Bagian Nesya

Mekanisme siRNA (small interfering RNA)

Beberapa tahun ini, ahli biologi telah lebih mendalami RNA secara molekuler (1-3). Pada tahun
1998 Fire dan Mello menemukan sebuah pemahaman baru tentang RNA interference dalam regulasi gen
yaitu silencing gen. RNAi yang ditemukan ini berbentuk sebagai dsRNA atau RNA rantai ganda dimana
RNAi ini dapat menargetkan mRNA dan mendegradasikannya (8-9, 49). Pada tahun 1999, siRNA atau
short interfering RNA dapat diterapkan pada tumbuhan yang didemonstrasikan dengan sekuens yang
berisi kode gen target sebagai guide dan proses pemotongan mRNA secara endonukleosis yang dapat
diregulasikan pada sel mamalia (50). siRNA sendiri merupakan jenis RNAi yang biasa digunakan oleh sel
untuk mempertahankan integritas genom sebagai respon dari invasi gen asing seperti transposon,
transgen, dan virus. Sedangkan jenis RNAi lain seperti miRNA atau microRNA berfungsi sebagai
regulator dari gen endogen milik sel (52). Tahun 2001, peneliti telah sukses membuat siRNA secara
sintentik untuk melakukan silencing pada gen dalam rangka mengembangkan RNAi lebih lanjut (53).
siRNA telah menjadi terapi inovatif yang menggunakan asam nukleat untuk mengobati berbagai
penyakit genetik (10-14). siRNA sendiri telah menjalani uji klinis untuk penerapannya sebagai terapi pada
manusia (15-17).
siRNA merupakan RNA dengan 20-30 basa nukleotida (jurnal di atas). Ketika dsRNA yang
memiliki rantai lebih panjang dihantarkan oleh nanoliposom sebagai vektor dan ditransfeksikan ke dalam
sitoplasma sel target, intron dari dsRNA tersebut akan dipotong oleh dicer atau RNase III-like enzyme
yang mengandung domain helikase (75). Proses pemotongan ini menghasilkan siRNAds dengan rantai
yang lebih pendek. Hasil proses pemotongan tersebut menghasilkan siRNA dupleks dengan panjang 21-
25 basa nukelotida dengan dua nukelotida yang terikat pada ujung 3' dan fosfat pad aujung 5' pada setiap
rantai gandanya. Ketika terbentuk, siRNA akan berikatan dengan kompleks protein yang bernama RISC
atau RNA induced silencing complex (73). Kompleks tersebut lalu akan bergabung dengan protein
Argonaute (56). Ketika dsRNA berikatan dengan Argonaute, dua rantai dsRNA akan terpisah menjadi
passanger RNA yang akan didegradasi dan guide RNA yang akan terus berikatan dengan protein
Argonaute untuk melakukan pemotongan pada mRNA target. Basa nukleotida yang dibawa oleh rantai
guide milik siRNA merupakan komplemen atau pasangan dari mRNA target. Dengan proses pemotongan
mRNA atau silencing melalui aktivitas katalitik, protein yang dikodekan oleh mRNA tersebut akan
mengalami down regulation. Kompleks RISC juga dapat menginduksi represi translasi sebelum terjadi
inisiasi yang diikuti oleh deadenilasi dan degradasi mRNA (19).

Daftar Pustaka
1. Carthew RW, Sontheimer EJ. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 2009; 136:
642–655.
2. Wilson RC, Doudna JA. Molecular Mechanisms of RNA Interference. Annu. Rev. Biophys. 2013;
42: 217-239.
3. Carthew RW, Sontheimer EJ. Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 2009; 136
(4): 55–642.
8. Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, et al. Potent and specific genetic interference by
double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998; 391: 806–811.
9. Endoh T, Ohtsuki T. Cellular siRNA delivery using cell-penetrating peptides modified for
endosomal escape. Advanced Drug Delivery Reviews. 2009; 61: 704–709.
49. Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, et al. Potent and specific genetic interference By
double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998; 391 (6669): 806-811.
50. Tomari Y, Zamore PD. Perspective: machines for RNAi. Genes Dev. 2005; 19: 517–529.
52. Meister G, Tuschl T. Mechanisms of gene silencing by doublestranded RNA. Nature. 2004; 431:
343–349.
53. Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs
mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 2001; 411: 494–498.
10. Oh YK, Park TG. siRNA delivery systems for cancer treatment. Advanced Drug Delivery
Reviews. 2009; 61: 850–862.
11. Pal A, Ahmad A, Khan S, Sakabe I, et al. Systemic delivery of Raf siRNA using cationic
cardiolipin liposomes silences Raf-1 expression and inhibits tumor growth in xenograft model of
human prostate cancer. Int. J. Oncol. 2005; 26: 1087–1091.
12. Landen CN Jr., Chavez-Reyes A, Bucana CR, Schmandt MT, et al. Sood, Therapeutic EphA2
gene targeting in vivo using neutral liposomal small interfering RNA delivery. Cancer Res. 2005;
65: 6910–6918.
13. Rubin MA. Targeted therapy of cancer:
new roles for pathologists prostate cancer. Mod. Pathol. 2008; 21 (2): 44–55.
14. Soutschek J, Akinc A, Bramlage BK, Charisse R, et al. Vornlocher, Therapeutic silencing of an
endogenous gene by systemic administration
of modified siRNAs. Nature. 2004; 432: 173–178.
15. Aigner A, Nonviral in vivo delivery of therapeutic small interfering RNAs. Curr. Opin. Mol.
Ther. 2007; 9: 345–352.
16. Santel A, Aleku M, Keil O, Endruschat J, et al. RNA interference in the mouse vascular
endothelium by systemic administration of siRNA– lipoplexes for cancer therapy. Gene Ther. 2006;
13: 1360–1370.
17. Juliano R, Alam MR, Dixit V, Kang H. Mechanisms and strategies for effective delivery of
antisense and siRNA oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 2008; 36: 4158–4171.
75. Lungwitz U, Breunig M, Blunk T, Gopferich A. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2005; 60: 247.
73. . Jere D, Jiang HL, Arote R, Kim YK, et al. expert Opin. Drug Delivery. 2009; 6: 827.
56. Zhang S, Zhao B, Jiang H, Wang B, et al. Cationic lipids and polymers mediated vectors for
delivery of siRNA. J. Control Release. 2007; 123: 1–10.

19. Jeong JH, Kim SW, Park TG. Molecular design of functional polymers for gene therapy. Prog.
Polym. Sc. 2007; 32: 1239–1274.

Nanoliposom sebagai pembawa siRNA (small interfering RNA)

siRNA telah menjadi salah satu metode terapi gen yang efektif dan spesifik untuk menyembuhkan
berbagai penyakit seperti infeksi virus, keganasan, dan kelainan genetik melalui intervensi RNA dari genom
target. Namun, efesiensi tranfeksi yang rendah menjadi masalah utama yang menghambat penerapan
siRNA secara in vivo. Beberapa studi menyatakan bahwa penghantaran gen dengan vektor virus maupun
non virus terbukti dapat meningkatkan efisiensi tranfeksi siRNA ke sel target secara in vivo[56]. Meskipun
vektor virus menunjukkan efisiensi tranfeksi yang sangat baik, namun penggunaan vektor tersebut dapat
menimbulkan mutagenesis, karsinogenesis, dan dapat meginduksi respon kekebalan berlebihan apabila
diberikan secara berulang[56]. Oleh karena itu, pengiriman siRNA dengan menggunakan vektor nonvirus
atau nanopartikel menjadi pilihan terbaik sebagai pembawa siRNA dalam terapi traumatic brain
injury ini.
Nanoliposom merupakan sistem pembawa berbasis nanopartikel yang terbuat dari senyawa lipid
dan sering diterapkan dalam pengembangan sistem pengiriman gen atau obat[58]. Nanoliposom sering
digunakan sebagai sistem pembawa karena memiliki beberapa kelebihan,antara lain; sifatnya yang mudah
terurai (biodegradable), biocompatible, non toxic, non immunogenic, dan dapat dikonjugasikan dengan
molekul tambahan sehingga menghasilkan sistem pembawa yang spesifik[58]. Sistem pembawa yang
ideal untuk CRISPR/Cas9 harus memenuhi beberapa kriteria yang mencakup ;(1) tidak menimbulkan
respon kekebalan, (2) molekul pembawa dapat mengangkut siRNA yang memiliki kapasitas besar, (3)
spesifik sehingga tidak memerlukan dosis berulang, (4) tidak menimbulkan integrasi dengan genom sel
inang[58]. Dari beberapa jenis vektor, nanoliposom telah memenuhi semua kriteria tersebut. Hal tersebut
terbukti dari berbagai hasil penelitian yang menyatakan bahwa sistem pembawa berbasis nanoliposom
untuk pengeditan secara in vivo dengan siRNA menghasilkan knockdown yang spesifik dan on target
dalam jangka waktu tertentu tanpa disertai efek toksik dan reaksi imunitas [58,59].
Ukuran nanoliposom yang sangat kecil memungkinkan partikel ini menembus bagian interstisial
sawar darah otak dengan waktu retensi lebih tinggi dibandingkan dengan sel sehat[60]. Keuntungan tersebut
membuat nanoliposom lebih banyak terdistribusi pada vaskuler di otak. Beberapa penelitian menyebutkan
bahwa terdapat sekitar 70% nanoliposom yang membawa siRNA terdistribusi pada darah otak dalam 24
jam pertama setelah diinjeksi secara intravena[59,60]. Hasil tersebut membuktikan bahwa nanoliposom
efektif untuk dijadikan delivery system untuk mengobati traumatic brain injury [61].
Dalam sirkulasi tubuh, berbagai reaksi seperti respon imun dan penghapusan nanopartikel melalui
reticuloendothelial system (RES) dapat menurunkan efektivitas penghantaran siRNA sehingga proses
administrasi perlu dilakukan berulang[64].Penambahan polyethilene glycol (PEG) pada permukaan
nanolipososom berbasis siRNA (PEGylation) mampu meningkatkan stabilitas nanopartikel tersebut
dalam darah dan menghindari penyerapan nanopartikel oleh sistem fagosit mononuklear (MPC) dalam hati
dan limpa [65]. PEG adalah polieter diol linear atau bercabang yang bersifat hidrofilik, biokompatibel, dan
non-antigenik. Karena sifatnya yang biokompobalitas, PEG menjadi polymer yang telah disetujui oleh Food
and Drug Administration (FDA) dan berbagai formulasi farmasi[64].
Salah satu jalur administrasi nanoliposom yang terbukti mampu menghantarkan siRNA adalah
melalui jalur intravena. Atas dasar pertimbangan efektivitas, administrasi siRNA dilakukan melalui
intravena dengan dosis sesuai kondisi tubuh pasien.
Daftar Pustaka
56. Lindsay N, Mosher, Su Chaty. Cancer gene therapy: innovations in therapeutic delivery of
CRISPR-Cas9.Elsevier.2016,21,17-21.
58. Wu S Y,Shinghania A, Putral L N, Systemic delivery of E6/7 siRNA using novel lipidic particles
and its application with cisplatin in cervical cancer mouse models. Gene Therapy.2011,14-22.
60. Ming Wang, John A. Zuris, Fantao Meng, Holly Rees, Shuo Sun, Pu Deng, Yong Han, Xue
Gao, Dimitra Pouli, Qi Wu, Irene Georgakoudi, David R. Liu and Qiaobing Xu. Efficient delivery of
genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles. PNAS. 2016, 113 (11) 2868-2873.
61. Finn J D, Smith A R, Patel M C, Shaw L. A Single Administration of CRISPR/Cas9 Lipid
Nanoparticles Achieves Robust and Persistent In Vivo Genome Editing.Cell Reports,2018,22(9),
2227-2235.
64. Beatriz Pelaz , Pablo del Pino , Pauline Maffre, Raimo Hartmann. Surface
Functionalization of Nanoparticles with Polyethylene Glycol: Effects on Protein Adsorption and
Cellular Uptake. ACS Nano.2015,9(7),6996-7008.
65. Kabadi Ami M, Ousterout David G, Hilton Isaac B, Gersbach Charles A. Multiplex CRISPR/Cas9-
based Genome Engineering from a Singe Lentiviral Vector. Nucleic Acids Research. 2014.
42:19,e147.

Konstruksi (litrev usu 2019)

FasL-NL-siRNA adalah sistem pembawa siRNA dengan menggunakan nanoliposom yang telah
termodifikasi ligan Fas. Modifikasi dengan ligan Fas bertujuan agar partikel ini terkosentrasi di
daerah sel neuron yang mengalami inflamasi setelah diinjeksi secara intravena. Hal ini terjadi karena reseptor
Fas banyak terekspresikan pada sel neuron yang mengalami inflamasi. Reseptor Fas merupakan protein
permukaan membran tipe I yang akan berikatan dengan ligan Fas. Apoptosis akan terjadi jika ligan Fas dan
reseptor Fas berikatan dan terjadi interaksi molekular intraseluler yang mengkoordinasikan aktivasi
caspase, tetapi dalam terapi ini, ligan Fas yang digunakan merupakan ligan Fas sintetik sehingga jalur
apoptosis intraseluler tidak akan teraktivasi. Hal ini terjadi karena nanoliposom yang telah didesain
membawa plasmid siRNA (Jurnla 1396.full 17,18,19,20).
Penambahan PEG pada permukaan Fas-NL-siRNA telah terbukti dapat meningkatkan
keefektivannya, yaitu meningkatkan waktu paruh, menghindari renal clearance, menghindari
reticuloendothelial system (RES) clearance, dan menurunkan toksisitas[67]. Adanya penghambatan proses
eliminasi Fas-NL-siRNA, memungkinkan proses administrasi dilakukan dengan dosis yang rendah.
Hal ini akan meningkatkan cost effective sekaligus membuat pasien lebih nyaman.
Langkah awal dalam proses konstruksi Fas-NL-siRNA adalah mempersiapkan primer caspase-
3 5’-TATGGAATTGATGGATAGT-3’ dan 5’-CTGAAGAAACTAGTTAGTT-3’. Sintesis primer
siRNA yang mengandung 20 bp yang diligasikan ke plasmid vektor bisa dimulai dengan
mencampurkan 8µl sense oligo + 8µl antisense oligo + 2µl 10x ligase buffer (NEB). Campuran tersebut
diinkubasi dalam suhu 96oC selama 300 s, diikuti dengan 85oC selama 20 s, 75oC selama 20 s, 65oC
selama 20 s, 55oC selama 20 s, 45oC selama 20 s, 35oC dan 25oC yang masing-masing 20 s.
Promoter tambahan seperti mU6 dan chicken ß- actin promoter with cytomegalovirus enhancer
(pCAG) disintesis menggunakan GeneBlocks (IDT) dan dikloning bersama dengan promoter hU6.
Promoter-promoter tersebut dan enhanced green fluorescent protein (eGFP) yang digunakan sebagai
monitoring diinsersikan ke ujung 3' dari primer siRNA dan difusikan dengan promoter T7. T7
dapat menginduksi trankripsi primer siRNA dengan RNA polimerase.
Promoter dan primer siRNA yang telah siap diligasikan ke dalam lipid menggunakan T4 DNA
ligase yang diinkubasi selama 15 menit dengan suhu ruangan menggunakan 50ng nanoliposom dan 1µl
[67,70]
oligonukleotida serta ligan FAS dan PEG dalam 10µl reaksi sesuai dengan instruksi pabrik .

Plasmid siRNA ini memiliki kapasitas yang cukup besar dibandingkan dengan volume inti
nanoliposom, sehingga perlu adanya pengurangan volume plasmid dengan menggunakan kondrotin dan
[59,60]
protamine .
Nanoliposom dibuat dengan menggunakan teknik hydration of lipid film. Kolestrol, CHEMS,
PEG 2000-C16 Ceramide, ligan Fas , dan plasmid dilarutkan dalam pelarut yang mengandung
[60,61]
kloroform . Selanjutnya, campuran dikeringkan dengan evaporator rotary dan kemudian dilakukan
proses freeze drying selama 3 jam. Hasilnya kemudian dihidrasi dengan phosphate-buffered saline dan di
vortex selama 10 menit. Setelah itu, produk berupa Fas-NL-siRNA yang termodifikasi PEG siap untuk
[61]
diaministrasikan

Daftar Pustaka
[17] T. Shiraishi, K. Suzuyama, H. Okamoto, et all. Increased cytotoxicity of soluble Fas ligand by
fus- ing isoleucine zipper motif, Biochem. Biophys. Res. Commun. 322 (2004) 197–202.
[18] J.L. Cereghino, J.M. Cregg, Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast
Pichia pastoris, FEMS Microbiol. Rev. 24 (2000) 45–66.
[19] R. Daly, M.T.W. Hearn, Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful
experimental tool in protein engineering and production, J. Mol. Recognit. 18 (2005) 119–138.
[20] S. Macauley-Patrick, M.L. Fazenda, B. McNeil, L.M. Harvey, Heterologous protein production
using the Pichia pastoris expression system, Yeast 22 (2005) 249–270.
Injury Model
Mencit C57BL/6 berumur enam minggu ditempatkan pada alat stereotoksik. Selanjutnya, digunakan
jarum berukuran 19 gauge untuk melukai tengkorak tikus sedalam 3mm dan sepanjang 1mm. Trauma
buatan ini hanya dilakukan pada salah satu hemisfer korteks otak tikus sedangkan hemisfer kontralateral
akan diamati sebagai kontrol. 2 nmol siRNA dicampur ke dalam 5% dextrosa dan disuntikan melalui vena
ekor tikus setelah 5 menit setelah dilakukan perlukaan. Tikus dianastesi menggunakan isofluran.
Setelahnya, tikus diterminasi melalui jalan asfiksia karena CO2 setelah 72 jam administrasi dari siRNA.
Selanjutnya, korteks otak tikus yang mengalami trauma tadi diseksi untuk dites menggunakan western
blotting dengan tujuan untuk mengetahui aktivitas caspase 3.

Dafpus
Ester J. Kwon, Matther Skalak, Riana Lo Bu, et all. Neuron-Targeted Nanoparticle for siRNA
DElivery to Traumatic Brain Injuries. ACS nano. 10:7926-7933. 2016.

Potensi
Potensi
Nanoliposom yang digunakan telah terbukti mempunyai potensi dalam membawa siRNA dalam
proses terapi gen. Pada traumatic brain injury atau TBI, trauma sekunder bisa memicu respon dari
disregulasi dari sawar darah otak, munculnya edema, disekresikannya neurotransmiter eksitatori secara
berlebihan, dan inflamasi. Efek tidak langsung ini bisa terjadi secara kronis dan bisa menyebabkan kematian
sel neuron secara meluas pada otak mulai dari jam hingga bertahun-tahun sejak trauma pertama.
Untuk mencegah apoptosis neuron yang disebabkan oleh trauma sekunder, peneliti mengirimkan
siRNA yang menargetkan caspase 3. Caspase 3 dikenal sebagai komponen utama dalam proses apoptosis
setelah terjadi TBI (28). Pengiriman sekuens siRNA yang menargetkan caspase 3 menunjukan hasil yang
signifikan yaitu level mRNA caspase 3 berkurang hingga 50% setelah 48 jam terapi (gambar 4A dan 6B).
Selain itu, kadar zimogen dan caspase 3 bentuk aktif berkurang juga secara signifikan.
Vaskuler pada otak mengalami perubahan permeabilitas yang bersifat temporer setelah terjadinya
trauma sehingga pemberian terapi ini sebaiknya dilakukan dalam 24 jam setelah trauma. Perubahan
permeablitas ini terjadi karena efek tidak langsung dari jalur persinyalan dari respon trauma (12,23).
Ketika nanoliposom berbasis siRNA ini diadministrasikan, pengamatan menunjukan bahwa tidak
ada akumulasi dari peptida ini pada jaringan otak tikus yang lebih dalam. Selain itu, nanoliposom berbasis
siRNA ini juga banyak terakumulasi pada jaringan yang mengalami trauma saja dan tidak terakumulasi
pada jaringan yang sehat. Peneliti menggunakan antibodi antifluoresen untuk memonitoring aktivitas
siRNA. Hal ini membuktikan bahwa siRNA merupakan terapi gen yang aman dan bisa meminimalisir efek
off target pada jaringan non-target (gambar 5b).
Nanoliposom berbasis siRNA ini hanya terakumulasi maksimal enam jam setelah administrasi dan
mengalami penurunan yang signifikan dalam 24 jam. Administrasi terapi ini juga menunjukan efek lain
seperti berkurangnya edema pada otak sehingga bisa mengurangi tekanan intrakranial lokal. Hal ini
membuktikan bahwa siRNA merupakan terapi gen yang aman karena waktu kerjanya yang tidak terlalu
lama. Sebab, jika waktu kerja suatu terapi gen lama, hal yang ditakutkan adalah efek off target dan
mempengaruhi ekspresi protein lain.
Administrasi siRNA yang dilakukan setelah lima menit terjadinya trauma, menunjukan hasil yang
signifikan dalam menurunkan level protein CASP3 dibandingkan dengan kontrol. (gambar 6a). Jika
dipersentasikan, maka kurang lebih 80% protein CASP3 berhasil diknockdown pada hemisfer yang
mengalami trauma.

(Gambar 4a dan 6b)

Tingkat ekspresi caspase pada tikus kontrol dibandingkan tikus perlakuan

Gambar 5b

Akumulasi dari nanoliposom siRNA yang telah diberi label fluoresens pada hemisfer yang mengalami
trauma pada waktu tertentu setelah injeksi

Gambar 6a

analisis western blot yang dilakukan pada tingkat ekspresi caspase 3 pada model tikus traumatic brain
injury
 Daftar pustaka
(28) Clark, R. S.; Kochanek, P. M.; Watkins, S. C.; Chen, M.; Dixon, C. E.; Seidberg, N. A.; Melick, J.; Loeffert,
J. E.; Nathaniel, P. D.; Jin, K. L.; Graham, S. H. Caspase-3 Mediated Neuronal Death after Traumatic
Brain Injury in Rats. J. Neurochem. 2000, 74 (2), 740−53.
(12) Smith, N. M.; Gachulincova, I.; Ho, D.; et all. An Unexpected Transient Breakdown of the Blood
Brain Barrier Triggers Passage of Large Intravenously Administered Nanoparticles. Sci. Rep. 2016, 6,
22595.
(23) Price, L.; Wilson, C.; Grant, G. Blood-Brain Barrier Pathophysiology Following Traumatic
Brain Injury. In Translational Research in Traumatic Brain Injury; Laskowitz, D., Grant, G., Eds.; CRC
Press: Boca Raton, FL, 2016.

Ester J. Kwon, Matther Skalak, Riana Lo Bu, et all. Neuron-Targeted Nanoparticle for siRNA
DElivery to Traumatic Brain Injuries. ACS nano. 10:7926-7933. 2016.