang diajukan untuk analisis imunohistokimia. Memang,
dalam kebanyakan kasus persyaratan untuk fiksasi jaringan ditentukan oleh pertimbangan
lain, tidak terkecuali yang merupakan preferensi pribadi. Meski standardisasi metode
ofununohistokimia telah seringmenganjurkan (25), tidak mungkin bahwa standardisasi akan
mendapatkan penerimaan yang meluas, setidaknya dalam waktu dekat. Selain itu, bahkan jika
standardisasi fiksasi telah tercapai, kebutuhan untuk menerapkan imunohistokimia pada
bahan arsip masih akan tetap ada. Akibatnya, teknik baru yang dapat mengimbangi
kekurangan tertentu yang berkaitan dengan pemrosesan jaringan diperlukan. Jika teknik
seperti pengambilan antigen dapat digunakan untuk memvisualisasikan antigen yang jika
tidak terdeteksi, berbagai metode imunohistokimia yang berguna akan sangat diperluas.
Selanjutnya, disederhanakan metode pengambilan antigen dapat mengurangi kejadian hasil
imunostaining falsenegatif. Dalam aplikasi klinis ini dapat diterjemahkan ke dalam
peningkatan akurasi diagnostik dan peningkatan perawatan pasien.