CAPITULO 7.

CULTIVOS CELULARES

CULTIVOS CELULARES
1.- CULTIVOS CELULARES MICROBIANOS

Es un modelo de estudio invitro constituido por células que pueden crecer y

mantenerse en suspensión o en monocapa por más de 24 horas en condiciones
controladas.
Es el proceso de propagar microorganismos de forma artificial creándoles las
condiciones ambientales adecuadas para su desarrollo. Mediante una siembra, los
mismos comienzan a dividirse activamente empleando los nutrientes que le aporta
el medio de cultivo para “fabricar” nuevos microorganismos.
Comienzos

Desde que comenzó a establecerse la naturaleza microbiana de muchas

enfermedades. Se inició un gran interés por el desarrollo de métodos que
permitieran propagar y conservar durante largos periodos, a todos aquellos
gérmenes causantes de enfermedades con el objetivo de facilitar su estudio
morfológico, fisiológico y ecológico. Hoy en día se han desarrollado numerosos
métodos para la obtención de cultivos puros y mixtos de muchas especies
microbiológicas

a. Células microbianas

La célula microbiana es una entidad, aislada de otras células por una membrana
celular y que contiene en su interior una variedad de sustancias químicas y de
estructuras subcelulares.
La membrana celular es una barrera que separa del exterior el interior de la
célula. Dentro de la membrana celular se encuentran las diversas estructuras y
sustancias que hacen posible las funciones de la célula. Todas las células tienen
estructuras claves: el núcleo, donde se almacena la información necesaria para
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producir más células y el citoplasma, donde está la maquinaria para el desarrollo

y funciones de la célula.
Todas las células microbianas contienen cierto tipo de componentes químicos
complejos:
 Proteínas
 Ácidos nucleicos
 Lípidos
 polisacáridos
CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA CÉLULA MICROBIANA:
Nutrición: toman sustancias químicas del ambiente, transforman, liberan energía
y eliminan productos de desecho.
Auto duplicación: son capaces de digerir su propia síntesis.
Diferenciación: presentan cambio en su forma o función.
Señales químicas: pueden interactuar o comunicarse con otras células.
Movimiento: tienen movimiento propio.
Evolución: los cambios pueden influir en forma positiva o negativa en la salud
general de la célula o del organismo superior
Todas las células son similares en tres aspectos: Todas inician su vida con una
membrana plasmática, material genético y una región de citoplasma.
Membrana plasmática: membrana externa de doble capa, separa el interior de la
célula de sus alrededores y selectivamente permite que las sustancias la
atraviesen.
Material genético: dependiendo de la especie, el ADN ocupa un saco recubierto
de membrana (núcleo) en el interior de la célula o solo una región del interior de la
célula (nucleoide).
Región de citoplasma: región interna organizada donde se llevan a cabo
conversiones de energía, síntesis de proteínas, desplazamiento de partes
celulares y otras actividades necesarias.
b. Medios de Cultivo
Un medio de cultivo es un sustrato una solución de nutrientes que permite el
desarrollo de microorganismos. En las condiciones de laboratorio para realizar un
cultivo, se debe sembrar sobre el medio de cultivo elegido las muestras en las que
los microorganismos van a crecer y multiplicarse para dar colonias.
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Los microorganismos son los seres más abundantes de la tierra, pueden vivir en
condiciones extremas de pH, temperatura y tensión de oxígeno, colonizando una
amplia diversidad de nichos ecológicos. Entre los requerimientos más importantes
para su desarrollo están el carbono, el oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono e
hidrogeno. Muchas bacterias sin embargo necesitan del aporte extra de factores
de crecimiento específicos en forma de suero, sangre y extracto de levadura entre
otros.

CLASIFICACION DE MEDIOS DE CULTIVO:

 Según su estado físico los medios de cultivos se clasifican en sólidos,

semisólidos y líquidos.
a) Solidos: contienen agar unos 12-15g/L. son sólidos por debajo de 45ºC.
b) Semisólidos: contienen una pequeña cantidad de agar, unos 3g/L.
c) Líquidos: no contienen un agente solidificante.
 Según su origen:
a) Naturales: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal
o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composición química
no se conoce exactamente
b) Sintéticos: son los medios que contienen una composición química definida
cuali y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.
c) Semisintéticos: son los sintéticos a los que se les añaden factores de
crecimiento bajo una forma de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo
extracto de levadura.
 Según el uso al que se destinen los medios de cultivo se clasifican en:
a) Medios nutritivos: son aquellos que poseen los componentes mínimos para
que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos
especiales. El medio más conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar
común, que resulta de la adición de agar al caldo nutritivo.
b) Medios de enriquecimiento: incorporan una serie de factores que resultan
indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este
enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros productos biológicos que
aportan dichos factores. Un ejemplo de este tipo es el Agar Chocolate.

c) Medios selectivos: son utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas

bacterias contenidas en una población poli microbiana. El fundamento de estos
medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una población poli
microbiana específica. Un ejemplo de estos medios es el Caldo Selenito.
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d) Medios inhibidores: cuando las sustancias añadidas a un medio selectivo

impiden totalmente el crecimiento de una población microbiana, se denomina
inhibidor. Los medios inhibidores podrían considerarse como una variante más
restrictiva de los medios selectivos. Un ejemplo de este tipo de medios es el Mac-
Conkey.
e) Medios diferenciales: se utilizan para poner en evidencia características
bioquímicas que ayuden a diferenciar géneros o especies. Algunos ejemplos de
este tipo de medios de cultivo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre
(tipo de hemólisis), el SS (que es doblemente diferencial), entre otros.
f) Medios de identificación: son los destinados a comprobar alguna cualidad
especifica que puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo.
Estos medios deben poseer los elementos necesarios para asegurar el
crecimiento de microorganismos, el sustrato específico que vaya a ser
metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. Ejemplos de estos
medios es el Agar Kligler y el Simmons.
g) Medios de multiplicación: sirven para obtener una gran cantidad de células a
partir de un microorganismo ya aislado. El caldo-infusión cerebro-corazón (BHI),
es un ejemplo típico de estos medios.
 PARA BACTERIAS
Agar nutritivo:
El Agar nutritivo es un medio de cultivo usado normalmente como rutina para todo
tipo de bacteria. Es muy útil porque permanece solido incluso a relativas altas
temperaturas. Además, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en la
superficie, por lo que se distinguen mejor las colonias pequeñas. En un caldo de
nutrientes, la bacteria crece en el líquido, y aparece como una sustancia espesa,
con colonias difícilmente observables. El agar nutritivo contiene normalmente:
· 0.5 % Peptona
· 0.3 % extracto de carne/extracto de levadura
· 1.5 % agar
· 0.5% NaCl
· Agua destilada
· pH casi neutro (6.8) a 25 °C.
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Agar sangre:
Es una combinación de un agar base
(agar nutritivo) con el agregado de 5% de
sangre ovina, también puede usarse
sangre humana, para cultivos en una
placa de agar. El agar sangre aporta
muchos factores de enriquecimiento. Se
usa también para ver la capacidad
hemolítica de los microorganismos
patógenos.

Agar chocolate:
Es un medio de cultivo selectivo que se utiliza
para el crecimiento de ciertas bacterias, se
parte de un medio de agar sangre el cual se
calienta aproximadamente hasta que llega a
los 80ºC por 10 minutos hasta que toma la
coloración parecida al chocolate.

Agar S.S.:
Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas
especies de Shigella spp. A partir de heces, alimentos y otros materiales en los
cuales se sospeche su presencia.
 Peptona pancreática de carne 5.00g
 Extracto de carne 5.00g
 Sales biliares 8.50g
 Citrato sódico 10.00g
 Tiosulfato ssodico 8.50g
 Citrato férrico amomical 1.00g
 Lactosa 10.00g
 Rojo neutro 25.00mg
 Verde brillante 0.33mg
 Agar-agra 15,00g
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Agar MacConkey

Es un medio de cultivo selectivo y difeencial para

bacterias diseñado para aislar selectivamente
bacilos Gram negativos y entéricos (encontrados
normalmente en el tracto intestinal) y
diferenciarlos sobre la base de la fermentación de
la lactosa

 PARA HONGOS
AGAR CEREBRO DE CORAZON
Medio altamente nutritivo para el cultivo de una gran variedad de microorganismos
exigentes. Al añadirle antibióticos, puede utilizarse para el aislamiento y cultivo de
hongos.

 Cerebro de ternera 7.5g/l

 Infusión de corazón de res 10.0g/l
 Glucosa 2-0g/l
 Mezcla de peptonas 10.0g/l
 Di-potasio hidrogeno fosfato 2.5g/l
 Sodio cloruro 5.0g/l
 Agua 15.0g/l
 pH 7.4+- 0,2
AGAR DEXTROSASABORAUD

Medio para el cultivo de hongos filamentosos y levaduras.

Agar de Czapek-Dox (Modificado)

Medio para el cultivo de hongos y bacterias capaces de

utilizar el nitrato de sodio como única fuente de nitrógeno.

Agar Maltosa de Sabouraud

Medio para el cultivo de hongos filamentosos y levaduras.

Agar de Littman con Bilis de Buey

Medio selectivo, que suplementado con estreptomicina, se emplea para el

aislamiento primario y cultivo de hongos, especialmente dermatofitos.
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m-Medio de Sabouraud
Medio para la detección y aislamiento de hongos en muestras, mediante la técnica
de filtración por membrana.

Peptona Micológica
Base nutritiva especialmente diseñada para el cultivo de hongos patógenos y
saprófitos. Garantiza un crecimiento característico de hongos patógenos y no
patógenos en medios sólidos.

Peptona de Soya
Base nutritiva obtenida mediante la hidrólisis de la harina de soya con papaína. Se
caracteriza por su alto contenido de carbohidratos y vitaminas, por lo que su
empleo permite el crecimiento abundante de las bacterias más exigentes y de los
hongos.

2.- CULTIVOS DE CÉLULAS ANIMALES

a. Células Animales.
PARTES DE LA CÉLULA ANIMAL
Núcleo:
El núcleo de la célula es el centro de control de la misma. En pocas palabras, es el
responsable de dictar las instrucciones para el funcionamiento correcto de muchos
procesos biológicos. Es un elemento muy importante ya que alberga el ácido
desoxirribonucleico (ADN) que contiene la información genética que se va a
transmitir cuando se generen otras células.
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El ADN unido a proteínas forma la cromatina, la cual, al condensarse al momento

de la división celular, genera unas estructuras semejantes a hilos llamados
cromosomas.
El núcleo es un orgánulo ya que se encuentra en el citoplasma. Ocupa hasta el 10
por ciento del espacio del interior de la célula y es el componente más grande de
la célula.

Membrana celular o plasmática:

Es una delgada capa que rodea el citoplasma y separa la célula de su entorno. Su
principal función es proteger a la célula del exterior y facilitar el intercambio de
materiales.
Esta membrana cuenta con unos poros o canales de proteínas que comunican el
interior con el medio externo, gracias a las cuales ocurre el ingreso de sustancias
útiles para la nutrición y la salida de aquellas que son desecho. Es una membrana
semipermeable. Su composición se caracteriza por la presencia de una doble
capa de fosfolípidos con proteínas incrustadas.
Tiene un papel fundamental también en otros procesos importantes como la
adhesión celular y la comunicación celular que permite el intercambio de
información con otras células o tejidos.
La membrana celular utiliza cuatro métodos de transporte:
-Ósmosis pasiva y difusión.
-Transporte activo.
-Endocitosis.
-Exocitosis.
Finalmente, la membrana celular ayuda a fijar el citoesqueleto por lo que es vital
en mantener la forma de la célula y permitirle formar parte de grandes arreglos de
células lo que da forma a los tejidos.

Citoesqueleto:
El citoesqueleto da la forma y mantiene la estructura de la célula y es fundamental
en los procesos de endocitosis y división celular.

Citoplasma:
El citoplasma es todo el material celular con excepción del núcleo, o sea, incluye a
todos los orgánulos o partes especializadas de la célula y al citosol, una sustancia
incolora y de consistencia semilíquida en la que se encuentran numerosas
moléculas y se llevan a cabo las algunas reacciones químicas.
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Es en el citoplasma donde la mayoría de las actividades celulares ocurren,

incluyendo varias rutas metabólicas como la glucólisis y procesos como la división
celular.
El citosol es la parte del citoplasma que se encuentra fuera de los organelos
delimitados por membranas y equivale aproximadamente al 70% del volumen
celular.

ORGANELOS:

Retículo endoplasmático:
Es un sistema de canales y sacos aplanados e interconectados envueltos en una
membrana. La elaboración, almacenamiento y transporte de algunas sustancias
tiene lugar en este organelo. También otorga soporte interno.
Aunque el retículo endoplasmático está presente en la mayoría de las células
eucariotas, no se encuentra en los glóbulos rojos ni en los espermatozoides.
Existen dos tipos de retículos endoplasmaticos, el liso y el rugoso. Este último
tiene esa apariencia porque tiene ribosomas adheridos a su superficie. Sin
embargo,éstos ribosomas no son parte estructural del retículo, ya que libremente
se adhieren o desprenden de la membrana.

Ribosomas:
Los ribosomas son los organelos que sintetizan las proteínas vitales para muchos
procesos celulares. Son complejas máquinas moleculares que se encuentran en
todas las células vivas. Su forma es esférica y están formadas por ARN
ribosómico y proteínas.
Estos organelos pueden encontrarse en dos formas: libres en el citoplasma o
asociados a las membranas del retículo endoplasmático rugoso y realizan su
función de elaborar moléculas de proteínas uniendo aminoácidos.
Sin embargo, los ribosomas siguen el orden especificado por el ARN mensajero
que transfiere el código genético del ADN nuclear para indicar el orden en que los
aminoácidos deben ser enlazados.
Los ribosomas tienen dos partes, la subunidad menor que se encarga de leer el
RNA y la subunidad mayor cuya función es juntar los aminoácidos para crea una
cadena péptida.

Mitocondrias:
Las mitocondrias son las productoras de energía en la célula. La producen por
medio del proceso conocido como respiración celular y es donde se elabora el
Trifosfato de Adenosina (ATP, por sus siglas en inglés), una molécula que
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constituye la principal fuente de energía usable por la célula para realizar sus
funciones. Las mitocondrias sintetizan el ATP a partir de glucosa, ácidos grasos y
aminoácidos. No tienen una estructura definida ya que se deforman fácilmente
pero normalmente son alargadas.
Aparte de la producción de energía, las mitocondrias están relacionadas con los
procesos de comunicación celular, diferenciación celular y la Apoptosis o muerte
celular programada, pero también tiene control sobre el ciclo celular y el
crecimiento celular.
El número de mitocondrias en una célula varía ampliamente. Por ejemplo, los
eritrocitos o glóbulos rojos, no contienen mitocondrias pero las células del hígado
tienen alrededor de 2,000.
Las Mitocondrias tienen varias partes:
-Membrana mitocondrial externa.
-Membrana mitocondrial interna.
-Espacio intermembranoso.
-Matriz.
-Crestas.
b. Medios de Crecimiento
En la actualidad, el cultivo de células animales es uno de los sistemas más
utilizados en la producción de biofármacos ya que ha demostrado tener ventajas
con respecto a la expresión de proteínas recombinantes en bacterias u otros
organismos eucariotas, tales como levaduras o cultivos de células vegetales. Sin
embargo, su utilidad no es conocida totalmente dentro del ámbito farmacéutico ya
que ha sido considerado como un sistema de producción costoso, de bajo
rendimiento y difícil de manipular. Por ello, que se presenta de manera general el
desarrollo de los cultivos de células animales como sistemas productores de
biofármacos y se hace hincapié de sus ventajas y limitantes así como en las
aplicaciones actuales y futuras de este sistema dentro de la industria
biofarmacéutica. La composición de los medios de cultivo celular influye en la
proliferación, morfología y fisiología de las células que se propagan en ellos. Se
realizo un medio de cultivo a base de peptona y extracto de levadura grado
industrial para adaptar las líneas celulares. El pH es ligeramente alcalino, en un
rango de 7.2-7.4 cuyo valor es mantenido constante por un complejo de sistemas
tampón, que hacen que cambie muy poco, para asegurar nuestra supervivencia,
ya que si la sangre se vuelve ácida, aunque ligeramente, o básica, nos
moriríamos.
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TIPOS DE CULTIVO CELULAR

Cultivos en Monocapa:
El cultivo celular se precisa como la forma de propagar y mantener en condiciones
fuera del organismo células de origen animal o vegetal, tratando de que se
mantengan sus funciones, propiedades bioquímicas y genéticas. Por diferencias
en su habilidad de adherencia a algún material específico, pueden formar
monocapa o mantenerse en suspensión, si proceden de órganos crecen en
monocapa. Frecuentemente los cultivos en suspensión ocurren con células que
son circulantes, y puede referirse a células sanguíneas. El mantenimiento en
suspensión tiene como ventaja mayor facilidad de manipulación, debido a que
durante el pase de un cultivo al siguiente, la separación del sustrato no requiere la
adición de sustancias como la tripsina. Además es posible un mayor escalamiento,
debido a que dependen esencialmente de la accesibilidad del medio y de la
tensión de los gases pero no de la superficie del recipiente. Como desventajas se
enfatiza la necesidad de agregar suplementos, y el hecho de que pueden perderse
las interacciones espaciales y de adhesión. Las células para iniciar la proliferación
requieren adherirse a la superficie del contenedor para cubrir la superficie de
crecimiento o in vitro in vivo 18 confluencia. Cuando son derivadas de un tejido se
denominan cultivo primario. Este tipo de células muestran un mejor crecimiento en
monocapa. Los recipientes para el cultivo de células estacionarias son cajas de
Petri, botellas para el cultivo de tejido u otros. El material puede ser plástico o
vidrio previamente tratado, en los que para desprender a las células se usan
agentes proteolíticos como la tripsina.
Cultivos en suspensión:
A partir de cultivos primarios se pueden generar líneas celulares caracterizadas
por su gran capacidad de multiplicación. Algunas líneas celulares pueden crecer
como cultivos estacionarios o en suspensión con un periodo previo de adaptación.
Esos también requieren de matrices como protectores a la superficie celular; son
fuente de elementos nutricionales balanceados y se localizan en el suero. En ese
sistema no es indispensable el anclaje y son de gran utilidad para la producción de
proteínas extracelulares. Su ventaja práctica radica en que se reduce el manejo
del cultivo, se optimiza el uso de equipos, reactivos y se obtiene un mejor nivel de
producción.
Cultivos Primarios:
Se caracterizan por que provienen directamente de un tejido y conservan la
morfología del órgano o tejido de donde provienen además mantienen su número
diploide (2n). La mayor similitud a las células que las originaron redunda en una
mejor actividad y funcionalidad; se ha descrito que poseen una baja probabilidad
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de que se transformen en malignos por lo que se pueden usar para la producción

de vacunas. Así mismo se ha indicado que pueden contaminarse con agentes
adventicios especialmente de tipo viral del tejido original del aislamiento.

Líneas Celulares:
Son células que se diferencian genética y morfológicamente de las células de que
derivaron y que se han mantenido en cultivos continuos. Pueden ser resultado de
una transformación, que se refiere a cambio de un cultivo primario a línea. No
todas las líneas son igualmente sensibles al crecimiento de virus, lo que significa
que no hay un tipo celular universal. Las líneas celulares pueden derivar de
tumores, por transformación con oncogenes, o por tratamiento con carcinogénicos.
Una particularidad es que pueden crecer de manera indefinida.

Cultivos Tridimensionales:
Son el tipo de cultivo que permite mantener la estructura como aparece en el tejido
in vivo. Por su disposición permiten estudiar su mantenimiento, proliferación e
interacciones con células contiguas, así como el efecto de diferentes sustancias o
drogas que sean citotóxicos
LAS CÉLULAS ANIMALES Y SU USO EN TRATAMIENTOS MÉDICOS
Por qué se pueden implantar células animales?
Y esto es posible porque las células animales son muy similares a las células
humanas, son bloques vivos que constituyen la mayor parte de los cuerpos de los
seres vivos. Sin embargo, todavía queda un largo camino por recorrer para saber
si estos tratamientos tendrán efectos secundarios en el ser humano cuando se
utilicen en el campo médico.
LA IMPLANTACIÓN DE CÉLULAS ANIMALES EN ESPECIES DIFERENTES
La ciencia ha dado un paso más. También se busca la integración de las células
de un animal en otros animales, una experimentación genética entre animales que
ya se ha hecho, y que podría dar lugar a la quimera de un animal híbrido. Para
conseguirlo, se puede hacer o bien introduciendo los órganos de un animal en
otro, una proposición arriesgada, porque el sistema inmunológico del huésped
puede hacer que el órgano sea rechazado, o bien comenzando a nivel
embrionario.
Los científicos también usaron la tecnología CRISPR para crear embriones de
ratón carentes de los genes que causan la formación de órganos. Luego se
inyectaron células madre de rata en los embriones de ratón y se implantaron en un
sustituto. Debido a que las células de rata todavía contenían los genes para la
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formación de órganos, en las quimeras resultantes crecieron órganos compuestos

en gran parte de células de rata.
c. Anticuerpos monoclonales.
Los anticuerpos monoclonales son una poderosa herramienta para el diagnóstico
de laboratorio y un instrumento cada vez más utilizado en el tratamiento de
diversas enfermedades de los anticuerpos monoclonales y se revisan conceptos
relativos a la estructura y funciones de los anticuerpos, así como a la generación
de diversidad, activación y maduración de los linfocitos B. Se mencionan las
principales técnicas de producción de anticuerpos monoclonales y se enumeran
algunas de sus aplicaciones en patología humana.
Las células híbridas obtenidas tras el proceso de fusión contienen un número
elevado de cromosomas (72 del mieloma y 40 del linfocito B) que en las sucesivas
divisiones celulares se irán perdiendo hasta oscilar entre los 70 y los 80
cromosomas. Como consecuencia de dicho proceso, algunas células pierden la
capacidad de secreción de anticuerpos o bien funciones básicas para la viabilidad
celular. Por ello tan pronto como se identifica como positivo un pocillo se somete a
un proceso de clonación para evitar el crecimiento de células no productoras que
al ser metabólicamente más eficientes acabarían por dominar el cultivo.
Los linfocitos B son responsables de la inmunidad humoral. Su función principal es
la defensa del huésped contra gérmenes por medio de la secreción de anticuerpos
que reconocen las moléculas antigénicas de los patógenos.
Para producir anticuerpos monoclonales, primero se extraen células B del bazo de
un animal que ha sido expuesto al antígeno. Estas células B son fusionadas en
presencia de PEG (polietilenglicol) con células tumorales de mieloma múltiple (un
tipo de cáncer) que pueden crecer indefinidamente en cultivo celular. Esta fusión
hace a las membranas celulares más permeables. Estas células fusionadas
híbridas, llamadas hibridomas pueden multiplicarse rápida e indefinidamente (ya
que son células tumorales después de todo) y pueden producir gran cantidad de
anticuerpos.

3.- CULTIVOS DE CÉLULAS VEGETALES.

El cultivo de células y de tejidos vegetales consiste en el cultivo de células
vegetales aisladas o de fragmentos de tejido vegetal en un medio nutritivo en
condiciones asépticas y su posterior regeneración en plantas funcionales. Con
frecuencia, puede ocurrir que células vegetales no diferenciadas se desarrollen en
plantas funcionales si se cultivan apropiadamente in vitro.
 CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES

El cultivo de células y de tejidos vegetales comprende una amplia gama de

técnicas de cultivo que permiten regenerar plantas funcionales a partir de tejidos
embrionarios, fragmentos de tejidos, callos, células aisladas o protoplastos.
La regeneración de plántulas por medio de técnicas de cultivo de tejidos es un
requisito fundamental para utilizar la tecnología de la genética molecular en una
especie cultivada particular. Desafortunadamente, las especies cultivadas suelen
responder de manera distinta a las técnicas de cultivo de células.
Dentro del proceso de micropropagación en cultivos in vitro diferenciamos varias
fases o etapas:
FASE 0:
PREPARACIÓN DE LA PLANTA MADRE
Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener
explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener
estos explantes es recomendable mantener a las plantas madre, es decir la planta
donadora de yemas, durante un período de tiempo que puede oscilar entre unas
semanas o varios meses en un invernadero bajo condiciones controladas. En ese
ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de
la nutrición y riego adecuados para permitir un crecimiento vigoroso y libre de
enfermedades.
FASE 1:
DESINFECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL
Una vez elegida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales
se obtendrán los explantes. Los explantes pueden ser yemas, trozos de hojas,
porciones de raíces, semillas, etc. Antes de extraer los explantes se hará una
desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes
externos. Los contaminantes más comunes son los hongos y las bacterias que
habitan en forma natural en el ambiente. Una vez desinfectado el material vegetal,
se debe mantener en condiciones de asepsia. A efectos de obtener las
condiciones de asepsia, se trabajará en cabinas de flujo laminar para extraer los
explantes a partir del material vegetal. Estos explantes se introducirán en un tubo
de cultivo conteniendo medio de iniciación para poder controlar la sanidad y la
viabilidad, luego de realizar la desinfección del material con hipoclorito de sodio
(agua clorada comercial), pura o diluída durante un período de 5 a 15 minutos,
seguido por 3 a 4 enjuagues en agua esterilizada.
FASE 2:
INTRODUCCIÓN DEL MATERIAL IN VITRO
Luego de la desinfección superficial, las semillas o las yemas dependiendo del
material seleccionado, se ponen en medio de cultivo estéril. En un período de una
 CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES

semana o quince días, comienza el proceso de germinación o regeneración de

nuevos tejidos vegetales, iniciando el ciclo de cultivo in vitro.

FASE 3:
MULTIPLICACIÓN DE LOS BROTES
Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron la FASE 1 y 2
originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varias hojas. En la base
de cada hoja hay una yema que se desarrollará luego de ser puesta en contacto
con el medio de cultivo. Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar
en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros
recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo
laminar o en un lugar aislado que nos permita mantener las condiciones de
asepsia. De esta forma aumenta el número de plantas en cada repique o división
de las plantas.
El número de plantas que se obtiene dependerá de la especie vegetal y de las
condiciones del medio de cultivo. El número de plantas que se obtiene por la vía
de la micropropagación permite alcanzar incrementos exponenciales,
considerando que todos los factores que afectan el crecimiento hayan sido
optimizados.
FASE 4:
ELECCIÓN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTOS
Para enraizar los explantes se utilizan principalmente plantines individuales de un
tamaño aproximado de 2 centímetros. Los brotes obtenidos durante la fase de
multiplicación se transfieren a un medio libre de reguladores de crecimiento o que
solo contenga hormonas del tipo auxinas. Algunas especies de plantas no
necesitan pasar por esta etapa y emiten sus raíces en el mismo medio de cultivo
donde desarrollan yemas nuevas, por lo tanto el proceso de multiplicación y
enraizamiento transcurren en forma simultánea.

FASE 5:
ACLIMATACIÓN DE LOS EXPLANTOS ENRAIZADOS
Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de
manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación.
En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la
adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales. En el momento en que
se extraen los explantes o plantines enraizados de los frascos, están poco
adaptados a crecer en un invernáculo, ya que estos explantes han enraizado y
crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente
tienen estomas (estructuras responsables de regular la transpiración y pérdida de
 CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES

agua en la planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de

la humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecación del
explante. La siguiente lista presenta una comparación de las características de
una planta en condiciones de laboratorio (in vitro) respecto a una planta en
condiciones naturales (in vivo):
IN VITRO IN VIVO
• No realiza fotosíntesis • Realiza fotosíntesis
• Crecimiento en condiciones • Crecimiento en condiciones no
controladas controladas
• Crecimiento en condiciones de • Exposición a los patógenos y
asepsia gérmenes del ambiente
• Alta humedad relativa • Humedad relativa variable
• Estomas no funcionales • Estomas funcionales
• Ausencia de pelos radiculares • Presencia de pelos radiculares
• Ausencia de cera en la cutícula • Presencia de cera en la cutícula

Para el trasplante, se requiere un sustrato suelto, poroso, con mezcla de arena

turba, cáscara de arroz quemado , para permitir un desarrollo y crecimiento de
raíces muy rápido. Las mezclas son diferentes y muy variadas de acuerdo a la
especie con la que se trabaja.
Las condiciones del cultivo in vitro , generan cambios en algunos aspectos
anatómicos y fisiológicos de las plantas, por esta causa, durante la aclimatación,
los cambios deben ser muy graduales, para minimizar el estrés y tener mayor tasa
de sobrevivencia.
Las especies vegetales estudiadas han sido: papa, boniato, ajo, frutilla, manzano,
ciruelo, duraznero, peral, vid, frambuesa, zarzamora, arándanos, eucaliptos,
marcela, especies aromáticas, especies forrajeras y otras.
Con este mecanismo se ha buscado armonizar la demanda de plantas por parte
de los productores interesados en este nuevo rubro y el interés de laboratorios
comerciales y viveristas por ampliar los productos con calidad verificable que son
ofrecidos a través de sus procesos de multiplicación de plantas.
Las razones que determinan que el cultivo in vitro de células y tejidos vegetales
constituya una tecnología interesante para la producción de plantas y productos
naturales de interés, son las siguientes:
1) la producción de plantas de sanidad controlada, lo que permite incrementos en
los rendimientos.
 CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES

2) la capacidad de establecer un sistema de producción definido, en relación a las

demandas del mercado.
3) el cultivo de especies no domesticadas y/o difíciles de cultivar a campo.
4) la conservación del germoplasma de plantas de interés comercial o en vías de
extinción.
5) la producción de compuestos químicos conocidos provenientes de plantas de
crecimiento lento o difíciles de obtener por extracción o por síntesis química.
6) la síntesis de nuevos productos químicos expresados únicamente en los
cultivos in vitro.
7) la producción de plantas transgénicas resistentes a patógenos, a herbicidas o a
estrés abiótico, con mejor calidad nutricional, que actúen como biorreactores en la
producción de proteínas, carbohidratos o lípidos..
a. Células vegetales.
La célula vegetal es aquella que compone a los miembros del reino Plantae. Es
una célula eucariota, con un núcleo diferenciado, membrana y citoplasma al igual
que la célula animal. Ambos tipos de células comparten algunas características
pero difieren en otras. Específicamente, la célula vegetal cuenta con partes únicas
ya que realiza un proceso exclusivo del reino Plantae, la fotosíntesis.
No obstante sus diferencias con la célula animal, es importante recordar que todas
las células contienen el material genético hereditario que pasa a los
descendientes. Los genes en la célula vegetal se encuentran en unas estructuras
llamadas cromosomas dentro del núcleo celular.
Presentan algunas diferencias:
 Las células vegetales presentan una pared celular celulósica, rígida que
evita cambios de forma y posición.

 Las células vegetales contienen plastidios, estructuras rodeadas por una

membrana, que sintetizan y almacenan alimentos. Los más comunes son
los cloroplastos.
 Casi todas las células vegetales poseen vacuolas, que tienen la función de
transportar y almacenar nutrientes, agua y productos de desecho.
 Las células vegetales complejas, carecen de ciertos organelos, como los
centriolos y los lisosomas.
 CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES

PARTES DE LA CÉLULA VEGETAL

Este tipo de células tiene una estructura con varios orgánulos iguales o
semejantes a otras células eucariotas y otros completamente exclusivos como
son:
Núcleo:
Es el centro de control de la célula y contiene la información genética en forma de
ADN (Acido desoxirribonucleico). En todas las células de los miembros de una
misma especie se halla el mismo número de cromosomas.

Membrana nuclear:
La membrana o envoltura nuclear, es una delgada capa de lípidos con orificios
que consienten el acceso y la salida de material del núcleo de la célula y que
separa al núcleo del citoplasma.

Membrana plasmática o celular:

Es también una capa externa pero en este caso envuelve a toda la célula. En su
composición predominan los lípidos y las proteínas y su superficie exhibe unos
diminutos poros necesarios para los procesos de intercambio de sustancias entre
la célula y el exterior.

El Citoesqueleto:
Es una importante estructura que le da soporte y forma a la célula y mantiene a los
orgánulos en su lugar. Es fundamental en el crecimiento, movimiento y
 CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES

reproducción de la célula, así como en el intercambio de sustancias con el

exterior.

Pared celular:
Es una capa o estructura rígida compuesta principalmente de celulosa y cuya
función es proteger a la membrana plasmática y dar rigidez y forma a la célula.
Adicionalmente, cuenta con unos conductos llamados plasmodesmos que
permiten la comunicación con otras células.
Tiene tres partes fundamentales:
-Pared primaria.
-Pared secundaria.
-Laminilla media.
Citoplasma:
Es la materia dentro de la membrana plasmática exceptuando al núcleo y que
contiene, al citosol y a los orgánulos de la célula. Está revestida por una delgada
película. Para entenderlo mejor, es todo lo que se encuentra entre la membrana
plasmática y el núcleo.

ORGÁNULOS:
Retículo endoplasmático:
Se define como un sistema de membranas semejantes a sacos que rodean el
núcleo, gracias a las cuales se realiza el transporte de sustancias dentro de la
célula y también participan en la síntesis de proteínas y lípidos . Existen dos tipos
el retículo endoplasmático liso y el rugoso .

Aparato de Golgi:
Se trata de un conjunto de sacos de forma aplanada y dispuestos de forma
apilada, que se encarga de enviar sustancias a través de la membrana plasmática.

Ribosomas:
Son los sitios donde se realiza la síntesis de proteínas. Se componen de proteínas
y ARN ribosómicos.

Vacuola:
Las células vegetales maduras tienen una vacuola de considerable tamaño que
contiene líquidos. Es un orgánulo grande rodeado por una membrana llamada
tonoplasto o membrana vacuolar. Gracias a las vacuolas los tejidos de las plantas
permanecen rígidos.
 CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES

Mitocondrias:
Son el centro energético de la célula. Estos orgánulos están envueltos en dos
membranas y normalmente se observan unas crestas en la membrana interna. En
las mitocondrias se realiza la respiración celular por medio de la cual se produce
ATP (Trifosfato de adenosina).
Plastos:
Producen y almacenan importantes elementos para el proceso de la fotosíntesis,
la síntesis de lípidos y de aminoácidos. Existen dos tipos de plastos, los primarios
y los secundarios. Los primeros se encuentran en la mayoría de las plantas
mientras que los secundarios son exclusivos del plancton.
Leucoplastos.
Almacenan sustancias incoloras, pero permiten la conversión de la glucosa.
Cromoplastos.
Estos plastos son responsables de los maravillosos colores que tienen muchas
frutas o flores.
Cloroplastos.
Son orgánulos característicos de la célula vegetal pues en ellos tiene lugar el
proceso de la fotosíntesis. Contienen una sustancia de color verde o pigmento que
recibe el nombre de clorofila y que confiere a las plantas su distintiva coloración
verde. Los cloroplastos convierten la energía lumínica proveniente del sol en
energía química.

IMPORTANCIA DE LA CÉLULA VEGETAL

Sin lugar a dudas la fotosíntesis, el proceso responsable de la transformación de
la energía solar en materia orgánica es la piedra angular de la vida en la Tierra.
Para lograr esto, la fotosíntesis crea moléculas de ATP y NADPH, las primeras
donde queda almacenada la energía química creada.
En general, también el núcleo de las células vegetales contiene el material
hereditario que pasa de generación en generación. Al mismo tiempo, son el punto
donde se llevan a cabo las imprescindibles funciones bioquímicas que sintetizan
moléculas esenciales.
A diferencia de la célula animal, la vegetal posee una pared celular que aporta
rigidez y protección a la membrana plasmática. Sin embargo, esta pared no es
exclusiva de la célula vegetal, ya que otras células eucariotas también la tienen.
Los cloroplastos y las vacuolas son también inherentes a las células de cualquier
tipo de planta que realiza la fotosíntesis. Este orgánulo es el responsable de la
 CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES

tonalidad verde de las plantas y de la transformación de la materia inorgánica en

materia orgánica a partir de la energía del Sol. Es un elemento importantísimo en
la naturaleza ya que desprende el oxígeno vital que los seres vivos respiran.

b. Tipos de cultivo de tejidos vegetales.

La producción de plantas y de metabolitos puede realizarse mediante cultivos de
tejidos vegetales diferenciados o indiferenciados.
 Cultivos diferenciados: Los métodos de regeneración de plantas por
cultivo in vitro incluyen la embriogénesis somática y la organogénesis.

 Embriogénesis somática: Los embriones que no resultan de la fusión de

gametos se definen como embriones somáticos, asexuales o adventicios. Son
estructuras bipolares con un eje radical-apical, no poseen conexión vascular con el
tejido materno y son capaces de crecer y formar plantas normales. La
embriogénesis somática se puede obtener directamente a partir de células
aisladas o utilizando callos. Si bien implícitamente todas las células vegetales
tienen la información genética para formar una planta completa y funcional, se
usan comúnmente cotiledones e hipocótilos para producir embriones somáticos.
Generalmente se utilizan medios con altas concentraciones de sales, de sacarosa
o de manitol y se necesita la presencia de una auxina para la iniciación del callo
embriogénico, habitualmente 2,4-D. Como la maduración y la germinación de los
embriones no ocurren en presencia de esta auxina, se usa en bajas
concentraciones para permitir el desarrollo debe remover o usarla en bajas
concentraciones para permitir el desarrollo. Además, tanto la inducción de la
embriogénesis somática como el desarrollo de los estados subsiguientes
dependen de la presencia de nitrógeno reducido. La maduración comienza
después que el embrión completa el proceso de histodiferenciación, el crecimiento
por mitosis se detiene y la célula comienza a expandirse y a acumular sustancias
de reserva. En esta etapa no es necesaria la adición de reguladores de
crecimiento en el medio de cultivo, aunque en algunas especies se recomienda el
uso de citocininas y en otras la adición de ABA.
 Organogénesis: La organogénesis consiste en la formación de un
primordio unipolar a partir de una yema y el desarrollo de ese primordio en brotes
vegetativos que luego enraizan vía la formación y proliferación de meristemas
radicales. Los brotes pueden formarse directamente del explanto (organogénesis
directa) o indirectamente a partir de callos.
La organogénesis se desarrolla por inoculación de tejido meristemático estéril
(yemas axilares o adventicias) en un medio suplementado con niveles óptimos de
sales, de compuestos orgánicos y de reguladores de crecimiento. La calidad y
cantidad de los componentes del medio dependerá de la especie y del explanto
 CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES

que se quiera cultivar in vitro dado que la inducción de un tipo específico de

órgano involucra señales aún poco conocidas.
La micropropagación es la tecnología más difundida de propagación masiva de
plantas vía organogénesis. Consiste en un conjunto de procedimientos asépticos
de cultivo de órganos, tejidos o células que permitan la producción de poblaciones
de plántulas idénticas a la planta original de la que se derivan. Los cultivos
diferenciados son más estables genéticamente que los cultivos indiferenciados. A
su vez, los cultivos de yemas axilares que provienen de meristemas preexistentes
presentan menores índices de variación genética que el cultivo de yemas
adventicias que se originan de novo a partir de tejidos somáticos con desarrollo
directo o indirecto a través de la formación de callos.
 CULTIVOS INDIFERENCIADOS: Los cultivos vegetales indiferenciados se
obtienen a partir de órganos o tejidos organizados cultivados en un medio
nutritivo apropiado (sólido o líquido) que desdiferencian ante la presencia de
auxinas exógenas. En medio sólido se obtienen masas celulares más o menos
compactas que constituyen los callos, mientras que en medio líquido se logran
las suspensiones celulares formadas por células libres o agregadas. Los cultivos
de células vegetales indiferenciadas pueden exhibir una gran variedad
estructural, genética y metabólica con respecto a la planta madre.
 Tipos celulares presentes en los cultivos in vitro indiferenciados
En los cultivos indiferenciados se encuentran células con gran variedad de
tamaños y formas, de citoplasma denso, con vacuolas pequeñas y con alto
potencial morfogénico que se pueden homologar a las células meristemáticas de
las plantas. También se observan células alargadas y células muy grandes con
una gran vacuola central y bajo.
Sin embargo, debido a que las células en suspensión se dividen en forma
asincrónica, los tipos celulares descritos pueden no corresponder a tipos celulares
diferentes sino a distintos estadios dentro del ciclo de crecimiento. La adición de
pectinasas, la reducción de la concentración de calcio y el aumento de la
velocidad de agitación permite reducir la agregación.

c. Medios de cultivo.
Componentes inorgánicos del medio de cultivo
Los medios de cultivo están constituidos por componentes inorgánicos, los cuales
son suministrados en cantidades relativamente grandes (macronutrientes) y otros
añadidos en menor cantidad (micronutrientes).
Dentro de los macronutrientes, se encuentran iones
de nitrógeno (N), potasio (K), calcio (Ca), fósforo (P), magnesio (Mg) y azufre (S).
 CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES

El nitrógeno se adiciona al medio de cultivo en forma de nitrato o iones amonio, o

la combinación de ambos iones, el sulfato de magnesio (Mg SO 4 7H2O) satisface
tanto el requerimiento de magnesio como el de azufre, el fósforo puede
adicionarse en cualquiera de las formas NaH2PO4.H2O ó KH2PO4, el potasio es un
catión que se agrega en forma de KCl, KNO3, ó KH2PO4, el calcio se adiciona con
Ca Cl2.2H2O, Ca(NO3)2.4H2O o la forma anhidra de cualquier sal y el cloro se
presenta en forma de KCl ó CaCl2.
Los requerimientos de nitrógeno son generalmente provistos por una mezcla de
nitrato y amonio en concentraciones variables entre 3 y 50 mM.
Los micronutrientes, que son añadidos a los medios de cultivo son hierro
(Fe), níquel (Ni), cloro (Cl), manganeso (Mn), cinc (Zn), boro (B), cobre (Cu), y
molíbdeno (Mo). Estos elementos junto con el carbono (el C), oxígeno (O) e
hidrógeno (H) constituyen los 17 elementos esenciales. Estos micronutrientes
aunque son requeridos en menor cantidad son necesarios para una adecuada
actividad metabólica de las células vegetales. El Fe y el Mn son esenciales para la
síntesis de clorofila y la función de los cloroplastos. El Fe es requerido para la
formación de precursores de la clorofila y es un componente de los citocromos,
ferredoxina y legohemoglobina, esta última es esencial en la fijación de nitrógeno
por las plantas leguminosas se agrega al medio de cultivo en una concentración
de 0,01 a 0,15 mM. El Mn es necesario para el mantenimiento de la ultraestructura
y el proceso fotosintético. Los elementos Cu y Zn son requeridos para la oxidación
e hidroxilación de compuestos fenólicos. El Zn está relacionado con la síntesis de
triptófano, precursor del ácido indolacético (AIA) y ejerce control sobre las
ribonucleasas lo que permite mantener la síntesis proteica en caso de estrés
ambiental (medio de cultivo). El Cu, además es un componente de la Plastocianina
que es esencial en el funcionamiento del transporte electrónico de la fotosíntesis y
es activador de otras enzimas como la oxidasa del ácido ascórbico (Vitamina C),
tirosinasa, lacasa, fenolasa y citocromoxidasa, esta última forma parte de la
cadena de transporte electrónico del proceso respiratorio. El Mo forma parte de las
nitratorreductasas de las plantas y nitrogenasas en leguminosas y bacterias
fijadoras de nitrógeno. El boro (B) es necesario para el mantenimiento de la
actividad meristemática, está involucrado en la síntesis de bases nitrogenadas.
Luego el Fe es añadido en forma de quelato cuyas moléculas son capaces de
retener un ión de un metal con varias uniones químicas formando un anillo
complejo (un quelato) como el EDTA (ácido etilendinitrotetraacético), que utilizado
en bajas concentraciones estimula el crecimiento al hacer disponible en bajas
cantidades este elemento.
La concentración necesaria de fosfato indicada en los diferentes medios de cultivo
varía entre 0,1 y 1,5 mM. Generalmente se agrega calcio en mayores
concentraciones que en los medios microbianos, variando entre 1 y 3 mM.
 CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES

En general el boro, el manganeso, el iodo y el zinc se utilizan en concentraciones

variables entre 1 y 100 mM, mientras que el resto de los micronutrientes se
agregan en valores inferiores a 0,1 mM.
El medio de cultivo más utilizado es la formulación de las sales Murashige y Skoog
el cual fue desarrollado inicialmente para el crecimiento de callos de tabaco y en la
actualidad se emplea como medio de cultivo basal para un grupo importantes de
plantas de interés para la alimentación y con fines ornamentales.
Sales minerales del medio de cultivo de Murashige y Skoog:

Ingredientes Cantidad en mg L-1)

NH4NO3 66 000

K NO3 76 000

Mg SO4.7H2O 14 800

KH2 PO4 6 800

Fe SO4.7H2O 1390

Na2 EDTA.2H2O 1865

CaCl2.2H2O 15172

H3BO3 6200

Mn SO4.H2O 16900

Zn SO4.7H2O 8600

Na2 MoO4.2 H2O 240

Cu SO4.5H2O 25

Co Cl2.6H2O 25

KI 83
 CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES

Componentes orgánicos del medio de cultivo

Dentro de los componentes orgánicos del medio de cultivo se encuentran:
Carbohidratos
La nutrición que es desarrollada en las condiciones in vitro a partir en los
diferentes órganos y tejidos son ampliamente heterótrofos con respecto al carbono
debido a la ausencia o insuficiencia de asimilación clorofílica, por lo cual resulta
indispensable añadir azúcares a los medios de cultivo como fuente de energía y
reguladores osmóticos. La sacarosa es el azúcar empleado universalmente. Le
siguen en importancia glucosa, maltosa, rafinosa, fructosa y galactosa entre otros.
La sacarosa, en concentraciones del 2 al 4 % (p/v), constituye la fuente más
utilizada. Otros azúcares capaces de sostener el crecimiento o incrementar la
producción de metabolitos son glucosa, fructosa, trehalosa, maltosa y lactosa.
Vitaminas
Si bien las plantas son autótrofas, puede ser necesario añadir al medio de cultivo
algunas vitaminas hasta que los cultivos prosperen.
Son necesarias para llevar a cabo una serie de reacciones catalíticas en el
metabolismo y son requeridas en pequeñas cantidades. Las vitaminas más
empleadas son:
 Tiamina (vitamina B1): se añade como hidrocloruro de tiamina y constituye
una vitamina esencial para el crecimiento de células vegetales. Es un
coenzima de la descarboxilación de los cetoácidos piruvato y œ-
cetoglutarato y es esencial para el crecimiento radical pues interviene en la
síntesis de citocininas.
 Ácido Nicotínico: forma parte de las coenzimas NAD y NADP que
intervienen en la transferencia de hidrógeno, además de ser precursor el
triptófano y por tanto tiene un efecto sinérgico con el AIA en la producción
de raíces y ejerce acción inhibitoria en el desarrollo de yemas axilares.
 Piridoxina (Vitamina B6): Es añadida como hidrocloruro de Piridoxina
(Piridoxina-HCl). Participa como coenzima en el metabolismo de los
aminoácidos, entre ellos el triptófano, precursor de AIA y ácido nicotínico,
además de favorecer la formación de raíces.
 Myo-inositol: No es propiamente una vitamina, sino un azúcar-alcohol.
Tiene un efecto sobre la proliferación de tejidos y sobre la activación de la
organogénesis.
 CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES

 Ácido ascórbico y ácido cítrico: Son añadidos a los medios de cultivo en

ocasiones no como vitaminas sino como antioxidantes para evitar el
oscurecimiento de determinados tejidos.

Aminoácidos y extractos naturales

En general, si los aminoácidos corresponden a la forma D son inhibidores,
mientras que en la forma L tienen acción benéfica.
Los aminoácidos favorecen la proliferación de callos y la organogénesis. Los
efectos obtenidos mediante el aporte de aminoácidos parecen muy variables
según la especie y el tipo de morfogénesis estudiada. Dentro de ellos se
encuentran la glutamina, L-arginina, L-cisteína entre otros.
Los extractos naturales estimulantes son numerosos productos de composición
variable y no bien definida. Dentro de ellos se encuentran extracto de levadura,
hidrolizado de caseína, peptona y agua de coco (más utilizado) entre otros.
Agentes gelificantes
El agar se ha convertido en el material de soporte más ampliamente usado, pues
provee el medio de un excelente gel húmedo que sirve como soporte al explante.
También es utilizado el gelrite o fitagel.
Agua
Es de vital importancia la calidad del agua empleada para realizar los medios de
cultivo la cual debe ser destilada. Siempre que se realicen trabajos con cultivo de
tejidos y células in vitro el agua a usar debe tener la mayor calidad posible
(desionizada), debiendo estar entre 0.5 a 2 mS/ cms.

Reguladores del crecimiento vegetal

Los reguladores del crecimiento vegetal se agrupan en cinco categorías: auxinas,
citokininas, giberelinas ácido abscísico y etileno. Además de estas sustancias
naturales de la planta existen otros productos que pueden utilizarse como
reguladores del crecimiento para el cultivo in vitro.
Los reguladores de crecimiento son componentes exclusivos de los medios de
cultivos vegetales. El pH inicial de los medios de cultivo se regula, en general,
entre pH 5,5 y 6,0, dado que afecta tanto el crecimiento como la producción.
Principales reguladores del crecimiento empleados en cultivo de tejidos.
AUXINAS
 ANA: Ac. naftalenacético
 2,4 D: Ac. 2,4 diclorofenoxiacético
 Picloram
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 Dicamba
CITOKININAS
 BAP: 6 - bencilaminopurina
 KINETINA: 6 - furfurilaminopurina
 Z: Zeatina
GIBERELINAS
 GA3: Ac. giberélico
 GA1, GA4, GA7: (giberelinas)
ETILENO ACIDO ABSCISICO POLIAMINAS
 Putrescina
 Espermidina
 Espermina
BRASINOESTEROIDES
 Análogos Biobras 6
 Biobras 16
OLIGOSACARINAS
 Pectimorf: oligogalacturónido DPS (12-14)
Estos nutrientes deben estar en una concentración tal que permita el adecuado
crecimiento celular. Muchas células vegetales son sensibles a los niveles de
fosfatos en el medio. Habitualmente, los fosfatos son almacenados en la vacuola y
adquiridos desde allí para el crecimiento, mientras que la síntesis de metabolitos
comienza al agotarse el fosfato vacuolar.
d. Producción de metabolitos secundarios.
Algunas células vegetales producen metabolitos secundarios importantes en las
interacciones de la planta con el medio ambiente (protección frente a
depredadores, patógenos o estrés ambiental) o que están relacionadas con la
maquinaria reproductiva de la planta (atracción de insectos para la promoción de
la polinización). Muchos de estos productos secundarios tienen uso en la industria
farmacéutica y en la producción de tests de diagnóstico, de fragancias, de aditivos
alimentarios y de biocidas en general.
 CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES

Metabolitos secundarios producidos por cultivos in vitro de celulas

vegetales:

4. MEDICION DEL CRECIMIENTO CELULAR:

Existen diferentes sistemas para detectar y medir el crecimiento de

microorganismos. En este punto nos vamos a referir al crecimiento microbiano a
escala de poblaciones comenzaremos con algunos métodos habituales de medir
ese crecimiento.
 Aumento de masa del cultivo
 Aumento de numero de células
Ambos tipos de expresiones son equivalentes entre sí en cultivos que estén
en crecimiento balanceado o equilibrado (en el que todos los componentes
aumentan una misma proporción por unidad de tiempo).
 CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES

1.-MEDIDA DE MASA CELULAR

Esta técnica es utilizada para medir el peso de las bacterias, es un método muy
utilizado a que si la población aumenta de masa celular.
1.1.- MÉTODOS DIRECTOS
En estos métodos se requieren preparaciones limpias, sin partículas extrañas.
1) Determinación del peso húmedo: se obtiene a partir de una muestra en
suspensión que es pesada luego de la separación de las células por filtración o
centrifugación. Es una técnica útil para grandes volúmenes de muestra.
 Se tara un tubo de centrifuga
 Se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante,
 Se determina el peso del sedimento
La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio
intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de líquido retenida
puede ser importante, por ejemplo, un pellet de células bacterianas muy
empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30%
del peso, de acuerdo a la forma y deformación celular.
2) Determinación del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca
antes de ser pesado (105ºC, toda la noche), hasta peso constante. Las medidas
de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso húmedo.
El peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que se encuentran
en una suspensión se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105°C
hasta peso constante. Esta técnica es útil para grandes volúmenes de muestra,
debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un
gran número de bacterias.
La desventaja de este método es que componentes volátiles de la célula pueden
perderse por el secado y puede existir alguna degradación. También la muestra
seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente
tiene una humedad relativa alta.
 CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES

3) Determinación del nitrógeno total: “técnica de micro-Kjeldahl.”

Es una técnica que permite determinar indirectamente la masa de una población
bacteriana. Existen distintas técnicas para determinar la cantidad de nitrógeno que
contiene una muestra con relación al compuesto que se quiera determinar. Puede
analizarse el nitrógeno no proteico mediante el NO2-, NO3-, NH4+, el nitrógeno
proteico mediante absorción en UV, Reacción de Biuret, Reacción de Lowry, o el
nitrógeno total mediante la Digestión de Kjeldahl.

4) Determinación de un componente característico: Es una técnica que

determina la cantidad existente de un determinado ácido nucleico (generalmente
ADN, ARN, proteínas, ATP, clorofilas en organismos fotosintéticos, etc.)

1.2.- MÉTODOS INDIRECTOS

1) Medida de consumo de nutrientes o de producción de algún metabolito
por unidad de tiempo. Ejemplos: consumo de oxígeno (QO2) y consumo de
carbónico (QCO2), determinados por el respirómetro de Warburg. Producción de
ácidos.
2) Métodos turbidimétricos (ópticos). Son muy usados en la práctica cotidiana
del laboratorio. La base común de estos métodos consiste en la medición de la
cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un cultivo bacteriano.
a) Espectrofotómetro: Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio
de Microbiología o Bioquímica. Mide la densidad óptica (D.O.), es decir la
absorbancia (una medida de la luz transmitida a través de la suspensión).
b) Nefelómetro: Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor está
situado en ángulo recto respecto de la dirección de la luz incidente, y lo que se
mide es pues, la luz dispersada directamente por la preparación. Posee mayor
sensibilidad que el espectrofotómetro.
a. Medición del número de celulas:
Consiste en insertar a las células en una cámara para hacer el proceso de tinción,
lo que permite determinar el número de microorganismos que se han desarrollado
en la dilución de la muestra en el volumen de la cámara con las cuales se puede
identificar el número de células muertas y vivas para predecir cuál será la cantidad
de células crecientes en un tiempo definido.

MÉTODOS DIRECTOS
1) Cámara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial
con una graduación en superficie y unas medidas muy concretas:
La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la
plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el número de
 CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES

células en varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros

grandes). Se anota el número n de células observadas en esas 16 celdillas.
Entonces, la concentración celular es fácil de establecer:
n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células/ml.

2) Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter): Se hace pasar una

suspensión microbiana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente
eléctrica. Cada vez que por un orificio (30 m diámetro) pasa una partícula (p. ej.,
bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de
registro electrónico, que detecta el número y el tamaño de las partículas que van
pasando. (El tamaño detectado es función de la intensidad del pulso de voltaje al
paso de la partícula).

b. Métodos Indirectos
1) Recuento de viables en placa: Los métodos de recuento de número de
células que hemos visto hasta ahora (los directos) no distinguen entre células
vivas y muertas. En muchos casos conviene contar las células vivas, y esto en
laboratorio se suele hacer mediante el recuento de viables. (Una célula se define
como viable cuando, colocada en un medio adecuado, es capaz de dividirse y dar
descendencia). El método habitual de lograr esto es sembrar pequeñas alícuotas
de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petri con medio
sólido (con agar). Cada célula viable dará origen a una colonia visible después del
tiempo adecuado de incubación. Contando las colonias visibles, teniendo en
cuenta la dilución de la que proceden y el volumen de alícuota utilizado, es fácil
deducir el número de células viables en la suspensión original.
2) Recuento sobre filtros: Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se
hace pasar un gran volumen de suspensión a través de una membrana de
nitrocelulosa o de nylon estériles (con un diámetro de poro que retiene las
bacterias pero permite el tránsito de sustancias). Posteriormente, el filtro se
 CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES

deposita sobre la superficie de un medio de cultivo sólido. Las colonias se forman

sobre el filtro a partir de las células retenidas. Dichas colonias se cuentan,
deduciéndose la concentración original de viables en función del volumen de
suspensión que se hizo pasar por el filtro.
5. INMOVILIZACIÓN CELULAR

La inmovilización celular puede ser definida como la ubicación física de células en

un espacio o región específica, de forma natural o inducida, en la cual son
capaces de mantener una actividad catalítica deseada.
El termino inmovilización de células se refiere a células físicamente confinadas o
localizadas en una cierta región definida en el espacio reteniendo sus propiedades
y actividades catalíticas. Asimismo, dependiendo del tipo de inmovilización tanto
las células como las enzimas pueden ser inmovilizadas de forma permanente o
temporal para ser utilizadas repetida y continuamente en diversos procesos
químicos. Por razones técnicas y económicas la mayoría de los procesos químicos
llevados a cabo por células requieren su reutilización o el continuo uso de
biocatalizadores durante largos periodos de tiempo. Bajo esta perspectiva, la
inmovilización debería ser definida como una técnica capaz de reutilizar o dar uso
continuo de biocatalizadores y células. Por lo tanto, la sencillez y el bajo costo de
los métodos de inmovilización juegan un papel fundamental en la selección de
protocolos de inmovilización.
Es por ello que por medio de la inmovilización es posible no solo controlar la
ubicación de las células sino también modificar sus propiedades selectivamente.
Entre las principales ventajas que presentan los sistemas biotecnológicos que
utilizan células inmovilizadas se encuentra su facilidad para el manejo de una
mayor densidad celular comparado con los procesos tradicionales, un mejor
control en sistemas continuos y la posible recuperación de la biomasa para su
posterior reutilización. En general, los materiales para inmovilizar células deben
cumplir importantes requisitos como: ser grado alimenticio (según sea el caso),
bajo costo, disponibilidad, no degradables y aptos para condiciones de pH y
temperatura bajas.
Los métodos de inmovilización de células más usados son la auto floculación, la
adsorción sobre soportes y la incorporación de levaduras en matrices sólidas. La
inmovilización de microorganismo en soportes naturales o sintéticos proporciona
estabilidad a las funciones celulares. La inmovilización también puede
proporcionar condiciones favorables a la diferenciación celular y la comunicación
de célula a célula, alentando así la producción de altos rendimientos de
metabolitos secundarios. La inmovilización puede proteger las células y de esta
manera disminuir los problemas relacionada con las fuerzas de cizallamiento.
 CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES

Tabla 1: Métodos de inmovilización celular

Método Materiales

Fijación a una superficie Astillas de madera, colágeno, micro

vehículos, intercambio iónico a una
superficie resinas, óxidos metálicos

Atrapamiento dentro de matrices Cordierita, poro de vidrio, acrilamida,

porosas alginato, matrices porosas de
Colágeno, K-carragenina.

Detrás de una barrera de contención Polilisina contención, etilcelulosa,

emulsión, barrera sintética

Auto agregación Sedimentos miceliales, témpanos

microbianos, polielectrolitos, agentes
de reticulación

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS.

La inmovilización de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la
enzima en una región definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que
retienen su actividad catalítica y que pueden ser reutilizadas repetidamente.
Posteriormente esta definición se ha ampliado a aquel proceso por el cual se
restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de
enzimas, orgánulos, células, etc. por su unión a un soporte. Como ventajas del
empleo de enzimas inmovilizadas podemos destacar:
1. El aumento de la estabilidad de la enzima.
2. La posible reutilización del derivado, por lo que disminuyen los costes del
proceso.
3. La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control,
adaptado a la aplicación de la enzima inmovilizada. Los diferentes tipos de
reactores enzimáticos aparecen en la Figura 1. Estos reactores con enzimas
inmovilizadas permiten el empleo de cargas elevadas de enzima, la cual
mantendrá su actividad durante más tiempo. Estos sistemas pueden incluir el
reciclado, lo que permite la obtención de productos con mayor pureza.

Figura 1: tanque agitado.

 CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES

Las desventajas del Proceso de Inmovilización Son:

1. La alteración de la conformación de la enzima respecto de su estado nativo.

2. La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir
distintas fracciones de proteínas inmovilizadas con un diferente número de
uniones al soporte.
3. Siempre suele haber una pérdida de actividad de la enzima durante la
movilización.
4. El biocatalizador es más caro que la enzima nativa.