Anda di halaman 1dari 44

Marlia Singgih Wibowo

Sekolah Farmasi ITB


16 Juni 2009
PENDAHULUAN
Prinsip Praktek Pengujian yang Baik
(Good Analytical Practices) :
Pengujian dilakukan untuk memenuhi suatu tujuan tertentu
atau kebutuhan pengguna
a. Pengujian dilakukan dengan menggunakan metode, 
prosedur dan peralatan yang telah teruji untuk
menjamin kesesuaian dan tujuan pengujian
b. Pengujian dilakukan oleh personel yang memiliki
kualifikasi dan kompeten
d. Hasil pengujian harus ajeg atau konsisten, tidak
dipengaruhi oleh faktor lokasi, personel dan peralatan
e. Laboratorium penguji harus mempunyai prosedur
jaminan dan pengendalian mutu yang memadai
f. Laboratorium penguji harus diuji dan dievaluasi oleh
badan yang kompeten dan tidak memihak (akreditasi)
Validasi Metode Analisis
Definisi :
Validasi Metode Analisis adalah proses pembuktian
atau konfirmasi pengujian yang obyektif di
Laboratorium, dan bahwa metode itu memenuhi
persyaratan yang telah ditentukan, yang sesuai
dengan tujuan penggunaannya.
Validasi Metode Analisis (lanjutan)
Tujuan :
y Mengevaluasi kinerja metode : kepekaan, selektivitas, 
akurasi, presisi, dll., sekaligus menguji kelemahan dan
keterbatasan metode
y Menguji faktor‐faktor yang dapat mempengaruhi
kinerja metode dan mengetahui besarnya pengaruh
itu terhadap hasil analisis
y Melakukan verifikasi atau membuktikan kinerja
metode analisis baku yang diadopsi/digunakan
laboratorium
Validasi Metode Analisis (lanjutan)
Syarat :
y Menggunakan instrumen dan peralatan yang 
terkalibrasi
y Dilaksanakan oleh personnel yang kompeten
Jenis Validasi Metode
y Validasi primer dilakukan jika laboratorium
menggunakan metode analisis “baru” hasil
pengembangan , atau metode yang di modifikasi
terhadap suatu metode standard. 
y Validasi sekunder dilakukan untuk verifikasi, jika
laboratorium menggunakan atau mengadopsi metode
standard yang telah divalidasi.
Pedoman Validasi Metode Analisis
Mikrobiologi

y Farmakope Indonesia edisi 4, 1995


y The United States Pharmacopeia (USP) 30, 2008 or new 
edition
y ISO/IEC 17025:2005: General recommendations regarding the 
proficiency of test and calibration laboratories
y International Conference on Harmonization, 1996
y Method Validation of Microbiological Methods, guidance 
note : C & B and ENV 002, Singapore Accreditation 
Council, July 2002.
y Feldsine, et.al., AOAC International method Committee 
Guidelines for Validation of Qualitative and Quantitative 
Food Microbiological Official Method of Analysis, Journal 
of AOAC International Vol.85, No.5, 2002
y Thompson, M., Ellison, S.L.R. and Wood, R.: Harmonised
Guidelines for Single‐Laboratory Validation of Methods of 
Analysis, Pure Appl. Chem., 74, 835‐855 (2002).
y Kromidas, S.: Handbook of Validation in Analysis, Verlag
Wiley‐VCH, Weinheim, ISBN 3‐527‐29811‐8 (2000).
y Water quality – Guidance on Validation of Microbiological 
Methods, Technical Report, ISO/TR 13843 : 2000.
y Procedure for The Estimation and Expression of 
Measurement Uncertainty in Chemical Analysis, Nordic 
Committee on Food Analysis, NMKL, No.5, 1997.
y APHA Standard methods for the Examination of Water 
and Wastewater, 20th ed., 1998.
y Acuan lain yang relevan
Parameter Validasi metode
analisis mikrobiologi
y Akurasi – Kecermatan
y Presisi (repeatability, reproducibility dan 
intermediate precision) – Keseksamaan
y Sensitivitas – (limit deteksi, limit kuantifikasi)‐
Kepekaan
y Selektivitas dan Spesifisitas
y Linearitas
y Rentang Hitung yang diterima (acceptable) (batas 
atas dan batas bawah dari rentang perhitungan)
y Robustness (Ketegaran) metode
y Ruggedness (Ketangguhan) metode
Metode Analisis Mikrobiologi
y Kualitatif :
9 Uji langsung  terhadap mikroba indikator
9 Metode kultur untuk identifikasi makroskopik dan mikroskopik
9 Metode alternatif (Dye‐reduction Test, Electrical Methods, ATP 
Determination)
9 Metode Cepat deteksi mikroba spesifik dan toksinnya  (metode 
imunokimia, metode biologi molekuler)
y Kuantitatif :
9 Angka Lempeng Total (Total Plate Count)
9 MPN (Most Probable Number)
9 Uji potensi antibiotik
9 Uji sterilitas 
9 Uji koefisien fenol (uji desinfektan dan antiseptik)
9 Uji efektivitas pengawet 
Metode kuantitatif
y Metode analisis yang responsnya berupa jumlah dari
analit , baik yang diukur secara langsung (misalnya : 
enumerasi mikroba) maupun secara tidak langsung
(misalnya : Nilai Absorbans, intensitas warna, 
diameter hambat , impedansi, dll)
Contoh hasil uji potensi antibiotik
Tahap Persiapan Validasi
Sebelum validasi dilakukan, hendaknya laboratorium
menyediakan atau menyiapkan beberapa hal :
1. Mikroorganisme target atau acuan (lihat SR‐02 :
persyaratan tambahan untuk akreditasi
laboratorium, Pengujian Kimia dan Biologi
SNI 17025, DP.01.16, Januari 2004)
2. Peralatan dan Instrumen ukur yang telah dikalibrasi
3. Personel yang kompeten
4. Program Statistika untuk menghitung, 
mengevaluasi dan menginterpretasikan hasil
pengujian
Akurasi (Kecermatan)
Definisi :
y Akurasi adalah kemampuan metode untuk mengukur
dan mendeteksi nilai aktual atau nilai sebenarnya dari
mikroorganisme target dalam sampel
y Akurasi merupakan ukuran ketepatan atau kedekatan
hasil pengujian dengan hasil yang sebenarnya
Akurasi (Kecermatan) (lanjutan)
y Rekoveri (Recovery) = Persen perolehan kembali
% Rek = H/A  x  100

y Galat Relatif : (H – A)/A   x  100


H = hasil pengujian dengan metode
A = hasil sebenarnya dari mikroorganisme target

y Rekoveri Relatif :  H/B  x  100


H = hasil pengujian metode
B = hasil pengujian metode standard
Akurasi (Kecermatan) (lanjutan)
Cara pengujian :
y Spiked‐placebo Recovery Method
y Standard  Addition Method

Menggunakan 9 kali pengukuran ( 3 level konsentrasi


dengan 3 replikasi)
Perhitungan

% Rekoveri = Hsl.metode uji x   100%


Hsl teoritis
= 125/125   x   100%  = 100%

% Rekoveri relatif =   Metode uji x    100%


Metode baku
= 125/125  x   100%  =  100%
Presisi (Keseksamaan)

Definisi
y Presisi adalah tingkat kesesuaian antara hasil
pengujian individual dengan hasil rata‐rata pengujian
berulang pada sampel yang homogen dengan kondisi
pengujian yang sama
y Presisi : keterulangan (repeatability), ketertiruan
(reproducibility), keseksamaan antara (intermediate 
precision)
Presisi (Keseksamaan) (lanjutan)
Cara Perhitungan
y Simpangan baku relatif (SBR = Relative Standard 
Deviation=RSD) untuk intermediate precision 
y KV =  100 x SBR  
Sensitifitas dan Spesifisitas

y Sensitifitas (Kepekaan) : Kemampuan metode untuk


mendeteksi/mengukur mikroorganisme target dalam
jumlah sekecil mungkin
y Spesifisitas (Kemenjenisan): Kemampuan metode
untuk mendeteksi/mengukur mikroorganisme
tertentu secara cermat dan seksama dengan adanya
mikroorganisme asing atau bahan/matriks lain
Rentang Hasil Pengujian
y Rentang menunjukkan nilai terendah dan tertinggi
hasil pengujian yang dapat ditentukan dengan cermat
dan seksama

y Batas terendah (Lower limit) 
Hasil analisis / pengujian terendah yang ditandai
dengan galat analisis 20,0% dari rata‐rata 
(pengukuran minimal 3 kali)
y Batas tertinggi (Upper limit)
Hasil analisis /pengujian koloni tertinggi yang 
masih dapat dihitung dengan cermat dan seksama
ditandai dengan galat analisis 15,0% dari rata‐rata 
(pengukuran minimal 3 kali)

y Rentang hasil pengujian


Linearity (Kelinieran)

y Keliniearan adalah kemampuan metode analisis yang 


menunjukkan bahwa larutan sampel yang berada dalam
rentang konsentrasi memiliki respon analit yang proporsional
dengan konsentrasi, secara langsung ataupun melalui
transformasi matematika

y Kurva baku disiapkan dan dianalisis 3  kali dengan konsentrasi


antara 50 – 150% kadar aktual (FDA), untuk penentuan kadar
dalam sampel, tiga larutan baku digunakan : 80, 100 dan 120% 
konsentrasi target
Linearity (Kelinieran) (lanjutan)
Parameter
y Kurva baku, dengan persamaan garis (regresi linear, 
logaritma atau polinomial)
y Kepekaan analisis , F = ∆ y/ ∆ x untuk setiap
konsentrasi pada kurva baku
y Simpangan baku residual garis regresi

Sy/x = [∑(y‐ŷ)2/n‐2]1/2
y = respon analit
ŷ = dihitung dari persamaan garis regresi
Linearity (Kelinieran) (lanjutan)
y Koefisien variasi fungsi regresi

Vx0 =  S y/x .  100%   , (Vx0 ≤ 2%)


b.x

y Koefisien korelasi ( r ≥ 0,999)


Linearity (Kelinieran) (lanjutan)
a. Menggunakan persamaan garis
Perhitungan Kadar D = b log C + a

Diameter  log Cs = (Ds – a)/ b


Hambat x dimana :
x Cs = kons. analit dlm sampel
x
Ds = Diameter hambat
x
b.   Menggunakan satu larutan baku
x
dan larutan blangko
log Cs = (Ds – a)/(Db – a) . log Cb
dimana :
Log Ci Cb = kons. analit dlm lar.baku
Robustness (Ketegaran) metode
y Pengujian Ketangguhan sebenarnya harus dilakukan
pada saat fase pengembangan metode dan tergantung
pada faktor‐faktor yang berpengaruh pada pengujian
y Jika pengujian sangat peka terhadap perubahan dalam
kondisi analisis,maka kondisi pengujian hendaknya
dikendalikan atau dilakukan dengan penuh kehati‐
hatian
y Hasil pengujian dievaluasi secara Statistika
menggunakan ANOVA atau Algoritma dari Yate
Robustness (Ketegaran) metode (lanjutan)n
y Jenis keragaman kondisi pengujian yang harus
diperhatikan :
y Stabilitas sampel
y Pengaruh suhu inkubasi
y Pengaruh waktu inkubasi
y Kondisi aerobik atau anaerobik (untuk pengujian
mikroba tertentu)
y Pengaruh jenis media (nutrisi), dll
Ruggedness (ketangguhan)
y Terminologi lama 
y = Intermediate precision
y Bila suatu metode analisis telah diuji reproducibility 
nya melalui uji antar Lab/uji kolaborasi, maka
Ruggedness tidak diperlukan lagi
Faktor yang mempengaruhi hasil uji
potensi dengan metode lempeng agar
y Penyiapan larutan baku
y Ketebalan agar
y Konsentrasi inokulum
y Temperatur‐waktu
y Komposisi media
y pH
Questions regarding antibiotic 
potency assay
y What different antibiotic potency assay 
methods are read and calculated? 

USP (United States Pharmacopoeia), EP (European 
Pharmacopoeia), BP (British Pharmacopoeia), JP 
(Japanese Pharmacopoeia), AOAC (American 
Association of Analytical Chemists), US‐CFR (Code of 
Federal Registry) and a custom single plate method.  
•Is plate to plate variation accounted and 
corrected for in USP method calculations? 
Yes. Sometimes the depth of agar, temperature 
differences in an incubator, or other factors may 
result in conditions that should be corrected in the 
calculations of sample concentrations. This is 
automatically performed by the standard sample 
layout and calculations in the USP/CFR/AOAC 
methods. 
What purpose does the standard curve 
graph serve? (USP/CFR/AOAC only) 

y The standard curve graph is performed to help the 
user where the standard and unknown samples are 
plotted relative to the curve. The graph is not used for 
calculations; the calculations are performed by 
mathematical formulas
Can samples be put onto paper disks, into wells 
cut in the agar, and into metal cylinders? 

y Yes, liquid samples may be placed in any of these. 
Some method guidelines specify which of these may 
be used
Contoh
BMC Clin Pharmacol. 2009; 9: 1. 
Published online 2009 January 16. doi: 10.1186/1472‐6904‐9‐1.
PMCID: PMC2640365
Copyright © 2009 Zuluaga et al; licensee BioMed Central Ltd.

Application of microbiological assay to 
determine pharmaceutical equivalence of 
generic intravenous antibiotics
Andres F Zuluaga,1,2 Maria Agudelo,1 Carlos A Rodriguez,1,2 and Omar Vesga1,3
1GRIPE: Grupo Investigador de Problemas en Enfermedades Infecciosas, University of Antioquia, Medellín, 
Colombia
2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Antioquia, Medellin, Colombia
3Section of Infectious Diseases, Department of Internal Medicine, University of Antioquia, Medellin, Colombia

Corresponding author.
Andres F Zuluaga: andreszuluaga@une.net.co ; Maria Agudelo: mariaag10@yahoo.com ; Carlos A Rodriguez: 
andreios@yahoo.com ; Omar Vesga: omar.vesga@siu.udea.edu.co

Received June 14, 2008; Accepted January 16, 2009.
Metode
y Pengujian dilakukan berdasarkan variasi konsentrasi
terhadap efek inhibisi pada bakteri uji : Bacillus subtilis
ATCC 6633,  Staphylococcus  aureus ATCC 6538p  dan
Staphylococcs epidermidis ATCC 12228, yang 
ditumbuhkan pada media agar (Difco™ Antibiotic Media), 
menghasilkan hubungan linear antara konsentrasi zat ‐
respons e linear dengan dua parameter : y‐intercept 
(concentration) and slope (potency).  
y Dibandingkan dua parameter tersebut dari 22 product 
generik (amikacin 4, gentamicin 15, and vancomycin 3 
produk) dengan sediaan pembanding by Overall Test for 
Coincidence of the Regression Lines (Graphpad Prism 5.0).
Pengolahan data dalam proses validasi
y Ditentukan linearity, limit of quantification, 
precision, accuracy, dan specificity utk menvalidasi
method for testing pharmaceutical equivalence. 
y Untuk tujuan tersebut,  log‐transformed 
concentrations (x‐axis, log10 mg/L) dari setiap produk
diplot terhadap masing‐masing diameter hambat nya
(y‐axis, rata‐rata  diameter dalam mm); intercept 
(perpotongan dan kemiringan/slope garis regresi
linear yang diekspresikan dengan persamaan y = b + 
mx, dengan b sebagai nilai y‐intercept dan m sebagai
nilai kemiringan nya
y 5 Konsentrasi yang digunakan untuk masing‐masing
antibiotik : 0.5 – 256 mg/L (amikacin), 0.125 – 64 
mg/L (gentamicin), dan 0.25 – 128 mg/L  
(vancomycin)  
y The goodness of fit to the model (linearity) : 
dinyatakan dalam coefficient of determination (r2) 
dan standard error of estimate (Syx). 
y Dihitung pula x‐intercept (log10 mg/L) dan
kemiringan garis regresi dengan kepercayaan 95% Î
confidence intervals (95% CI)
Results
y Validasi metode menghasilkan linearitas (r2 ≥ 0.98), 
precision (intra‐assay variation ≤ 11%; inter‐assay 
variation ≤ 10%), accuracy, and specificity tests , 
sesuai dengan syarat international pharmacopoeial . 
y Kecuali pada vancomycin yang ditambahkan 25%  
API (Py‐intercept = 0.001), penentuan potensi antibiotik
menunjukkan hasil yang ekuivalen. 21 sediaan generik
memberikan undistinguishable  slopes  dan
intercepts (P > 0.66). 
y Estimasi potensi antibiotik: amikacin 99.8 ‐ 100.5 , 
gentamisin 99.7 ‐ 100.2,  dan vancomycin 98.5 ‐ 99.9%
Precision of the vancomycin bioassay

Inhibition zone
Vancomycin Coefficient of variation Coefficient of variation
diameters (mean in
concentration (mg/L) (%) Intra-day (%) Inter-day
mm ± SD)

128 18.00 ± 0.04 8.3 10.3

64 16.33 ± 0.02 5.6 10.5

32 14.16 ± 0.11 11.0 1.0

16 11.62 ± 0.37 7.4* 2.3

8 9.59 ± 0.00 4.6 6.5

*An outlier value was excluded from the calculations (we only used five data to compute the 
CV)
BMC Clin Pharmacol. 2009; 9: 1.
Published online 2009 January 16. doi: 10.1186/1472-6904-9-1.
Copyright © 2009 Zuluaga et al; licensee BioMed Central Ltd.
Kurva baku masing2 antibiotik
Penetapan nilai potensi antibiotik
Terima kasih
Sekolah Farmasi ITB
Gedung Yusuf Panigoro
Lab.Tek VII Jalan Ganesa 10 Bandung
Telp./Fax. +62‐22‐2504852
marlia@fa.itb.ac.id
0816611886