Anda di halaman 1dari 27

Abstrak

Hepatitis B virus (HBV) merupakan target yang menjanjikan untuk terapi berdasarkan interferensi
RNA (RNAi) karena ulangan melalui transkrip RNA yang rentan terhadap RNAi pembungkaman.
terjemahan klinis teknologi RNAi, Namun, memerlukan perbaikan dalam potensi, spesifisitas dan
keamanan. Untuk tujuan ini, kita secara sistematis dibandingkan yang berbeda strategi untuk
mengekspresikan anti-HBV jepit rambut pendek RNA (shRNA) di praklinis sebuah
imunokompeten hepatitis model B tikus. menggunakan rekombinan Adeno-associated virus
(AAV) 8 vektor untuk pengiriman, kami (i) tertanam shRNA dalam RNA buatan mi (CRO) di
bawah hati-spesifik promotor; (Ii) co-diungkapkan Argonaute-2, ratelimiting sebuah Faktor seluler
yang jenuh dengan kelebihan pemicu RNAi dapat menjadi racun; atau (iii) co-menyampaikan
umpan ( "TUD") ditujukan terhadap yang shRNA akal untai untuk mengekang regulasi gen dari
target. Hebatnya, semua tiga strategi diminimalkan efek samping sebagai dibandingkan dengan
vektor shRNA konvensional yang menyebabkan penurunan berat badan, kerusakan hati dan
disregulasi> 100 gen hati. Penting, co-mengungkapkan Novel AAV8 vektor anti-HBV shRNA dan
TUD mengungguli semua strategi lain mengenai efisiensi dan kegigihan HBV knock-down,
sehingga menunjukkan janji besar terjemahan klinis.

Kata kunci Adeno terkait virus; virus hepatitis B; interferensi RNA; singkat jepit rambut RNA;
umpan tangguh

Kategori subjek Genetika, Gene Therapy & Penyakit Genetik; Mikrobiologi, Virologi & host
Patogen Interaksi

Pengantar

Hepatitis B kronis yang disebabkan oleh virus hepatitis B (HBV) tetap menjadi beban kesehatan
utama yang mempengaruhi hampir 250 juta manusia dan menyebabkan diperkirakan 686.000
kematian per tahun dari sirosis konsekuensi hati jangka panjang dan karsinoma hepatoseluler
(HCC) (MacLachlan et al, 2015; Schweitzer et al, 2015). Ini adalah karena keterbatasan standar-
of-perawatan terapi antivirus, termasuk yang nucleos (t) analog ide membutuhkan harian dan
aplikasi seumur hidup, yang mahal, dapat menimbulkan efek samping seperti insufisiensi ginjal
(Tenofovir dan Entecavir) dan dapat mendorong munculnya tahan HBV mutan (Lagu et al, 2012).
Selain itu, intervensi saat gagal untuk menghilangkan virus atau menghambat transkripsi virus dan
terjemahan, meskipun kemampuan obat ini untuk mengontrol generasi virion HBV menular.
Namun, protein virus krusial menentukan kegigihan virus dan patogenesis. Secara khusus,
disekresikan HBV permukaan (HBsAg) dan e antigen (HBeAg) diusulkan menjadi kunci pemain
dalam modulasi respon imun host yang mengganggu nya kemampuan untuk membersihkan virus
(Protzer et al, 2012), dan yang sangat mungkin berkontribusi pada pengembangan HCC HBV-
terkait (Ringelhan et al, 2013). HBV X protein (HBX) dapat mempengaruhi sinyal kekebalan dan
kontribusi untuk pengembangan HCC (Levrero & Zucman-Rossi, 2016). Selanjutnya, HBV inti
(HBc) dan polymerase memulai langkah pertama replikasi, encapsidation dan transkripsi
kebalikan dari pregenomic HBV RNA.

Sebuah solusi terhadap pengembangan baru dan lebih terapi HBV efektif adalah
interferensi RNA (RNAi). Terutama menggembirakan adalah bahwa RNAi memungkinkan
penekanan semua transkrip virus dan protein dan dapat berfungsi sebagai dasar untuk
mengembalikan respon imun. Ini pertama kali diusulkan satu dekade lalu ketika dilaporkan bahwa
ekspresi shRNAs (hairpin pendek RNA, pemicu buatan RNAi) dapat dimanfaatkan untuk
penghambatan in vivo HBV atau hepatitis C virus (HCV) ekspresi gen (McCaffrey et al, 2002,
2003). Ini kepeloporannya segera diikuti oleh serangkaian in vitro dan penelitian in vivo pada
model HBV pra-klinis yang diverifikasi besar janji terapi RNAi untuk pengobatan HBV
(McCaffrey et al, 2003; Carmona et al, 2006; Grimm et al, 2006, 2010; Giering et al, 2008; Keck
et al, 2009), dan yang memuncak dalam fase II evaluasi klinis dari siRNA polyconjugated di
HBVinfected kronis pasien (www.arrowheadresearch.com/programs/ARC-520). terjemahan
inspirasi ini dari bangku ke tempat tidur didorong oleh beberapa fakta yang membuat RNAi yang
sangat menarik dan menjanjikan sebagai modalitas antivirus. Pertama, empat transkrip HBV utama
berbagi umum 30 end yang memungkinkan penargetan bersamaan semua virus utusan (m) RNA
dengan molekul RNAi tunggal (Ebert et al,2011). Kedua, HBV mRNA terus ditranskripsi dari
viral kovalen ditutup DNA melingkar (cccDNA), yang HBV persisten terbentuk di inti hepatosit
yang terinfeksi. Hal ini membuat HBV sangat rentan terhadap pendekatan terapi gen menggunakan
vektor yang permanen mengekspresikan efektif anti-HBV shRNA diarahkan terhadap 30 akhir
semua HBV RNA. Salah satu pilihan menarik untuk memberikan shRNAs ke hepatosit yang
terinfeksi rekombinan Adenoassociated virus dari serotipe 8 (AAV8), vektor non-patogen yang
memediasi transfer gen hati yang efisien dan stabil dalam kecil dan besar hewan serta pada
manusia (Grimm et al, 2006; Chen et al, 2007, 2008; Giering et al, 2008; Nathwani et al, 2011).
meningkatkan mereka banding untuk pengobatan infeksi HBV persisten adalah pengamatan kami
baru-baru ini bahwa protein HBV X meningkatkan transportasi AAV nuklir dan dengan demikian
"membantu" AAV transduksi, menunjukkan bahwa vektor akan istimewa membangun di
terinfeksi HBV hepatosit (Hosel et al, 2014).

Untuk sepenuhnya menyadari potensi AAV / RNAi vektor untuk terapi HBV dan untuk
mendorong penerjemahan klinis mereka, sekarang penting untuk mengatasi berlama-lama masalah
keamanan (Grimm et al, 2006; Grimm,2011). Ini awalnya dipicu oleh pengamatan dengan
firstgeneration vektor yang dimediasi terlalu berlimpah ekspresi shRNA, menyebabkan toksisitas
hati dengan transaminase hati serum,ikterus, penurunan berat badan, serta histologis dan hati
structural perubahan. Dalam kasus ekstrim, terbatas shRNA over-ekspresi bahkan mengakibatkan
kegagalan organ dan morbiditas dari tikus yang diobati (Grimm et al, 2006). Temuan tambahan di
c-Myc-transgenik tikus menunjukkan yang shRNA ekspresi berlebihan juga dapat mempercepat
tumorigenesis bawah kondisi tertentu (Beer et al, 2010). efek terutama, merugikan dari shRNA
over-ekspresi yang juga diamati pada spesies lain dan sedangkan jaringan luar hati tikus (Grimm,
2011).

Untungnya, kami dan lain-lain bisa mengidentifikasi mekanisme yang mungkin mendasari
toksisitas RNAi ini, yang sekarang menawarkan berbagai jalan untuk peningkatan (Gambar 1A
dan B). Salah satu model menunjukkan bahwa RNAi ektopik memicu membanjiri endogen mi
(CRO) RNA jalur, terutama Exportin-5 dan Argonaute-2 (Ago-2, komponen kunci RISC) dan
sehingga mengganggu Mirna biogenesis dan / atau kegiatan dalam tergantung dosis- cara (Grimm
et al, 2006, 2010; Giering et al, 2008). bukti adalah bahwa efisiensi RNAi dapat ditingkatkan
dengan Ago-2 co-ekspresi in vitro dan in vivo (Diederichs et al, 2008; Grimm et al, 2010; Borner
et al, 2013). Selain itu, penggunaan lemah shRNA promotor (Giering et al, 2008; Grimm et al,
2010; Suhy et al, 2012) atau shRNA embedding dalam konteks Mirna alami dapat mengurangi
akumulasidewasa RNAi memicu dan dengan demikian meningkatkan keamanan (Zeng et al, 2005;
McBride et al, 2008; Boudreau et al, 2009; Ely et al, 2009), meskipun bahkan marjinal ekspresi
shRNA dapat memprovokasi fenotipe dan transcriptome perubahan hati tikus (Maczuga et al,
2014).
Model kedua menunjukkan bahwa RNAi memicu mengganggu sel homeostasis melalui
penghambatan yang tidak diinginkan dari "off-target" gen dengan melengkapi parsial untuk salah
satu dari dua lengan doublestranded yang molekul RNAi (Jackson et al, 2003; Scacheri et al,
2004;Fedorov et al, 2006). Sebagai shRNAs vektor-dikodekan tidak kompatibel dengan
modifikasi molekul atau kimia yang dapat meningkatkan spesifisitas (Grimm, 2009), yang terbaik
pilihan yang tersisa adalah pilihan bijaksana dari shRNAs dengan bias yang melekat terhadap
lengan antisense yang mengarahkan RISC ke mRNA sasaran (Khvorova et al, 2003; Reynolds et
al, 2004; Gu et al, 2014; Liu et al, 2015). Namun, Data terbaru menunjukkan bahwa shRNA off-
penargetan juga bisa berasal dari pengikatan urutan RNA seluler dengan untai akal, yang identik
dengan daerah sasaran (Clark et al, 2008; Wei et al, 2009; Kwak & Tomari, 2012; Schurmann et
al, 2013; Gu et al, 2014; Mockenhaupt et al, 2015). Untuk memblokir efek samping ini, kami baru-
baru ini (Mockenhaupt et al, 2015) mengembangkan AAV bi-cistronic Novel vektor co-
mengungkapkan shRNA dengan hairpin RNA kedua yang disebut "Umpan sulit" atau "TUD".
Awalnya dirancang oleh Haraguchi dan rekan untuk membungkam miRNAs seluler (Haraguchi et
al, 2009), kami menemukan bahwa Tuds dapat repurposed untuk selektif mengikat dan
menonaktifkan shRNA akal helai, dengan demikian meningkatkan RNAi kekhususan dan
menjanjikan manfaat penting untuk terapi RNAi klinis. Dalam penelitian ini, kami sistematis
dibandingkan sisi desain shRNA / TUD kami baru sisi ke dua canggih shRNA strategi-Ago-2
ekspresi lainnya codelivery dan embedding dalam Mirna perancah-untuk HBV penghambatan di
model tikus transgenik infeksi HBV kronis.

Hasil

Desain RNAi yang berbeda memicu untuk langsung in vitro dan dibandingkan vivo

Gambar 1C memberikan gambaran skematis dari empat RNAi yang berbeda strategi ekspresi yang
diuji dalam penelitian ini. Sebagai Mirna perancah untuk embedding dari anti-HBV shRNA
(strategi [ii]), kita dipilih mir-122 berdasarkan ekspresi yang tinggi dan spesifik dalam hati
(Landgraf et al, 2007). Konstruk akhir ini dirancang untuk memenuhi dua persyaratan (Gambar
EV1A atas): (i) antisense strand dalam posisi 5’, untuk meniru struktur mir-122; dan (ii) yang
pertama posisi diprediksi pra-Mirna yang (diproses pri-miRNA) adalah uridin, untuk rekapitulasi
stabilitas termodinamika pertama tonjolan pra-mir-122. Sebaliknya, aturan untuk membangun
sebuah mengekspresikan anti-HBV konvensional shRNA (Gambar 1Ci dan bawah EV1A) adalah
(i) arti untai di 5, lengan untuk memfasilitasi netralisasi oleh coexpressed TUD (Mockenhaupt et
al, 2015); dan (ii) untai ini dimulai dengan guanin, untuk memungkinkan transkripsi yang tepat
dari RNA polymerase III promotor. Ekspresi shRNA, kami menggunakan H1 promotor
berdasarkan pengalaman kami bahwa ia menghasilkan lebih aman dan lebih RNAi stabil di hati
tikus dari promotor U6 kuat (Grimmet al, 2010).

Untuk memilih anti-HBV shRNAs yang bisa dimodifikasi sesuai dengan aturan ini, kami
fokus pada wilayah X dari genom HBV yang memungkinkan penargetan simultan dari semua
transkrip virus (Ebert et al, 2011) (Lampiran Gambar S1A dan B). Kami mengidentifikasi empat
kandidat shRNA (Gambar EV1B) dan diukur keberhasilan mereka dalam kultur sel HBV Model
(Gambar 2). Dari pra-layar ini, kami memilih shHBV7 untuk semua penelitian lebih lanjut karena
konsisten memberikan hasil terbaik, termasuk 99%

Gambar 1. Mekanisme yang dapat menyebabkan keracunan dan strategi untuk


mengatasinya RNAi.

Sebuah Tiga mekanisme yang mungkin menjelaskan toksisitas setelah lebih-ekspresi


shRNAs konvensional (lihat teks untuk rincian). Oranye, shRNA akal untai; biru, shRNA
antisense untai.

B Peningkatan strategi ekspresi shRNA untuk menghindari mekanisme di panel (A).

C Empat desain vektor utama dibandingkan dalam penelitian ini. Simbol di sebelah kiri
menunjukkan backbone vektor AAV; nomor menunjukkan serotipe asal ITRS (terbalik
mengulangi terminal, yang berfungsi sebagai sinyal kemasan DNA AAV; tanda bintang
menunjukkan penghapusan di AAV4 ITR menciptakan diri pelengkap [sc] AAV genotipe).
enam thymines (6xT) berfungsi sebagai sinyal terminasi untuk H1 promotor / U6; BGH,
hormon pertumbuhan sapi sinyal polyadenylation; TTR, transthyretin promotor.

knock-down dari disekresikan HBsAg (diukur dengan HBsAg kuantitatif chemiluminescent


mikropartikel immunoassay [CMIA], Gambar 2A), sebagai serta kuat knock-down dari
disekresikan HBeAg dan HBV DNA, dan intraseluler pra-genom HBV RNA (transkrip 3.5-kb),
jumlah HBV RNA dan HBV DNA (Gambar 2A-D). Khususnya, tes HBeAg yang digunakan
(Gambar 2A) tidak mengukur konsentrasi benar, tetapi sinyal-dapatmengontrol ratio (S / CO) yang
mengikuti kurva sigmoid. Hal ini menyebabkan meremehkan pada konsentrasi tinggi dan,
sebaliknya, untuk overestimates pada konsentrasi rendah. Dengan demikian, pengurangan HBeAg
adalah mungkin bahkan lebih jelas dan dalam kisaran tinggi diukur dengan tes HBsAg kuantitatif.
Selain itu, manfaat tambahan shHBV7 adalah bahwa urutan target sebagian besar dilestarikan di
semua genotipe HBV (Lampiran Gambar S1C).

Kami selanjutnya tertanam shRNA memimpin ini ke dalam pra-mir-122 perancah, mengikuti
skema pada Gambar EV1C. Oleh karena itu, kami menambahkan dua uridines ke 3’ akhir mir-122
/ HBV7 (dari hereon disebut miHBV7) antisense strand untuk mencocokkan shRNA konvensional
[Diharapkan membawa 3’ overhang hingga tiga uridines, khas untuk shRNAs menyatakan dari
RNA polimerase III promotor (Cullen, 2006)] (Gambar EV1C atas). Selain itu, kami merancang
sebagian komplementer rasa untai meniru ketidaksesuaian dan tonjolan di asli mir-122 dan
akhirnya menambahkan 5’ dan 3’ urutan mengapit dari mir-122 untuk melengkapi miHBV7
perancah (Gambar EV1C bawah). Seluruh urutan kemudian dikloning ke dalam vektor AAV dan
menyatakan dari transthyretin hati-spesifik RNA polimerase II promotor (TTR) (Wu et al, 2008).

promotor ini juga digunakan untuk co-mengungkapkan Ago-2 bersama-sama dengan H1


promotor-driven shHBV7 (Gambar 1Ciii). Ukuran besar bi-cistronic shRNA / Ago-2 konstruk
diperlukan kloning menjadi vektor AAV tradisional yang paket sebagai DNA untai tunggal.

Gambar 2. Pra-seleksi anti-HBV RNA jepit rambut pendek.Sebuah sel Huh7 yang co-
transfected dengan shRNAs memenuhi semua persyaratan untuk dimasukkan ke dalam
strategi ekspresi dari Gambar 1C dan plasmid ekspresi HBV PCH-HBV1.3, dan HBeAg dan
HBsAg dikuantifikasi dalam supernatan 48 jam kemudian. Vektor AAV plasmid kosong
digunakan sebagai kontrol. kontrol negatif lain adalah sel mock-transfected.

B Percobaan yang sama diulangi dengan plasmid PCH-9-3091, yang berisi 1,1 kali lipat lebih
panjang HBV genom. DNA HBV dalam supernatan diukur pada hari empat via PCR,
menggunakan primer yang istimewa memperkuat HBV rcDNA daripada 1,1 kali lipat lebih
panjang urutan HBV yang terkandung dalam plasmid.

C RT-qPCR hasil dari lisat sel (percobaan yang sama seperti pada panel A) dengan primer
spesifik untuk transkrip HBV 3,5-kb (terdiri dari pre-genom [pg] RNA dan pre-core
transkrip; kiri), atau dengan primer yang mendeteksi semua transkrip HBV (kanan).
D analisis Southern blot dari lisat diperoleh 72 jam pasca-transfeksi sel HepG2 diperlakukan
dengan plasmid yang sama seperti pada panel (A).

Informasi Data: Diagram di panel (A-C) menunjukkan nilai rata-rata dan SEM (semua
percobaan dilakukan di tiga ulangan). Signifikansi dihitung menggunakan satu arah
ANOVA dengan koreksi beberapa perbandingan Tukey. S / CO, signal-to-kontrol rasio;
rcDNA, santai DNA melingkar; dlDNA, duplex-linear DNA, DNA linear untai ganda;n.s.,
non-signifikan; * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001; **** P <0,0001. Lihat Lampiran Tabel
S1 untuk n tepat dan P-nilai.

Sebaliknya, dua lainnya kaset-H1-shHBV7 atau TTR-miHBV7- berkumpul dalam diri


komplementer (sc) vektor AAV-04/02 genom (Grimm et al, 2006). Perbedaan-perbedaan ini tidak
relevan untuk eksperimen transfeksi dalam kultur sel tapi penting dalam vivo mana vektor scAAV
mengungkapkan lebih cepat dan kokoh (Grimm et al, 2006; McCarty, 2008).

TUD inklusi untuk mengurangi shRNA off-penargetan dan meningkatkan efisiensi RNAi

Selanjutnya, kita direkayasa sebuah jepit rambut TUD RNA untuk secara khusus mengikat dan
menetralkan shHBV7 rasa strand (Gambar 1Civ). Berdasarkan kami baru-baru ini dijelaskan
aturan (Mockenhaupt et al, 2015), kami kloning dua situs mengikat untuk shHBV7 rasa untai dan
menyatakan dihasilkan TuDHBV7 dari promotor U6. U6-TUD kemudian disisipkan hilir kaset
H1-shHBV7 di vektor scAAV backbone (Lampiran Gambar S2). Untuk menilai shHBV7 akal
dibandingkan antisense-strand sel aktivitas dan fungsi TUD, kita bersama-transfected dengan
shHBV7 / TuDHBV7 plasmid dan dual-luciferase reporter membawa situs mengikat sempurna
baik shHBV7 akal atau antisense strand di 30 wilayah yang tidak diterjemahkan (UTR) dari
Renilla luciferase (Gambar 3A). kontrol negatif termasuk (i) shRNA tidak relevan terhadap alpha-
1-antitrypsin manusia (sha1AT), (ii) TUD terhadap arti untai sha1AT dan (iii) reporter luciferase
tanpa shRNA situs mengikat.

Ekspresi shHBV7 substansial menghambat antisensestrand yang reporter, terlepas dari


yang TUD adalah co-diungkapkan (Gambar 3B, kelompok shHBV7). Reporter akal-strand juga
ditekan oleh> 65% dengan adanya kontrol TUD, memperkuat Data terbaru kami yang kedua untai
shRNA sering aktif
Gambar 3. Peningkatan shHBV7 kekhususan dan efisiensi dengan co-ekspresi dari TUD
terhadap untai akal Sebuah Skema uji untuk menentukan kegiatan strand shRNA dengan
tidak adanya atau kehadiran Tuds tertentu. sel Huh7 yang co-transfected dengan shRNA
dan TUD dikodekan pada plasmid yang sama, dan seorang reporter luciferase dengan untai
situs mengikat shRNA tepat. bs, situs mengikat.

B Pengukuran mengakibatkan kegiatan luciferase di lisat sel 48 jam pasca-transfeksi.


Catatan penghambatan ampuh shHBV7 aktivitas akal-strand dengan spesifik TuDHBV7,
tanpa campur tangan dengan untai antisense (bandingkan meninggalkan dua bar oranye
atau biru, masing-masing). bs, situs mengikat.

C In vivo evaluasi yang berbeda kombinasi shRNA dan TUD setelah kemasan ke dalam untai
ganda vektor AAV8 dan intravena (i.v.) injeksi 1 × 1011 partikel ke tikus HBV-transgenik
(HBV1.3.32). aktivitas anti-HBV ditentukan dengan mengukur kadar HBsAg dan HBeAg
dalam serum hewan diperlakukan pada saat ditunjukkan menunjuk pasca-AAV injeksi.

Informasi Data: Diagram di panel (B dan C) menunjukkan nilai rata-rata dan SEM.
Signifikansi dihitung menggunakan Student t-test. Percobaan pada panel (B) adalah
dilakukan di tiga ulangan. Diagram di panel (C) menunjukkan data panel dari tiga
percobaan dengan setidaknya lima tikus per kelompok perlakuan. n.s., non-signifikan; * P
<0,05;** P <0,01; *** P <0,001; **** P <0,0001. Lihat Lampiran Tabel S1 untuk n tepat dan
P-nilai. Panel (A) mengandung clipart dari Servier Medis Art.

(Mockenhaupt et al, 2015). Yang penting, ini yang tidak diinginkan akal-strand Kegiatan ini
diakhiri pada co-ekspresi TuDHBV7 (Gambar 3B, kelompok shHBV7). Semua kontrol
berperilaku seperti yang diharapkan, karena ekspresi reporter luciferase shHBV7-sensitif itu tidak
dihambat oleh shRNA tidak relevan atau oleh dua Tuds (yang mengerahkan Kegiatan RNAi tidak
melekat).

Kami depan yang bertujuan untuk memverifikasi hasil ini dalam model in vivo dari
hepatitis B kronis Untuk ini, kami menggunakan mouse HBV-transgenik regangan HBV1.3.32,
yang membawa kromosom terintegrasi 1,3 kali lipat lebih-panjang HBV genom (Guidotti et al,
1995). DNA virus ini mengungkapkan semua transkrip HBV dan antigen, dan itu adalah
replicationcompetent dan menghasilkan menular tipe liar HBV genotipe D. Kami dikemas
berbagai konstruksi encoding hanya shRNA atau shRNA ditambah TUD (Gambar 3C, ditunjukkan
di bagian bawah) ke dalam capsids AAV8 dan intravena disuntikkan 1 × 1.011 partikel per tikus.
Sungguh, vektor ganda co-mengungkapkan shHBV7 dan TuDHBV7 tidak hanya efisien ditekan
HBV tetapi mengungguli dua vektor mengekspresikan shHBV7 saja, atau co-encoding shHBV7
dan kontrol TUD, sebagai dibuktikan dengan penurunan yang signifikan dari HBsAg serum dan
HBeAg (Gambar 3C, bar hijau). Perbedaan itu terutama diucapkan pada titik waktu paling awal (5
hari) pasca injeksi, menunjukkan bahwa shRNA7 / TUD membangun juga lebih cepat dalam
menghambat HBV in vivo. Kontrol shRNA hanya memiliki efek kecil pada HBsAg ekspresi
(hitam / abu-abu bar) dan tidak HBsAg atau HBeAg yang secara signifikan mengubah pada co-
ekspresi baik TUD, berdebat terhadap pengaruh umum Tuds pada ekspresi HBV.

Kami kemudian dibandingkan keempat varian vektor dari Gambar 1C berdampingan


dalam model kultur sel HBV untuk efek mereka pada HBV protein, DNA dan RNA (Gambar 4).
Meskipun aktivitas yang melekat tinggi dari shHBV7 shRNA, kami mengamati tren ke arah lebih
lanjut perbaikan melalui Ago-2 co ekspresi setidaknya untuk disekresi parameter (terbaik penting
untuk HBV DNA dalam supernatan, yang knock-down meningkat 57,3-73,5%). Hal ini sejalan
dengan sifat tingkat-membatasi Ago-2 dijelaskan oleh kita dan orang lain (Diederichs et al, 2008;
Grimm et al, 2010; Borner et al, 2013). Itu TTR-miHBV7 konstruk itu biasanya kurang efisien
dari yang lain strategi tapi masih mencapai substansial anti-HBV RNAi. Southern analisis blot
menunjukkan penurunan yang kuat dari DNA HBV intraseluler oleh keempat vektor, dengan
vektor miHBV7 lagi menunjukkan setidaknya efek diucapkan (Gambar 4D). Kongruen dengan in
vivo eksperimen pada Gambar 3C, ada kecenderungan penghambatan HBV yang lebih baik
dengan TUD co-mengungkapkan vektor dibandingkan dengan shHBV7-satunya membangun,
yang paling mencolok dalam analisis RNA HBV (Gambar 4C).

-Jangka panjang in vivo perbandingan side-by-side dari semua empat strategi

Kami selanjutnya diperpanjang analisis in vivo dari shHBV7 vs shHBV7 / TuDHBV7


vektor untuk 3 bulan dan termasuk Ago-2 co-ekspresi dan Mirna embedding strategi untuk
langsung membandingkan efisiensi dan keselamatan mereka. Semua varian vektor yang intravena
disuntikkan ke tikus HBV-transgenik pada 1 × 1.011 partikel per hewan (Gambar 5A). Sebangun
dengan jangka pendek kami dalam analisis vivo (Gambar 3C, juga menegaskan pada Gambar 6A),
yang shRNA-satunya vektor poten mengetuk bawah HBV, yang berpuncak pada 97% serum
pengurangan HBsAg pada 4 minggu pasca-injeksi (Gambar 5B, ungu; sesuai HBV DNA dan RNA
Data yang ditunjukkan pada Gambar EV2). toksisitas Namun, vektor ini juga disebabkan yang
dibuktikan dengan kenaikan terbelakang berat badan dari diperlakukan hewan (dibandingkan
dengan semua strategi ekspresi shHBV7 lainnya, Gambar 5C) dan tingkat ALT pada 1-4 minggu
pasca injeksi (Gambar 5D). Hal ini bertepatan dengan pengurangan massa hati pada individu

Gambar 4. Sebagai perbandingan vitro berbeda RNAi memicu. Sebuah sel Huh7 yang co-
transfected dengan ekspresi HBV plasmid PCH-HBV1.3 dan empat konstruksi utama
diteliti dalam penelitian ini, atau dengan AAV kosong Ekspresi plasmid yang berfungsi
sebagai kontrol negatif. kontrol negatif lain adalah sel mock-transfected. HBeAg dan HBsAg
dikuantifikasi dalam supernatan 48 h kemudian.

B Pengukuran DNA HBV di supernatan kultur sel 4 hari setelah co-transfeksi sel Huh7
dengan plasmid pengkodean 1,1 kali lipat lebih panjang HBV urutan (PCH-9-3091) dan
plasmid sama RNAi ekspresi seperti dalam panel (A). PCR dilakukan dengan menggunakan
primer yang membedakan antara HBV rcDNA dan 1.1 kali lipat lebih-urutan panjang HBV
yang terkandung dalam plasmid. Hasil C RT-qPCR menggunakan primer spesifik untuk
3.5-kb HBV transkrip (termasuk RNA pre-genomik dan transkrip pra-core, kiri), atau
primer yang mendeteksi semua HBVtranskrip (kanan).

D analisis Southern blot dari lisat diperoleh 72 jam pasca-transfeksi sel HepG2 dengan
plasmid yang sama seperti yang dijelaskan dalam panel (A).

Informasi Data: Diagram di panel (A-C) menunjukkan nilai rata-rata dan SEM (semua
percobaan dilakukan di tiga ulangan). Signifikansi dihitung menggunakan satu arah
ANOVA dengan koreksi beberapa perbandingan Tukey. S / CO, signal-to-kontrol rasio; n.s.,
non-signifikan; rcDNA, santai DNA melingkar; dlDNA, DNA dupleks-linear; * P <0,05;** P
<0,01; *** P <0,001; **** P <0,0001. Lihat Lampiran Tabel S1 untuk n tepat dan P-nilai.

tikus diperlakukan dengan shHBV7-satunya vektor pada hari 15 (diukur dalam eksperimen
terpisah ditunjukkan pada Gambar EV3, ungu). Sisi yang sama Efek-mengurangi berat badan dan
ALT elevasi-juga diamati dengan kontrol yang tidak terkait shRNA (Gambar 5C dan D, hitam),
menegaskan kembali laporan (Grimm et al, 2006; Beer et al, 2010) bahwa bahkan rendahnya
tingkat shRNA tidak sepenuhnya tanpa efek samping terdeteksi.
Gambar analisis jangka panjang-5. berbeda vektor anti-HBV AAV pada tikus HBV-
transgenik. Sebuah Skema dari lima vektor yang berbeda digunakan untuk in vivo
perbandingan. ss, untai tunggal; sc, self-komplementer; i.v., intravena. B-D Penentuan anti-
HBV efikasi dan keamanan dengan mengukur HBsAg dalam serum tikus yang diobati (B),
berat badan mereka tubuh (C) dan tingkat ALT serum (D) E Haematoxylin / Eosin (HE)
noda dari hati dipanen pada hari 84. Skala bar di kanan bawah mewakili 100 lm.

Informasi Data: Diagram menunjukkan nilai rata-rata dan SEM 5-6 tikus per kelompok.
Signifikansi dalam panel (B) dihitung dengan menggunakan Student t-test, dan di panel (C
danD) menggunakan ANOVA satu arah, membandingkan setiap kelompok untuk vektor
mengungkapkan hanya shHBV7. n.s., non-signifikan; * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001.
Lihat Lampiran Tabel S1 untuk n tepat dan P-nilai.

Penting yang perlu diperhatikan adalah bahwa toksisitas diamati secara keseluruhan
ringan, seperti ditunjukkan dengan tidak adanya perubahan histologis signifikan pada akhir (hari
84, Gambar 5E) atau waktu awal (hari 15, Gambar EV4) pasca-AAV injeksi. Bersama-sama, ini
menegaskan bahwa bahkan mungkin dioptimalkan kondisi-lemah promotor shRNA dan moderat
vektor dosis- tidak dapat sepenuhnya mengatasi tingkat rendah toksisitas akut dari tradisional
shRNA vektor dan bahwa perbaikan tambahan yang diperlukan.

Hebatnya, co-ekspresi Ago-2, embedding dari shHBV7 di konteks Mirna serta co-ekspresi
TuDHBV7 semua mampu menyelamatkan efek samping ini. tikus yang diobati naik berat badan
(Gambar 5C), tidak menunjukkan peningkatan aktivitas ALT (Gambar 5D) dan tidak ada
pengurangan massa hati pada hari 15, identik dengan mengendalikan hewan diperlakukan dengan
non-coding AAV (Gambar EV3). Ini juga diverifikasi bahwa toksisitas dari shRNA-satunya vektor
secara eksklusif karena ekspresi shRNA dan tidak komponen vektor lainnya. Itu perbaikan
keamanan selama shRNA-satunya vektor cenderung untuk menjadi yang terbaik pada tikus di
mana shRNA diungkapkan dari perancah mir-122 dan di bawah TTR promotor hati-spesifik,
sesuai dengan laporan bahwa Mirna embedding mengurangi in vivo toksisitas RNAi (Ely et al,
2008, 2009; McBride et al, 2008; Boudreau et al, 2009) (Gambar 5C dan D, dan EV3). Namun,
perbedaan ke Ago-2 atau TUD strategi co-ekspresi tidak signifikan secara statistik. Bahkan, dari
semua konfigurasi, vektor TTR-miHBV7 adalah paling tidak efisien di menghambat HBV
(Gambar 5B), konsisten dengan data kultur sel kami (Gambar 4).
Menariknya, efisien penghambatan HBV jangka panjang diperoleh dengan vektor co-
mengungkapkan Ago-2 dari TTR hati-spesifik promotor, untuk gelar yang cocok dengan
konvensional shRNA-satunya membangun (Gambar 5B). Menimbang bahwa Ago-2 vektor adalah
singlestranded AAV yang menyatakan lebih lambat dan kurang poten dari genom scAAV yang
digunakan untuk shRNA-satunya vektor, ini adalah yang luar biasa dan memvalidasi temuan kami
sebelumnya bahwa Ago-2 codelivery meningkatkan potensi shRNA di hati tikus (Grimm et al,
2010; Borner et al, 2013). Selain itu, lebih dari-mengekspresikan Ago-2 toksisitas lega
dibandingkan dengan tikus yang menerima hanya shRNA, sebagaimana dibuktikan oleh
keuntungan berat badan dan kadar ALT normal pada shHBV7 / Ago-2 kohort (Gambar 5C dan
D).

Yang perlu diperhatikan, terkuat dan paling gigih HBV knock-down dicapai dengan vektor
bi-cistronic co-mengungkapkan shHBV7 dan rasa-untai TUD, yang dihambat HBsAg oleh 98,5%
dan secara signifikan mengungguli semua konstruksi lain di awal dan akhir titik waktu (Gambar
5B, hijau). Seperti yang diamati untuk Ago-2 co-ekspresi dan Mirna strategi, vektor shHBV /
TuDHBV7 mampu meringankan in vivo toksisitas RNAi seperti yang didokumentasikan oleh
pengukuran bobot tubuh (Gambar 5C), serum transaminase (Gambar 5D) dan massa hati (Gambar
EV3). Selanjutnya, analisis histologis hati tidak mengungkapkan signifikan perubahan
mikroarsitektur hati atau kerusakan hati ketika dibandingkan dengan kontrol mock (Gambar 5E).
khasiat antivirus superior ini dikombinasikan dengan profil keamanan yang sangat baik
mendorong kami untuk memilih vektor shHBV / TuDHBV7 sebagai kandidat utama kami.

Analisis ekspresi gen global pada tikus vektor-diperlakukan

Selanjutnya, kami menilai apakah ekspresi shRNA saja memiliki dipengaruhi ekspresi gen
hati pada hewan diperlakukan, dan apakah hasil berbeda setelah TUD co-pengiriman. Untuk tujuan
ini, kita lagi menyuntik tikus HBV-transgenik dengan vektor yang sama digunakan pada Gambar
5 dan kali ini juga termasuk vektor AAV kosong sebagai kontrol. Seperti dalam Percobaan kami
sebelumnya, vektor shHBV7 / TuDHBV7 lebih cepat dan lebih efisien dalam menekan HBV dari
semua vektor lainnya, mencapai pengurangan HBsAg dari 96,7% 15 hari setelah injeksi
(dibandingkan untuk 93,5% di shHBV7-satunya kelompok) (Gambar 6A, hewan yang sama seperti
pada Gambar EV3). Kami dipanen semua hati pada titik waktu ini (hari 15) dan diprofilkan lebih
dari 26.000 gen dari empat hewan per perlakuan kelompok. Seperti ditunjukkan dalam Gambar
6B, ekspresi shHBV7 saja telah menyebabkan disregulasi signifikan dari 126 gen (67 down dan
59 diregulasi) dibandingkan dengan kontrol hewan. Di antara 67 downregulated gen, kita bisa
menganalisis urutan 51 (Gambar 6C; Tabel Lampiran S2 dan S3). Menariknya, 41 (80,4%) dari
ini dilakukan pertandingan benih rasa-strand shHBV7 (nt 2-7), mewakili pengayaan signifikan
secara statistik (dibandingkan dengan latar belakang frekuensi; uji dua sisi chi-square, P <0,05).
Dua puluh dua dari 51 gen (43,1%) memiliki pertandingan benih antisense-strand (21 dilakukan
kedua). Hanya 9 dari 67 gen turun-diatur kekurangan pertandingan benih untuk salah satu dari dua
helai shHBV7. Di antara 59 up-diatur gen, pertandingan benih rasa-untai ditemukan pada 66,0%
dan antisense-strand Pertandingan benih di 32,0%. Kedua nomor mencerminkan latar belakang
frekuensi semua gen pada chip microarray (akal: 65,8%; antisense 31,2%), menunjukkan tidak ada
korelasi yang spesifik antara shHBV7 dan gen up-diatur. Hebatnya, gangguan ini ekspresi gen lega
di ketiga kohort diobati dengan vektor shRNA membaik, seperti dibuktikan dengan hanya satu
(shHBV7 / TUD) atau tidak (shHBV7 / Ago-2 atau miHBV7) gen secara signifikan disregulasi
(Gambar 6B). Secara keseluruhan, ini Pola transcriptome berkorelasi dengan baik dengan data
toksisitas (Gambar 5C dan D) dan hati pengukuran berat badan (Gambar EV3), di mana Kelompok
shHBV7 adalah juga satu-satunya outlier terlihat. Kami kemudian dilakukan analisis sebaliknya,
yang bukan mengidentifikasi gen dalam setiap kelompok vektor yang signifikan disregulasi, kami
pertama kali dikategorikan semua gen berdasarkan pada keberadaan pertandingan benih shHBV7
(untuk setiap untai shRNA) dan kemudian dibandingkan tingkat mereka perubahan. Untuk ini,
kami fokus pada 30 urutan UTR yang kita bisa mengambil hampir 19.000 gen. Menariknya, kami
menemukan sekitar lima kali lebih shHBV7 indrawi dari pertandingan benih antisense-strand
(1933 vs 388; Lampiran Tabel S2). Seperti yang diharapkan, kami mengamati ada perubahan
dalam gen kurang pertandingan benih benih-untai shHBV7 di 30 mereka UTRs, ketika
membandingkan kelompok eksperimen berbeda dengan vektor kosong control (Gambar 6D atas).
Juga seperti yang diperkirakan, gen menyimpan antisensestrand pertandingan biji ditekan di semua
kelompok untuk serupa mana, menunjukkan bahwa semua konfigurasi vektor dapat memediasi
antisense-strand-mediated off-penargetan (Gambar 6D bawah). Dari catatan, gen membawa
pertandingan benih akal-untai ditekan di semua kelompok dengan pengecualian tunggal hewan
yang co-mengungkapkan shRNA akal-untai TUD, yang secara signifikan berbeda dari semua
kelompok lainnya (Gambar 6D tengah).
ekspresi gen Akhirnya, kami langsung dibandingkan antara shHBV7- dan shHBV7 /
TuDHBV7-diperlakukan hewan. Kami menggunakan kumulatif fungsi distribusi (CDF, lihat
Bahan dan Metode) untuk menyelidiki apakah gen dengan pertandingan benih shHBV7 di 30
mereka UTR yang berbeda-beda dipengaruhi oleh TuDHBV7 co-ekspresi dibandingkan dengan
gen tanpa pertandingan benih masing-masing. Hebatnya, analisis CDF menunjukkan bahwa gen
dengan 30 Pertandingan benih UTR shHBV7 akal-strand secara signifikan (P <0,05, dua sisi, dua-
sampel Welch t-test) lebih up-diatur oleh TuDHBV7 co-ekspresi dari gen tanpa pertandingan ini
(Gambar EV5). Tidak ada korelasi tersebut diamati untuk gen

Angka 6. jangka pendek dalam penelitian vivo untuk menganalisis shHBV7 dari target
kegiatan.Sebuah tikus HBV-transgenik (lima di kelompok pura-pura, enam di semua orang
lain) disuntik secara intravena dengan 1 × 1011 partikel vektor AAV8 yang ditampilkan,
dan HBsAg diukur dari serum pada berbagai waktu poin pasca injeksi. Lima belas hari
pasca perawatan, mRNA ekspresi dalam hati dianalisis menggunakan microarray.
Signifikansi dihitung menggunakan Student t-test. Gen B secara signifikan disregulasi
dibandingkan dengan mengejek hewan diperlakukan (tingkat penemuan palsu <0,25;
dibandingkan dengan mock). C Transkrip gen secara signifikan atas atau bawah-diatur oleh
shHBV7 dianalisis untuk kehadiran rasa shHBV7 atau antisense 2 sampai pertandingan
benih 7-nt dan dibandingkan dengan frekuensi latar belakang dalam semua gen pada
microarray. Signifikansi dihitung menggunakan uji chi-square dengan koreksi Yates. D
Semua gen pada microarray dikelompokkan sesuai dengan kehadiran 30 rasa UTR shHBV7
atau pertandingan benih antisense. Tampil adalah ekspresi relatif mereka dibandingkan
untuk vektor kosong. Signifikansi dihitung menggunakan uji Mann-Whitney. Informasi
Data: Diagram di panel (A dan D) menunjukkan nilai rata-rata dan SEM n.s., non-
signifikan; * P <0,05; ** P <0,01. Lihat Lampiran Tabel S1 untuk n yang tepat dan P-nilai.

menyembunyikan (atau tidak) 30 Pertandingan benih UTR shHBV7 antisense-strand (Tidak


ditampilkan), menunjukkan bahwa TUD telah secara khusus diselamatkan gen dengan
pertandingan benih rasa-untai, sebagai harapkan.

Diskusi

Tujuan dari studi kami adalah untuk mengevaluasi potensi RNAi baru Strategi ekspresi yang kita
baru saja didirikan pada berbudaya sel (Mockenhaupt et al, 2015) -CO-ekspresi shRNA bersama-
sama dengan inhibitor akal-strand yang aktivitas-untuk terapi penekanan HBV di hati tikus HBV-
transgenik dewasa. kunci kami Temuan itu (i) bahwa vektor ganda shRNA / TUD AAV memberi
kuat dan jangka panjang dalam penghambatan HBV vivo tanpa toksisitas terdeteksi dan (ii) bahwa
keseluruhan mengungguli tiga alternatif ekspresi RNAi strategi termasuk shRNA konvensional,
bersama-sama menyiratkan nya janji besar sebagai baru modalitas anti-HBV klinis yang berlaku
(Diringkas dalam Tabel 1). Untuk mengembangkan vektor novel ini, kita dibangun di atas
identifikasi sebelumnya tantangan untuk terjemahan strategi RNAi antivirus. Satu Masalah utama
adalah kekhawatiran tentang kekhususan penghambatan gen dan persaingan dengan mesin
endogen Mirna (Grimm et al, 2006; Diederichs et al, 2008; Khan et al, 2009; Grimm, 2011).
Meskipun efek ini shRNA tergantung dosis, itu adalah bijaksana untuk mengurangi jumlah vektor
seperti menyiratkan risiko hilang terinfeksi HBV sel dan / atau mencapai memadai knock-down.
Memang, ketika kami menggunakan dosis partikel 5 × 1010 AAV, transduksi hati dan
penghambatan replikasi HBV di HBV-transgenik tikus berada di bawah 50% (tidak ditampilkan).
Sebuah peningkatan dua kali lipat untuk 1 × 1011 didorong anti-HBV potensi untuk lebih dari
90%, tetapi perubahan yang halus ini juga disebabkan toksisitas, kongruen dengan data dengan
shRNAs lainnya disampaikan di AAV8 yang sama dosis pada tikus (Grimm et al, 2006; Maczuga
et al, 2014) dan menggambarkan kesulitan dalam mencolok keseimbangan antara potensi dan
keamanan bila menargetkan HBV in vivo. Tantangan kedua dengan HBV dan virus lainnya adalah
keberadaan mereka genotipe sebagai berbeda dan kecenderungan mereka untuk mutase melarikan
diri di bawah terapi. Hal ini menciptakan tekanan untuk menargetkan daerah-daerah yang tidak
hanya mengizinkan RNAi kuat dan spesifik tetapi juga sangat dilestarikan, untuk memastikan
keberhasilan yang luas dan terus-menerus. Ada dua solusi yang mungkin yang keduanya inheren
bermasalah. Satu adalah Temukan rasional shRNAs baru yang ampuh dan dilestarikan; Namun,
ini mungkin berbenturan dengan keinginan untuk juga mengurangi off-target atau kewajiban
saturasi. Contohnya adalah shHBV7 yang target diawetkan dan yang efektif, tetapi tidak aman jika
dinyatakan sendirian. Atau, pengguna mungkin sudah memiliki pra-divalidasi dan kuat shRNA,
tapi ini mungkin lagi menjadi suboptimal terhadap keamanan. Kedua skenario sehingga
memerlukan desain de novo dan skrining dari shRNAs tambahan, sebagai negara-of-the-art
teknologi saat ini tidak menawarkan cara untuk langsung mengoptimalkan keamanan dari RNAi
yang ada jepit rambut. Masalah ini juga tidak diselesaikan dengan salah satu dari tiga pendekatan
yang kami mengevaluasi sini, shRNA embedding dalam buatan konteks Mirna, karena juga
memerlukan redesain shRNAs tersedia. Namun, sejalan dengan pekerjaan sebelumnya (McBride
et al,2008; Boudreau et al, 2009), miHBV7 adalah salah satu yang paling aman kami vektor. Selain
itu, satu-satunya strategi tiga memungkinkan Ekspresi RNAi dari RNA polymerase II promotor
yang memberikan kesempatan untuk kontrol spatio-temporal, sebagaimana dicontohkan di sini
dengan TTR promotor hati-spesifik. Namun, miHBV7 vektor kurang efisien daripada shRNA
konvensional atau dua strategi lain ekspresi (Ago-2 atau TUD), membenarkan data vivo dengan
konstruksi yang sama (Boudreau et al, 2008; Ely et al, 2008) dan selanjutnya menggambarkan
persaingan antara potensi dan keselamatan. Dalam hal ini, keuntungan besar dari dua lainnya
approaches- Lalu-2 atau TUD co-ekspresi-adalah bahwa keduanya sepenuhnya kompatibel dengan
ada atau shRNAs baru. Untuk strategi TUD, satu-satunya persyaratan adalah bahwa shRNA
mengikuti aturan sederhana desain kami (Mockenhaupt et al, 2015). Kedua pendekatan demikian
biasanya mengizinkan untuk meningkatkan shRNA potensi dan keamanan tanpa perlu mendesain
ulang pemicu RNAi. Menariknya, meski modus yang berbeda aksi mereka, kedua strategi juga
membaik toksisitas shRNA. Dalam kasus Ago-2 berlebih, penjelasan yang mungkin adalah bahwa
lebih RISC Kompleks menjadi tersedia untuk shHBV7 dan endogen miRNAs, sehingga
mengurangi hambatan utama dalam jalur RNAi (Diederichs et al, 2008; Grimm et al, 2010;
Cuccato et al, 2011; Borner et al, 2013). Yang penting, sengaja Ago-2 co-ekspresi dari shRNA-
encoding vektor AAV sebagai sarana untuk meningkatkan anti-HBV RNAi in vivo tidak pernah
dilaporkan sebelumnya.

Hal yang sama berlaku untuk strategi awal kita bahwa kita diuji di sini, untuk pertama kalinya,
dalam model HBV seluler dan murine, yaitu penetralan aktivitas akal-strand shRNA dengan Tuds.
Salah satu aset utama adalah bahwa hanya prasyarat adalah lokasi shRNA rasa strand dalam 5’
lengan (Mockenhaupt et al, 2015), yang khas untuk shRNAs diterbitkan dan default di sebagian
besar algoritma desain shRNA. Selanjutnya luar biasa adalah bahwa strategi ini menggabungkan
efisiensi tinggi dengan toksisitas rendah, menghasilkan tercepat, terkuat dan paling gigih di HBV
vivo knock-down dalam semua perbandingan kami. kita sekarang dan data terakhir (Mockenhaupt
et al, 2015) secara kolektif menunjukkan bahwa manfaat ini mencerminkan sinergi dari efek
langsung dan tidak langsung. Salah satu konsekuensi tidak langsung dari shRNA akal-strand
penghambatan bisa bahwa itu akan membebaskan RISC untuk pemuatan antisense strand yang
diinginkan dan selanjutnya degradasi sasaran mRNA, yang dapat menjelaskan Efisiensi anti-HBV
yang lebih baik. Dukungan datang dari Jin et al yang terpisah menyatakan dua helai siRNA dan
mencatat bahwa seorang kerabat pengurangan helai akal meningkat RISC memuat dengan
dimaksudkan antisense strand (Jin et al, 2012). Tambahan RISC bisa juga dimanfaatkan oleh
miRNAs seluler yang pada gilirannya akan mengurangi persaingan dengan shRNAs eksogen dan
karenanya mengurangi toksisitas yang disebabkan oleh kejenuhan jalur RNAi. Ini akan lebih
berkontribusi untuk jangka panjang in vivo RNAi keamanan dan potensi, mirip dengan efek Ago-
2 over-ekspresi (lihat di atas) dan juga konsisten dengan data mouse kita. Selain itu, akibat
langsung dari TUD co-ekspresi yang harus tambahan meningkatkan keselamatan shRNA mungkin
pembalikan parsial merugikan off-penargetan oleh shRNA rasa untai. Hal ini tersirat oleh Data
kultur sel kami di mana TUD sangat menghambat shHBV7 Kegiatan akal-strand terhadap
wartawan serumpun, konsisten dengan kami baru-baru ini independen in vitro pengamatan dengan
lainnya AAV / TUD vektor (Mockenhaupt et al, 2015). Baru in vivo data lebih lanjut mendukung
kesimpulan ini, sebagai kelompok gen menyimpan shHBV 7pertandingan benih akal-strand di 30
mereka UTR ditekan oleh semua RNAi membangun kecuali untuk vektor shHBV7 / TuDHBV7.
Kami Gagasan bahwa gen dengan pertandingan benih antisense-strand yang ditekan sampai batas
yang lebih tinggi lima kali lipat dapat dijelaskan oleh dilusi sebuah Efek dari target tinggi
kelimpahan (Arvey et al, 2010), mengingat bahwa pertandingan benih shHBV7 akal-strand lima
kali lebih sering terjadi di seluruh kolam gen dalam hati tikus. Bukti lebih lanjut untuk TUD-
dimediasi dalam pencegahan vivo akal-untai off-penargetan berasal dari perbandingan langsung
kami ekspresi gen antara shHBV7- dan shHBV7 / TuDHBV7-diperlakukan hewan menggunakan
CDF, menunjukkan bahwa gen dengan 30 pertandingan benih UTR akal-strand yang secara
signifikan lebih up-diatur oleh TuDHBV7 dari gen tanpa. Akhirnya, mengurangi toksisitas dan
aktivitas off-target yang lebih lanjut tercermin dengan 126 gen teregulasi dalam kelompok tikus
shHBV7-satunya kami, versus satu atau tidak pada semua kelompok lainnya termasuk TUD-
diperlakukan hewan. Jumlah 126 dianggap off-target sangat mengingatkan dari hasil oleh
Maczuga et al (2014) yang menggambarkan 106 dysregulated gen pada tikus diobati dengan AAV
/ shRNA vektor, menunjukkan ini mungkin berbagai khas in vivo. Namun, untuk alasan yang
dijelaskan di rinci dalam Lampiran Tambahan Diskusi, seseorang harus mengerahkan -hati ketika
menafsirkan kompleks seperti dalam data vivo dan menugaskan gen sebagai off-target langsung.

Kesimpulannya, kami telah mengidentifikasi berbasis AAV ekspresi RNAi baru Strategi yang
menyediakan lebih dalam potensi vivo, spesifisitas dan keselamatan penghambatan HBV dari
vektor shRNA tradisional, sehingga calon yang menarik untuk pengembangan lanjutan menuju
klinis aplikasi. Sangat menggembirakan adalah luar biasa secara keseluruhan profil keamanan
vektor AAV pada manusia yang diamati di atas 100 uji klinis sejauh ini, termasuk berbagai aplikasi
yang berbeda serotipe virus pada hati (Manno et al, 2006; Nathwani et al, 2011, 2014; D'Avola et
al, 2016). Sejalan dengan ini, yang pertama produk terapi gen disetujui di belahan bumi Barat,
Glybera, berdasarkan vektor AAV rekombinan dari serotipe 1 (Salmon et al,2014). Juga penting
untuk dicatat adalah bahwa laporan terbaru dari kemungkinan asosiasi AAV dengan kanker hati
(Nault et al, 2015) adalah tidak relevan untuk penggunaan vektor AAV, karena urutan virus
tertentu yang ditemukan diintegrasikan dalam jaringan kanker tidak hadir di vektor AAV. Selain
itu, data dan kesimpulan dalam laporan ini datang di bawah pengawasan intens dalam komunitas
terapi gen (Berns et al, 2015; Buning & Schmidt, 2015). selanjutnya menggembirakan sehubungan
dengan terjemahan klinis dari strategi kami adalah bahwa vector dosis kami diterapkan di sini pada
tikus-1 × 1.011 partikel per hewan, sesuai untuk 5 × 1012 partikel per kg-baik dalam kisaran dosis
yang telah digunakan untuk transfer gen hati pada manusia, seperti 2 × 1012, 3 × 1012 atau 1,8 ×
1013 partikel AAV per kg (Nathwani et al, 2011, 2014; D'Avola et al, 2016; tinggi & Anguela,
2016). Terutama, uji coba ini juga telah memberikan bukti jelas bahwa dosis tunggal vektor AAV
dapat cukup untuk memediasi transgen stabil ekspresi dalam hati manusia untuk minimal 4 tahun,
dengan tidak adanya efek samping yang parah (High & Anguela 2016). Selain itu, kita bisa mudah
meramalkan bahwa diperlukan dosis vektor pada manusia akan lebih lanjut turun karena
peningkatan jumlah superior-lebih efisien dan lebih capsids spesifik-AAV yang molekuler
berkembang dalam sel hati dan dapat masuk klinik, seperti AAV-DJ (Grimm et al, 2008) atau
AAVLK03 (Lisowski et al, 2014). Dari catatan, seperti capsids AAV sintetis juga dapat dipilih
untuk rendah reaktivitas silang dengan antibody terhadap serotipe AAV alami, sehingga
memungkinkan vektor readministration dalam kasus efek dosis tunggal mungkin berkurang
(Grimm & Zolotukhin, 2015).

Secara bersamaan, kami optimistis stabil selama-ekspresi Lalu-2 atau Tuds harus ditoleransi
dengan baik pada manusia. keselamatan mereka tersirat oleh jumlah data dalam karya ini dan di
sebelumnya sastra, termasuk laporan oleh kita dan orang lain yang Ago-2 dapat menerus
dinyatakan dalam sel mamalia dan hati mouse, tanpa menginduksi kelainan atau patologi bruto
(Diederichs et al, 2008; Grimm et al, 2010; Borner et al, 2013). Demikian juga, kami menemukan
tidak ada bukti dalam penelitian ini untuk merugikan in vivo efek meskipun 3 bulan over-ekspresi
Ago-2, berdasarkan tingkat ALT normal, keuntungan berat badan seperti yang diharapkan serta
histologi hati normal. Sementara kita sama-sama berharap bahwa ekspresi TUD akan ditoleransi
dan aman pada manusia, kita ingin menunjukkan bahwa Tuds, pada prinsipnya, dapat mengganggu
ekspor nuklir miRNAs seluler. Ini adalah karena struktur hairpin mereka dengan 3’ overhang, yang
membuat mereka substrat untuk transporter nucleocytoplasmic Exportin-5 (Bak et al, 2013) yang
juga digunakan oleh miRNA. Ini lanjut mungkin bahwa jangka panjang dan tingkat tinggi ekspresi
Ago-2 akhirnya dapat dysregulate pengolahan dan / atau kegiatan mendogen Ago-2-dependent
RNA kecil. Dengan demikian kita menganggap itu wajib untuk bekerja tindak lanjut untuk benar-
benar menyelidiki potensi gejala sisa persisten Ago-2 ekspresi / TUD, termasuk dunia profil RNA
kecil di hati tikus diperlakukan sebagai penting lebih lanjut langkah pra-klinis terhadap evaluasi
klinis novel kami konsep pada pasien HBV. pekerjaan di masa depan ini juga harus terdiri dari
transfer vektor dan strategi kami untuk model hewan alternatif, seperti woodchuck hepadnavirus
terinfeksi atau tikus dengan "Manusiawi" hati, yang akan memungkinkan untuk mempelajari
dampak dari kami vektor pada HBV cccDNA ketekunan dan idealnya juga pada HBVspecific
imunitas dan karsinogenesis. Akhirnya catatan, fleksibilitas tinggi dan kustomisasi mudah untuk
setiap shRNA menarik menjadikan konsep kita yang sangat menarik tidak hanya untuk perbaikan
terapi HBV. Sebaliknya, sel baru-baru ini kami Data budaya sudah menyiratkan potensi besar
untuk juga meningkatkan vectorbased strategi RNAi terhadap HCV (Mockenhaupt et al, 2015),
dan kita dapat dengan mudah membayangkan penggunaan mirip dengan memajukan pilihan
pengobatan untuk berbagai penyakit menular atau genetik lainnya dari hati dan organ lanjut.

Bahan dan metode

Plasmid

Plasmid mengekspresikan shRNAs shHBV4 ke 7 yang digunakan dalam penelitian kultur sel
diklon oleh penyisipan langsung dari masing-masing shRNA-encoding oligonukleotida (Lampiran
Tabel S5) ke selfcomplementary sebuah AAV vektor plasmid sebelumnya dilaporkan oleh kami
(Grimm et al, 2006), yang mengandung promotor H1 diikuti oleh dua situs BbsI untuk penyisipan
oligonukleotida serta promoterdriven RSV gfp reporter. Untuk studi in vivo, kami dieliminasi
reporter ini kaset untuk menghindari artefak dari gangguan promotor dan mungkin toksisitas dari
protein GFP yang dinyatakan. Oleh karena itu kami menggantikan RSV promotor di salah satu
plasmid yang ada (pengkodean 19-mer shRNA terhadap manusia alpha-1-antitrypsin, A1AT)
(Grimm et al, 2006) dengan sinyal polyadenylation SV40 yang kita PCR-diperkuat dari vektor
psiCheck2 (Promega, Mannheim, Jerman) dan kloning menggunakan situs SalI / BamHI, sehingga
plasmid PBS-H1-sha1AT. Selanjutnya, kami bertukar kaset H1-sha1AT dengan PCR-diperkuat
H1-shHBV7 fragmen menggunakan situs ASCI / XhoI, untuk mendapatkan anti-HBV vektor
shRNA kurang wartawan RSV-gfp. Vektor kontrol kosong tidak pengkodean transkrip apapun
yang dihasilkan dengan mengganti H1-sha1AT kaset dengan pertumbuhan sapi hormon
polyadenylation (BGH / poliA) sinyal, juga melalui ASCI / XhoI pencernaan. The untai tunggal
vektor AAV plasmid pSSV9-H1-shHBV7-TTRAgo2 diproduksi dalam dua langkah, oleh (i)
bertukar CMV promotor di vektor kami sebelumnya diterbitkan (Grimm et al, 2010) dengan TTR
promotor fragmen PCR-diperkuat (melalui SPEI / Saci) dan oleh (Ii) memasukkan PCR-diperkuat
H1-shHBV7 kaset (via ASCI / XhoI). The pri-miHBV7-encoding fragmen diproduksi oleh
tumpang tindih-ekstensi PCR, menggunakan primer b dan c / d / (Lampiran Tabel S5) dalam dua
PCR terpisah dan dengan melakukan PCR ketiga menggunakan primer a / d dan campuran produk
dari dua PCR pertama. Produk akhir kemudian dimasukkan di balik promotor TTR dalam untai
ganda AAV vektor plasmid menggunakan situs NheI / XhoI. Tuds diproduksi dengan menjalankan
PCR dengan masing-masing oligonukleotida (tanpa Template lanjut) dan insersi PCR produk
menjadi vektor ekspresi U6-TUD kosong (Mockenhaupt et al, 2015) menggunakan situs BsmBI
unik. H1-shRNA ekspresi kaset ditukar dengan H1-sha1AT / shHBV7 menggunakan ASCI dan
XhoI. Untuk validasi in vitro dari TuDHBV7, oligonukleotida mengandung situs mengikat
(Lampiran Tabel S5) untuk arti shHBV7 atau antisense strand dimasukkan ke dalam plasmid
psiCheck2 menggunakan situs XhoI / NotI di 30 UTR dari wartawan Renilla. plasmid
pCHHBV1.3 dan PCH-9-3091 digunakan dalam penelitian kultur sel HBV baik mengungkapkan
HBV-tipe liar genotipe D. Plasmid PCH-HBV1.3 mengandung 1,3 kali lipat lebih panjang HBV
genom, sedangkan yang di PCH-9-3091 adalah 1.1 kali lipat lebih panjang.

percobaan kultur sel

Semua percobaan kultur sel kecuali yang dilakukan untuk selanjutnya analisis blot Southern (lihat
di bawah) dilakukan dengan sel Huh7. kontaminasi Mycoplasma dikeluarkan untuk semua baris
sel. Huh7 sel ditumbuhkan dalam medium DMEM dilengkapi dengan 10% janin bovine serum, 50
U / ml penisilin / streptomisin, 2 mM L-glutamine, 1% natrium piruvat dan asam amino 1% MEM
non-esensial (semua Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) dan disimpan pada suhu 37 ° C di
dilembabkan inkubator 5% CO2. Untuk pemilihan shRNA dan perbandingan strategi ekspresi
shRNA yang berbeda, sel Huh7 ditumbuhkan dalam 24-baik piring dan co-transfected (tiga sumur
per kelompok) dengan pCHHBV1.3 dan shRNA ekspresi plasmid menggunakan Fugene HD
(Promega, Mannheim, Jerman). Alih-alih PCH-HBV1.3, plasmid PCH-9-3091 digunakan dalam
percobaan yang bertujuan untuk mengukur HBV DNA dalam supernatan kultur sel (Gambar 2B
dan 4B). Untuk Southern eksperimen blot pada Gambar 2D dan 4D, sel HepG2 tumbuh di 6-baik
piring kultur sel transfected dengan protokol yang sama. Suatu hari setelah transfeksi, sel-sel dicuci
dengan PBS, disertakan dengan Media segar mengandung 2,5% DMSO dan dipanen setelah
tambahan 72 h. Untuk layar shRNA, 183 ng dari kedua HBV dan shRNAexpressing plasmid
adalah co-transfected per sumur. Untuk perbandingan yang adil strategi ekspresi shHBV7 berbeda,
transfected Jumlah DNA disesuaikan dengan berat molekul masing-masing plasmid dalam rangka
untuk memberikan jumlah yang sama. Setelah 48 jam, supernatant dikumpulkan dan disentrifugasi
pada 5.000 g selama 5 menit, sebelum HBV kadar antigen ditentukan menggunakan uji kuantitatif
HBsAg dan tes HBeAg pada Architect (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, USA). Untuk
menganalisis HBV DNA dalam supernatan, DNA digestdilakukan untuk menghilangkan DNA
plasmid dengan menambahkan 20 U / ml DNase I (Roche Diagnostics, Mannheim, Jerman).
Setelah inkubasi pada 37 ° C selama 2 jam, reaksi dihentikan dengan menambahkan EDTA dengan
konsentrasi akhir dari 8 mM sebelum asam nukleat diekstraksi seperti yang dijelaskan di bawah.
Untuk validasi in vitro dari TuDHBV7, kegiatan shHBV7 sense dan antisense helai diukur
menggunakan dual-luciferaseb reporter psiCheck2 (Promega) direkayasa untuk mengandung situs
mengikat untuk salah satu dari dua helai shRNA. Oleh karena itu, sel-sel Huh7 tumbuh di iring
96-baik yang co-transfected dengan 10 ng psiCheck2 dan 100 ng dari plasmid mengungkapkan
shRNA dan TUD. sel yang dipanen 48 jam setelah transfeksi ke buffer lisis yang disediakan di
luciferase kit-Glo ganda sesuai dengan protokol pabrik kegiatan luciferase (Promega), dan Renilla
dan Firefly dikuantifikasi menggunakan GloMax96 microplate luminometer (Promega). Relatif
knock-down ditentukan dengan menggunakan kelompok co-transfected dengan reporter luciferase
tanpa situs mengikat dan sha1AT yang / TuDa1AT plasmid sebagai acuan.

produksi vektor AAV

AAV vektor yang diproduksi dengan menggunakan protokol standar yang melibatkan transfeksi
tiga sel 293T dengan jumlah yang sama dari AAV8 helper plasmid (encoding AAV2 rep dan gen
topi AAV8), sebuah AAV vektor plasmid (pengkodean transgen [s]) dan pembantu adenoviral
membangun (Grimm, 2002). Plasmid vektor AAV yang baik didasarkan pada diri pelengkap AAV
vektor genom optimal yang kita dilaporkan sebelumnya (Grimm et al, 2006) atau, untuk co-
ekspresi shHBV7 dan Ago-2, konstruk pSSV9 konvensional yang kemasan Hasil partikel AAV
untai tunggal DNA yang mengandung (Samulski et al, 1987). Vektor yang diproduksi seperti yang
dijelaskan sebelumnya (Borner et al, 2013) dan dimurnikan menggunakan cesium klorida
ultrasentrifugasi gradien. Secara singkat, setelah penghapusan molekul tinggi kotoran berat
(penambahan 1/39 volume 1 M CaCl2, inkubasi selama 1 jam di atas es, sentrifugasi pada 10.000
g selama 15 menit dan transfer supernatan) dan PEG pengendapan AAVs (penambahan 1/4
Volume dari 40% PEG8000 / 2,5 M NaCl, inkubasi semalam di atas es dan sentrifugasi pada 2.500
g dan 4 ° C selama 30 menit), AAV-mengandung pelet disuspensikan dalam 10 ml Na-Hepes
resuspensi penyangga (50 mM HEPES, 0,15 M NaCl, 25 mM EDTA). Setelah menambahkan 13,2
g cesium klorida dan menyesuaikan kepadatan optik (indeks bias, RI) ke 1,3710 menggunakan
refraktometer, ultrasentrifugasi adalah dilakukan selama 22 jam pada 208.000 g (Ketik Ti 70 rotor,
Optima L 90 K ultrasentrifus; kedua Beckman Coulter, Krefeld, Jerman) dan 21 ° C. Fraksi dengan
kumpul-kumpul dari 1,3711-1,3766 dikumpulkan dan didialisis terhadap fosfat-buffered saline
(semalam pada 4 ° C, empat kali pertukaran PBS) menggunakan Slide-A-Lyzer G2 dialisis kaset
dengan 20K berat molekul cut-off (Thermo Fisher Scientific Inc, Rockford, IL, USA). vektor AAV
dikuantifikasi oleh TaqMan PCR pada Rotor-Gene 6000 (Qiagen, Hilden, Jerman) menggunakan
Sensimix II Probe kit Mastermix (Bioline, London, UK). Semua reaksi yang dilakukan dalam tiga
ulangan dalam volume akhir 10 ll. Untuk memastikan sama kuantifikasi vektor AAV
menggunakan EGFP dan primer TTR (Lampiran Tabel S5), plasmid standar yang sama serta sama
AAV kontrol positif (masing-masing berisi EGFP dan TTR urutan) digunakan dalam kedua tes.

percobaan tikus

tikus HBV-transgenik yang digunakan dalam penelitian ini (HBV1.3.32) express bereplikasi -Tipe
liar HBV genotipe D (Guidotti et al, 1995). Hewan dipelihara sesuai dengan pedoman dari local
berwenang (Pemerintah Atas Bavaria, Jerman), dan semua percobaan telah disetujui oleh mereka.
AAV vektor atau 0,9% garam untuk kontrol mock disuntik secara intravena ke dalam vena ekor,
dan darah dikumpulkan melalui retroorbital atau wajah perdarahan vena. Atas penghentian
percobaan, tikus euthanised menggunakan karbon dioksida, dan darah dan organ yang dibedah
untuk analisa lebih lanjut. Darah disentrifugasi pada 5.000 g selama 10 menit, dan ALT serum
Kegiatan diukur dalam 1: 4 pengenceran di PBS menggunakan Reflotron GPT / test ALT (Roche
Diagnostics). HBsAg diukur dalam 01:30 pengenceran di PBS menggunakan uji kuantitatif
HBsAg pada Arsitek dan HBeAg dalam 1:20 pengenceran di PBS menggunakan HBe uji 2.0 pada
AxSYM (Kedua dari Abbott Laboratories). Untuk analisis pathohistological, bagian (2 lm) dari
hati (tetap dalam paraformaldehyde 4% dan paraffin-embedded) diwarnai dengan hematoksilin /
eosin. Untuk analisis, slide yang dipindai menggunakan SCN 400 geser scanner (Leica).

kriteria inklusi hewan dan tugas kelompok

Hanya tikus jantan dari 2 sampai 4 bulan usia yang digunakan dalam penelitian ini. saran statistik
diperoleh di mana penelitian ini didefinisikan sebagai studi orientasi eksplorasi, dan enam ekor
per kelompok yang dianggap cukup untuk mendapatkan perkiraan diandalkan kuantitatif efek
ukuran. Hewan berdarah 1 hari sebelum pengobatan dan dialokasikan ke dalam kelompok dengan
sama HBsAg, HBeAg, usia dan berat badan. Pengobatan kelompok tidak buta.

ekstraksi asam nukleat, PCR dan analisis Southern blot

RNA dari sel berbudaya diekstraksi dengan Spin MN Nucleo RNA kit (Macherey Nagel, Duren,
Jerman), dan cDNA disintesis dengan kit Superscript III (Thermo Fisher Scientific). HBV
transkrip diamplifikasi dengan primer spesifik untuk hanya 3,5-kbtranskrip, atau dengan primer
mengikat umum 30 akhir semua HBV transkrip (Yan et al, 2012). Beta-2-mikroglobulin (B2M)
adalah digunakan sebagai gen referensi untuk percobaan kultur sel. Untuk mengukur HBV DNA
di supernatan kultur sel, DNA diekstraksi dari 400 ll supernatan menggunakan Sistem Abbott
mSample Persiapan DNA pada mesin M24SP (keduanya Abbott). PCR adalah dilakukan dengan
primer "HBV rcDNA selektif" yang istimewa memperkuat HBV rcDNA daripada 1,1 kali lipat
lebih panjang HBV genom di PCH-9-3091 plasmid. Semua PCR dilakukan pada LightCycler 480
(Roche Diagnostics) menggunakan primer dan Kondisi PCR ditunjukkan dalam Lampiran Tabel
S5. Untuk blot Southern analisis, sel-sel segaris dan diperlakukan dengan DNase I dan RNase A
selama 3 jam pada 37 ° C. capsids sitoplasma diendapkan dengan polietilen glikol (PEG8000) dan
dicerna menggunakan natrium dodesil sulfat dan proteinase K. Setelah 3-jam inkubasi pada 37 °
C, capsidassociated DNA dimurnikan dengan ekstraksi fenol-kloroform, diikuti oleh presipitasi
etanol. DNA virus dipisahkan pada 1,3% gel agarosa, ditransfer ke membran nilon dan UV silang.
membran kemudian hibrid dengan digoxigeninlabelled HBV-spesifik penyelidikan pada 65 ° C
semalam, dan HBV DNA adalah divisualisasikan menggunakan kit DIG bercahaya Deteksi
menurut instruksi pabrik (Roche).

Analisis transcriptome

potongan hati terisolasi dilestarikan di RNAlater (Qiagen) dan kemudian segaris menggunakan
TissueLyser LT (Qiagen), sebelum seluruh RNA adalah diekstrak menggunakan kit miRNeasy
termasuk on-kolom DNA digest dengan RNase-Free DNase set (baik Qiagen). Setelah menilai
kualitas RNA menggunakan Bioanalyzer 2100 (Agilent, Santa Clara, CA, USA), cDNA dihasilkan
dari empat tikus per kelompok perlakuan menggunakan Ambion WT Expression kit (Life
Technologies, Carlsbad, CA, USA). CDNA yang terfragmentasi dan diberi label dengan
Affymetrix GeneChip WT Terminal Pelabelan Kit sebelum menjalankan mereka di GeneChip
Tikus Gene 2.0 St Array (Affymetrix, Santa Clara, CA, AMERIKA SERIKAT).

Analisis statistic

data microarray dianalisis dalam lingkungan software "R" (Http://cran.r-project.org)


menggunakan Limma (Smyth, 2005) dan Paket oligo (Carvalho & Irizarry, 2010) dari
Bioconductor (Http://bioconductor.org). pengukuran ekspresi baku memiliki telah kuantil-
normalisasi dan background-dikoreksi menggunakan RMA koreksi latar belakang. A-efek tetap
model linier yang cocok untuk masing-masing gen individu untuk memperkirakan perbedaan
ekspresi berpasangan. Menggunakan analisis komponen utama dan Pearson korelasi berpasangan
koefisien untuk pengendalian kualitas kinerja keseluruhan array, empat sampel ditemukan untuk
menunjukkan tingkat ekspresi yang berbeda dari array yang tersisa. Dengan demikian, mereka
dikeluarkan dari analisis lebih lanjut seperti diuraikan dalam tabel metadata dari Ekspresi Gen
Omnibus file database (nomor aksesi diberikan di bawah). Empiris Pendekatan Bayes digunakan
untuk memoderasi kesalahan standar yang log2 normalisasi kali lipat perubahan. Dua sisi
dimoderasi dipasangkan t-statistik dan log-odds ekspresi diferensial (statistik B) sebagai serta baku
dan disesuaikan P-nilai (tingkat penemuan palsu) yang dikendalikan oleh Benjamini-Hochberg
dihitung untuk mengidentifikasi berbeda-beda gen diekspresikan. Mutlak perubahan log2 kali
lipat> 1 dan dikoreksi P-nilai yang lebih kecil dari tingkat pengujian (alpha) dari 0,25 didefinisikan
secara signifikan diferensial dinyatakan gen. Microarray Data tersedia dalam database Gene
Expression Omnibus (GEO aksesi nomor GSE72335; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
permintaan / acc.cgi? acc = GSE72335). Data dari mouse dan kultur sel eksperimen diuji dengan
uji omnibus D'Agostino-Pearson untuk distribusi Gaussian. Jika data yang tidak terdistribusi
normal, uji Mann-Whitney digunakan untuk menguji perbedaan yang signifikan. F-test digunakan
untuk menguji apakah varians dari kelompok yang sama. Jika varians ditemukan berbeda secara
signifikan, t-test dengan Welch0 s koreksi digunakan.

Analisis pertandingan benih

3’ UTR dan seluruh transkrip urutan semua gen diwakili microarray yang merupakan Ensembl ID
yang tersedia adalah download dari www.ensembl.org/biomart dan disaring untuk 2- ke
pertandingan benih 7-nt dari shHBV7 sense dan antisense strand. Dalam kasus di mana beberapa
varian per gen ada, transkrip dengan jumlah tertinggi pertandingan benih dipilih. Gen dengan
beberapa pertandingan benih dihitung hanya sekali, dan gen yang diwakili pada array lebih dari
sekali dikeluarkan dari analisis untuk mencegah bias. Untuk membandingkan ekspresi gen relatif
gen tergantung pada 3’ pertandingan benih UTR shHBV7 (Gambar 6D), ekspresi gen itu
dinormalisasi untuk semua gen yang 30 Pertandingan benih UTR analisis yang tersedia. Analisis
statistik dilakukan dengan berpasangan t-test dengan menggunakan koreksi Welch jika berlaku.
Kami dihitung fungsi distribusi kumulatif (CDF) untuk langsung membandingkan gen ekspresi
tergantung pada kehadiran pertandingan benih shHBV7 antara shHBV7 dan shHBV / TuDHBV7
diperlakukan hewan. Untuk ini, ekspresi relatif gen dengan 3’ Pertandingan biji UTR diuji

kertas menjelaskan

Masalah

Hepatitis B virus (HBV) adalah patogen manusia terkenal yang hadir di sekitar 250 juta manusia
dan bertanggung jawab untuk 686.000 tahunan kematian. Keberhasilan virus ini adalah karena
keterbatasan standardof perawatan terapi antivirus, termasuk kebutuhan untuk sehari-hari dan
seumur hidup aplikasi, biaya tinggi, kegagalan untuk menghilangkan virus atau untuk menghambat
ekspresi antigen HBV, serta risiko efek samping dan Munculnya mutan HBV tahan. Sebuah solusi
yang mungkin adalah interferensi RNA (RNAi), alat yang ampuh untuk ditargetkan mRNA
membungkam yang dapat diarahkan terhadap urutan seluler atau asing yang terlibat dalam
manusia penyakit termasuk transkrip virus. Untuk tujuan ini, bagaimanapun, klinis terjemahan dari
teknologi RNAi sangat memerlukan perbaikan lebih lanjut di in vivo efisiensi, spesifisitas dan
keselamatan.

hasil

Dalam tulisan ini, kita secara sistematis mengevaluasi tiga strategi yang berbeda untuk ekspresi
anti-HBV RNA jepit rambut pendek (shRNA, pemicu RNAi), menggunakan rekombinan virus
adeno-associated 8 (AAV8) vektor untuk pengiriman untuk hati tikus HBV-transgenik
imunokompeten dewasa. Secara singkat, kita (I) tertanam shRNA di perancah microRNA bawah
hati-spesifik promotor; (Ii) co-diungkapkan Argonaute-2, tingkat-faktor pembatas RNAi; atau (Iii)
co-menyampaikan umpan ( "TUD") terhadap shRNA akal strand, untuk meringankan regulasi gen
dari target. Khususnya, sementara konvensional shRNA vektor disebabkan toksisitas vivo
termasuk penurunan berat badan, hati kerusakan dan disregulasi> 100 gen dalam hati, tiga lainnya
strategi diminimalkan semua efek ini samping yang merugikan. Hasil terbaik diperoleh dengan
baru vektor AAV8 co-mengekspresikan anti-HBV shRNA dan TUD yang memberikan
knockdown HBV paling kuat dan paling gigih (> 98% HBsAg penekanan selama minimal 12
minggu).

Dampak

Kami telah mengidentifikasi strategi ekspresi RNAi berbasis AAV baru yang memberikan yang
lebih baik dalam potensi vivo, spesifisitas dan keamanan HBV penghambatan dari vektor shRNA
tradisional atau dari dua pendekatan alternatif. Yang penting, karena konsep kami sangat fleksibel
dan mudah untuk menyesuaikan, tidak terbatas pada HBV tetapi juga menjanjikan dan menarik
untuk berbagai macam penyakit manusia lain yang rentan terhadap RNAi. Sebagai contoh, kita
baru-baru ini menunjukkan nya potensi untuk juga meningkatkan strategi RNAi berbasis vektor
terhadap virus hepatitis C, dan kita dapat dengan mudah membayangkan pembangunan masa
depan terhadap banyak aplikasi klinis lain untuk infeksi atau genetic penyakit hati dan jaringan
manusia lanjut.

untuk perbedaan yang signifikan terhadap ekspresi relatif gen tanpa pertandingan benih. Sebuah
dua sampel, dua-sisi Welch t-test adalah digunakan dan tingkat alpha 0,05.

Analisis Jalur
Pengayaan Pathway gen yang diidentifikasi menjadi signifikan adalah diperoleh dengan query
database DAVID (Jiao et al, 2012) untuk GO BP / 5, GO BP / FAT dan kegg, Reactome, BBID,
BioCarta dan Panther jalur anotasi menggunakan R-paket RDAVIDWebService (Fresno &
Fernandez, 2013). Jika hal penjelasan identic kembali untuk GO BP / 5 dan GO BP / FAT, hanya
satu dengan yang terendah EASE P-nilai dipertahankan (Lampiran Tabel S4).

konservasi Target

Untuk menganalisis konservasi daerah HBV yang ditargetkan, reverse pelengkap dari shRNA
helai antisense yang selaras dengan perwakilan rutan semua genotipe HBV berasal dari peraturan
HBV Urutan Database HBV RegDB (http://lancelot.otago.ac.nz/HBV RegDB) (Panjaworayan et
al, 2007) menggunakan mega versi 6.06 untuk Mac (Tamura et al, 2013). The filogenetik pohon
urutan HBV di Lampiran Gambar S1C dihasilkan dengan menggunakan metode tetangga-
bergabung di Mega.