Ejercicio 1- Optimización de compuestos

Objetivo: Optimizar los diferentes parámetros para generar la mejor sensibilidad para cada
analito.

Harvard Syringe Pump-Flow rate 7.0 µl/min

1,0 ml Jeringa de 4,61 mm de diámetro.

Ajuste de Probe
Ajuste 4500 TQ/4500 Qtrap 3200 TQ/3200Qtrap
5500TQ/5500Qtrap 4000 TQ/4000Qtrap
Vertical( mm) 7 10
Horizontal(mm) 5 5

1. Configuración física del instrumento.

a) Prepare el sistema para realizar infusión: conecte el Tubing PEEK de dimensiones

1/16 OD; 0,01”(0.25mm) Natural.( Cod CH1531) Que conecta la jeringa a la fuente de
ionización mediante conexiones FITTING, 1-PIECE FINGERTIGHT, Rheodyne® 1/16
(CH6000-282), en el otro extremo debe haber una conexión Luer Adapter Female Luer x 10-
32 Female PEEK(CHP-659) la cual será unida a la Jeringa Hamilton Serie 1000 Gastight
Modelo 1001 de 1 ml (CH81320).

b) Llene la jeringa con la solución del compuesto a optimizar (recuerde que la solución debe
contener agua e idealmente el modificador de la fase móvil), cuidando de no generar
burbujas.
c) Coloque la jeringa en la Harvard Pump con delicadeza, esta debe quedar asegurada y en
correcta posición. El instructor le señalará como debe realizar esta operación.

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d) Luego manteniendo presionado el botón(dorado) que se encuentra al costado de la plataforma
móvil, debe desplazar esta, hasta topar el embolo de la jeringa.

e) Fije la cañería PEEK a la Jeringa por la unión Luer Lock.

f) Conecte el otro extremo de la jeringa a la fuente de Ionizacion

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2- Configuración Analyst Sofware:

a. Hacer un doble Clic en el icono de Analyst software.

b. Seleccione en la barra de herramientas lateral izquierda la sección Configure.

c. Con un doble clic en Harware Configuration se desplegara la ventana harware editor

d. Seleccione el perfil mass spec only .

g) Presione una vez la opción Active Profile

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a) Observe que el perfil seleccionado este de color verde.

e. Cierre la ventana.
f. seleccione en la barra de herramientas lateral izquierda la sección Tune and calibrate → abrir
pantalla manual tuning. Si no abre inténtelo nuevamente puede que el detector no esté
operativo aún. si observa un mensaje léalo, interprételo, e inténtelo nuevamente

g. si aparece el siguiente mensaje, presione el icono ubicado en la barra de herramientas

superior.

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h. Pantalla Manual Tunning

a) Seleccione en la barra de herramientas de la pantalla manual Tuning la opción MS Method,

se desplegara una lista escoja Syringe Pump Method,

b) Se desplegará la ventana Harvard Syringe Pump Method Properties

c) Digite un Flow rate 7 a 10 ul/min,

d) vuelva a la opción MS Method.

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 e) Aparecerá la pantalla normal de Manual Tuning

f) Presione start Syringe Pump

3- Q1 Scan: Confirmar presencia de Iones relevantes

a. Seleccione Scan Type → Q1MS (Q1)

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b. Seleccione polaridad de trabajo: Polarity →Positive o Negative

c. Seleccione el recuadro Parameter Range y elimine la marca en el recuadro Center/ Width.

d. Indique un Rango de masas: depende del Ion que se busque Ej: si su analito a fragmentar es
de 350Da, seleccione un rango de 300Da a 400Da.

e. En la columna Time, colocar un valor de 1 sec. Si se coloca en gris (inactivo) esta columna
significa que el modelo de su detector calcula automáticamente este valor.
f. Indique la duración de su análisis en minutos (5 minutos), en la casilla Duration.

g. Clic en el botón Acquire

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h. Se desplegara la ventana Acquire to Disk

i. Ingrese un nombre de data filename tal como Diciembre 2013 (carpeta donde se guardaran
las inyecciones pertenecientes a esa secuencia de trabajo). Si ya ha efectuado este paso para
otro analito puede usted buscar por ejemplo la carpeta Diciembre 2013 en Browse, para que
todas sus optimizaciones queden ubicadas en la misma carpeta.

j. Ingrese un nombre de muestra Sulfonamida 1.

k. Agregue alguna observación en el recuadro Comment.

l. Presione Ok.

m. Se desplegará una ventana del análisis en tiempo real.

n. Verifique que Total Ion Cromatogram es estable

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o. Verifique presencia de los iones esperados.

p. Repita Q1 MS sacan con la opción Center/ Width seleccionada,

q. Ingrese la masa del ion precursor Center(Da) ej: 350 Da y un Width de 4 Da. Observe que la
configuración de la pantalla a cambiado.

g) Verifique que la intensidad del Total Ion sea alrededor de 1x10E6 cuentas, si esto no es así
diluya o concentre la solución. Recuerde que sobre este valor el detector podría saturarse.

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4- Optimizando Declustering Potential. (Intensidad max. 1xE6)

a. Seleccione Scan Type: Q1 MS (Q1)

b. Ingrese la Carga /Masa (m/z) del Ion de Interés.

c. Clic en el botón Edit Ramp

d. Seleccione Declustering Potencial (DP), Parameter

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e. Ingrese los parámetros: Start = 0
Stop = 200,
Step= 5 ,Clic

f. Presione OK.
g. Se seleccionara automáticamente el recuadro Ramp parameter, presione el Boton Start

h. Presione Acquire
i. Se desplegara la ventana de análisis en línea de DP.

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j. Realizar un doble clic sobre la ventana TIC.
k. Se desplegara una nueva ventana

l. Clic y mantener presionado el botón izquierdo del mouse, desplazar la barra a través del
cromatograma hasta encontrar la máxima intensidad del ion precursor en la ventana
desplegada anteriormente.

m. Llene un registro con los DP seleccionado para cada m/z optimizada.

n. Ingrese el valor de DP óptimo para cada masa ingresada.

o. El Valor Entrance Potencial (EP) se sugiere siempre en 10, sin embargo puede ser
optimizado.

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5- Product Ion Scan : Se utiliza para encontrar los fragmentos de los Iones precursores.
a. Seleccione Scan Type → Product Ion (MS2)

b. Seleccione Modo de escaneo: Polarity →Positive o Negative

c. Asegúrese que Parameter Range esté seleccionado

d.

e. Ingrese la m/z del Ion Precursor en el recuadro Product Of, solo se puede fragmentar un
precursor a la vez.

f. Ingrese un rango de masas adecuado para su compuesto en particular. Ej: si su analito tiene
m/z de 350 Da, escogerá un rango de 50 a 360, lo cual le permitirá ver todos los fragmentos y
el ion precursor.

g. Time Sec utilizar 1 sec. Si su sistema es un modelo 4500 o superior, esta columna es
controlada por el software.
h. Ingrese en la tabla los valores DP, EP previamente seleccionados y CE un de 5 volt y un
CXP de 5 Volt.

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i. Presione Acquire, rellene los datos solicitados y presione start.

j. Usted deberá observar que prácticamente no hay fragmentación del Ion Precursor, se observa
a la derecha del gráfico.

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 k. Aumente el CE de 5 en 5 hasta obtener la fragmentación Ideal

l. Verifique que los fragmentos buscados estén presentes en la fragmentación, si no los conoce
escoja los más abundantes y estables.

m. Guarde el espectro en la librería del Sofware. (si lo requiere), si usted tiene un detector
hibrido Qtrap, utilice Enhance Product Ion con un CES de 15.

6- Optimizando Collision Energy para cada ion producto. Este valor es individual para cada
Precursor/ Ion Producto.

a) Verifique que la m/z del Ion Precursor este en el recuadro Product Of

b) Ingrese el fragmento a optimizar en la columna Center(Da)

c) Clic en el botón Edit Ramp

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d) Seleccione Collision Energy (CE) Parameter

e) Ingrese los parámetros: Start = 5 , Stop = 80, Step= 3 ,

f) Presione OK.
g) Verifique que MCA no este seleccionado.

h) Clic en el botón Acquire.

i) Se desplegara el grafico del análisis en tiempo real del CE para el fragmento seleccionado.

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 j) Realizar un doble clic sobre la ventana TIC.
k) Se desplegara una nueva ventana
l) Clic y mantener presionado el botón izquierdo del mouse, desplazar la barra a través del
cromatograma hasta encontrar la máxima intensidad del ion precursor en la ventana desplegada
anteriormente. Observe que en la nueva ventana desplegada (abajo) se ven dos señales usted
debe considerar en la evaluación para escoger CE la que tenga la m/z de su Ion producto no
confundirse con los isotopos.

m) Llene un registro con los CE seleccionados para cada m/z optimizada.

n) Ingrese el valor de CE óptimo para cada masa ingresada.

o) Repita el ejercicio para las otras transiciones.

7- Optimizando Collision Cell exit Potential(CXP) para cada ion producto. Este valor es
individual para cada Precursor/ Ion Producto.

a. Scan Type = Product Ion MS2

b. Verifique que la m/z del Ion Precursor este en el recuadro Product Of

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c. Ingrese el fragmento a optimizar en la columna Center(Da)

d. Clic en el botón Edit Ramp

e. Seleccione Collision Cell Energy (CXP) Parameter

f. Ingrese los parámetros: Start = 0 y Stop = 55 Step= 1,

g. Presione OK.
h. Clic en el botón Acquire.

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 i. Seleccione el valor mas adecuado para CXP, siguiendo el procedimiento antes descrito para
evaluar CE.

p) Llene un registro con los valores de CXP seleccionados para cada m/z optimizada.

q) Ingrese el valor de CXP óptimo para cada masa ingresada.

j. Repita el ejercicio para las otras transiciones

8- Construya un Método MRM.

a) Seleccione desde la barra de herramientas lateral con un doble Clic la opción Build
Acquisition Method.

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b) En la ventana desplegada seleccione el scan type MRM

c) Seleccione la polaridad de su experimento,

d) ingrese el valor de su Ion Precursor en la casilla indicada como Q1 Mass (Da), y al fragmento
de cuantificación en la casilla Q3 Mass (Da), en la columna Dwell Time (Time Sec),
coloque un valor inicial de 200msec (este valor cambiará dependiendo del número de
transiciones ingresadas), en la columna ID ingrese el nombre del Analito con un espacio y un
1, indicando al software que esta es la primera transición. y un 2 si es la transición de
calificación.

e) Seleccione haciendo un clic con el botón derecho del ratón, sobre la tabla, en el menú
desplegado seleccione DP, CE, CXP.

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f) Ingrese los valores de DP, CE, CXP, Individuales optimizados para cada transición (Ion
molecular/Ion fragmento)

g) Ingrese un de duración de 1 min para el análisis.

h) Presione Edit Parameters

i) En la ventana desplegada seleccione la viñeta Source/Gas, Ingrese los valores básicos para
realizar optimización de la Fuente (FIA)

j) Presione OK

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k) Guarde el método de adquisición generado.
l) Verifique que este en el proyecto que corresponde a su analito,

Guarde el método en File/ Save As…

m) Coloque un nombre corto, sin ningún símbolo excepto _ guion bajo.

n) Presione Save.

Nancy Torres Saavedra

ntorres@genesysanalitica.cl
cel: +56966065039

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