Anda di halaman 1dari 11

Inti dari teknologi DNA rekombinan adalah persiapan dari sejumlah besar molekul DNA identik.

Sebuah fragmen DNA yang diinginkan dihubungkan melalui ikatan 3 ′ → 5 ′ fosfodiester standar ke
sebuah molekul DNA vektor, yang dapat bereplikasi ketika dimasukkan ke dalam sel host. Ketika
sebuah molekul DNA rekombinan tunggal, yang terdiri dari vektor ditambah fragmen DNA yang
dimasukkan, dimasukkan ke dalam sel inang, DNA yang dimasukkan direproduksi bersama dengan
vektor, menghasilkan sejumlah besar molekul DNA rekombinan yang termasuk fragmen DNA yang
awalnya terkait dengan vektor. Dua jenis vektor yang paling umum digunakan: vektor E. coli plasmid
dan λ vektor bacteriophage. Plasmid vektor bereplikasi bersama dengan sel inangnya, sementara
vektor λ mereplikasi sebagai virus litik, membunuh sel inang dan mengemas DNA ke virion. Pada
bagian ini, prosedur umum untuk kloning fragmen DNA dalam plasmid E.coli dijelaskan.

Plasmid adalah molekul DNA ekstrakromosom yang bersifat self-replicating

Plasmid adalah molekul DNA sirkular ganda (dsDNA) yang terpisah dari DNA kromosom sel. DNA
ekstrachromosomal ini, yang terjadi secara alami pada bakteri, ragi, dan beberapa sel eukariotik yang
lebih tinggi, ada dalam hubungan parasit atau simbiotik dengan sel inangnya. Plasmid memiliki
rentang ukuran dari beberapa ribu pasangan basa hingga lebih dari 100 kilobase (kb). Seperti DNA
kromosom sel inang, DNA plasmid diduplikasi sebelum setiap pembelahan sel. Selama pembelahan
sel, setidaknya satu salinan DNA plasmid dipisahkan ke masing-masing sel anak, memastikan
penambahan berkelanjutan dari plasmid melalui generasi sel inang yang berkelanjutan.

Banyak plasmid alami mengandung gen yang memberikan beberapa manfaat bagi sel inang,
memenuhi bagian plasmid dari hubungan simbiotik. Sebagai contoh, beberapa plasmid bakteri
mengkoding enzim yang menginaktivasi antibiotik. Plasmid resistansi obat seperti itu telah menjadi
masalah utama dalam pengobatan sejumlah bakteri patogen umum. Ketika penggunaan antibiotik
menjadi meluas, plasmid yang mengandung beberapa gen resistensi obat berevolusi, membuat sel
inangnya resisten terhadap berbagai antibiotik yang berbeda secara bersamaan. Banyak dari plasmid
ini juga mengandung protein "transfer gen" yang dapat membentuk tabung makromolekul, atau pilus,
di mana salinan plasmid dapat ditransfer ke sel inang lain dari spesies bakteri yang sama atau terkait.
Transfer semacam itu dapat menghasilkan penyebaran cepat plasmid resistansi obat, memperluas
jumlah bakteri resisten antibiotik di lingkungan seperti rumah sakit. Mengatasi penyebaran plasmid
resistansi obat merupakan tantangan penting bagi pengobatan modern.
Plasmid E. Coli dapat dimodifikasi untuk digunakan sebagai vector cloning

Plasmid yang paling umum digunakan dalam teknologi DNA rekombinan bereplikasi dalam E. coli.
Umumnya, plasmid ini telah direkayasa untuk mengoptimalkan kegunaannya sebagai vektor dalam
kloning DNA. Misalnya, untuk menyederhanakan bekerja dengan plasmid, panjangnya diperpendek;
banyak vektor plasmid hanya ≈3kb panjangnya, yang jauh lebih pendek dari pada plasmid E. coli
yang terbentuk secara alami. (Panjang keliling plasmid biasanya disebut sebagai "panjang", meskipun
plasmid hampir selalu merupakan molekul DNA melingkar.) Sebagian besar vektor plasmid
mengandung sedikit lebih banyak dari sekuens nukleotida esensial yang diperlukan untuk
penggunaannya dalam kloning DNA: asal replikasi, gen resistensi obat, dan daerah di mana fragmen
DNA eksogen dapat disisipkan

Fig xx Diagram vektor kloning sederhana yang berasal dari plasmid,


molekul DNA beruntai ganda yang dapat bereplikasi dalam sel E. Coli

Vektor plasmid memiliki panjang ≈1,2 - 3 kb dan mengandung urutan


replikasi asal (ORI) dan gen yang memungkinkan seleksi, biasanya dengan
memberikan resistensi terhadap obat tertentu. Di sini gen selektif adalah
ampr; itu mengkodekan enzim β-laktamase, yang menginaktivasi ampisilin.
DNA eksogen dapat dimasukkan ke dalam wilayah tanda kurung tanpa
mengganggu kemampuan plasmid untuk mereplikasi atau mengekspresikan
gen ampr

Replikasi DNA plasmid

Asal replikasi (ORI) adalah urutan DNA spesifik dari 50 - 100 pasangan basa yang harus ada dalam
plasmid agar dapat bereplikasi. Enzim sel host berikatan dengan ORI, memulai replikasi plasmid
melingkar. Setelah replikasi DNA dimulai di ORI, DNA tersebut terus mengelilingi lingkaran
plasmid terlepas dari urutan nukleotida (Gambar 7xx). Jadi setiap urutan DNA yang dimasukkan ke
dalam plasmid tersebut direplikasi
bersama dengan sisa DNA plasmid;
proses ini adalah dasar kloning DNA
molekuler
Fig xx Replikasi DNA Plasmid

Untaian induk ditampilkan dengan warna biru, dan helai putri yang baru disintesis ditampilkan dalam warna merah. Segmen pendek
mewakili pasangan basis A · T dan G · C yang menghubungkan untaian komplementer. Setelah replikasi DNA dimulai pada titik asal (ORI),
ia berlanjut di kedua arah di sekitar molekul melingkar sampai garpu berkembang maju bergabung dan dua molekul anak diproduksi. Asal
adalah satu-satunya urutan nukleotida spesifik yang diperlukan untuk replikasi seluruh molekul DNA sirkular

Kloning Plasmid Mengizinkan Isolasi Fragmen DNA dari Campuran Kompleks

Sebuah fragmen DNA dari beberapa pasangan basa hingga ≈20 kb dapat dimasukkan ke dalam vektor
plasmid. Ketika plasmid rekombinan seperti itu mengubah sel E. coli, semua sel progeni resisten
antibiotik yang muncul dari sel inisial yang ditransformasikan akan mengandung plasmid dengan
urutan DNA yang sama (Gambar 7-3). DNA yang dimasukkan direplikasi bersama dengan sisa DNA
plasmid dan bersegregasi ke sel anak ketika koloni tumbuh. Dengan cara ini, fragmen awal DNA
direplikasi dalam koloni sel menjadi sejumlah besar salinan identik. Karena semua sel dalam koloni
berasal dari sel induk tunggal yang berubah, sel sel tersebut membentuk klon sel. Fragmen awal DNA
yang dimasukkan ke dalam plasmid induk disebut sebagai DNA kloning, karena dapat diisolasi dari
klon sel.

Kloning DNA memungkinkan fragmen DNA dengan sekuens nukleotida tertentu untuk diisolasi dari
campuran kompleks fragmen dengan urutan yang berbeda. Sebagai contoh sederhana, asumsikan
Anda memiliki larutan yang terdiri dari empat jenis fragmen DNA yang berbeda, masing-masing
dengan urutan yang unik (Gambar 7-4). Setiap jenis fragmen secara individual dimasukkan ke dalam
vektor plasmid. Campuran yang dihasilkan dari plasmid rekombinan diinkubasi dengan sel E. coli
dalam kondisi yang memfasilitasi transformasi; sel-sel kemudian dikultur di piring selektif antibiotik.
Karena setiap koloni yang berkembang muncul dari sel tunggal yang mengambil satu plasmid, semua
sel di koloni mempunyai tipe plasmid identik yang sesuai dengan fragmen DNA yang dimasukkan ke
dalamnya. Sebagai hasilnya, salinan fragmen DNA dalam campuran awal diisolasi dari satu sama lain
di koloni bakteri yang terpisah. Karenanya Kloning DNA adalah metode yang efektif, namun
sederhana untuk memurnikan fragmen DNA tertentu dari campuran fragmen kompleks dan
menghasilkan sejumlah besar fragmen yang menarik.
Fig 7.3 Prosedur Umumuntuk Kloning Fragmen DNA pada
vector plasmid

Meskipun tidak ditunjukkan oleh warna, plasmid berisi


replikasi origin dan gen resistensi ampisilin. Penyerapan
plasmid oleh sel E. coli dirangsang oleh konsentrasi tinggi
CaCl2. Bahkan di hadapan CaCl2, transformasi terjadi dengan
frekuensi yang cukup rendah, dan hanya beberapa sel yang
ditransformasikan oleh penggabungan molekul plasmid
tunggal. Sel yang tidak berubah mati pada media yang
mengandung ampisilin. Setelah dimasukkan ke dalam sel
inang, plasmid dapat bereplikasi secara independen dari
kromosom sel induk. Ketika sel yang berubah mengalikan
menjadi koloni, setidaknya satu plasmid mensegregasi setiap
sel anak
Fig xx Isolasi fragmen DNA dari koloni dengan cara Plasmid

Empat fragmen DNA yang berbeda, digambarkan dalam warna


yang berbeda, dimasukkan ke dalam vektor kloning plasmid,
menghasilkan campuran plasmid rekombinan yang masing-
masing mengandung fragmen DNA tunggal. Sel E. coli yang
diolah dengan CaCl2 diinkubasi dengan campuran plasmid
rekombinan dan kemudian disepuh pada nutrien agar yang
mengandung ampisilin. Setiap koloni sel resisten yang resisten
terhadap antibiotik yang tumbuh (diwakili oleh sekelompok sel)
muncul dari sel tunggal yang mengambil satu atau lebih dari
plasmid rekombinan; semua sel di koloni tertentu membawa
fragmen DNA yang sama. Inkubasi semalam E. coli pada 37 ° C
menghasilkan koloni terlihat mengandung sekitar satu juta sel.
Karena koloni dipisahkan satu sama lain pada lempeng kultur,
salinan fragmen DNA dalam campuran asli diisolasi dalam
koloni individu. Meskipun tidak ditampilkan di sini, sel yang
diubah berisi banyak salinan dari plasmid yang diberikan

Enzim Pembatasan Memotong DNA Molekul pada Sekuens Tertentu

Untuk mengkloning fragmen DNA spesifik dalam vektor plasmid, seperti yang baru saja dijelaskan,
fragmen harus dihasilkan dan kemudian dimasukkan ke dalam DNA vektor. Seperti disebutkan dalam
pendahuluan, enzim restriksi dan ligase DNA digunakan untuk menghasilkan molekul DNA
rekombinan seperti itu.

Enzim restriksi adalah enzim bakteri yang mengenali 4-8-bp sekuens yang spesifik, yang disebut
situs restriksi, dan kemudian memotong untai DNA di situs ini. Karena enzim ini memotong DNA
dalam molekul, mereka juga disebut endonuklease restriksi untuk membedakannya dari exonuklease,
yang mencerna asam nukleat dari ujungnya. Banyak situs pembatasan, seperti situs EcoRI yang
ditunjukkan pada Gambar 7-5a, adalah sekuens pengulangan terbalik; yaitu, urutan situs restriksi
adalah sama pada setiap untai DNA ketika dibaca dalam arah 5 ′ → 3 ′. Karena DNA yang diisolasi
dari organisme individual memiliki urutan tertentu, enzim restriksi memotong DNA menjadi
sekumpulan fragmen yang dapat direproduksi yang disebut fragmen restriksi.gambar 7-6
Fig 7.5 Penganalan situs restriksi- adalah sekuens DNA pendek yang dikenali dan dibelah oleh berbagai enzim restriksi endonuklease

(A) EcoRI, enzim restriksi dari E. coli, membuat potongan pada urutan pengulangan terbalik 6-bp spesifik yang ditunjukkan. Pembelahan
ini menghasilkan fragmen-fragmen dengan ujung-ujung "sticky" tunggal-stranded. Banyak enzim restriksi lain juga menghasilkan fragmen
dengan ujung yang sticky. (b) Sel bakteri dengan enzim restriksi endonuklease juga mengandung enzim modifikasi yang sesuai dengan basis
metilasi di situs pengenalan pembatasan. Misalnya, sel E. coli yang mengandung enzim restriksi EcoRI juga mengandung metilase EcoRI,
enzim modifikasi yang mengkatalisis penambahan gugus metil menjadi dua adenin dalam sekuens pengenalan EcoRI. Situs restriksi alkohol
tidak dibelah oleh EcoRI, memastikan bahwa sel yang membuat enzim restriksi ini tidak menghancurkan DNA sendiri.

Fig 7.6 Fragmen yang dihasilkan oleh pembelahan genom DNA ≈36-kb dari adenovirus 2 (Ad2) oleh EcoRI dan enzim
restriksi lain, HindIII dari Haemophilus influenzae

DNA beruntai ganda digambarkan oleh garis hitam tunggal dalam gambar ini. Pencernaan DNA Ad2 (tengah) dengan EcoRI menghasilkan
6 fragmen EcoRI (atas); hasil ini berasal dari pembelahan di setiap situs pembatasan EcoRI (GAATTC) dalam urutan Ad2. Pemotongan
dengan HindIII memotong DNA Ad2 di setiap situs HindIII (AAGCTT), menghasilkan 11 fragmen spesifik (bawah), semua berbeda dari
fragmen EcoRI. Sesuai dengan konvensi, fragmen restriksi diberi label A-Z dalam rangka penurunan ukuran. Dengan teknik yang dijelaskan
kemudian, urutan fragmen dalam DNA asli dapat ditentukan, sehingga memetakan situs pembatasan pada DNA yang tidak dipotong
(ditunjukkan oleh panah pendek). "Peta restriction-site" semacam itu untuk berbagai enzim restriksi adalah karakteristik unik dari masing-
masing DNA
Kata restriksi atas nama enzim-enzim ini mengacu pada fungsi mereka dalam bakteri dari mana
mereka diisolasi: suatu enzim restriksi endonuklease menghancurkan (membatasi) DNA asing yang
masuk (misalnya, DNA bakteriofag atau DNA yang diambil selama transformasi) dengan membelah
DNA tersebut pada situs restriksi pada DNA. Enzim lain, yang disebut enzim modifikasi, melindungi
DNA bakteri itu sendiri dari pembelahan dengan memodifikasi pada atau di dekat setiap lokasi
pembelahan potensial. Enzim modifikasi menambahkan gugus metil ke satu atau dua basa, biasanya
dalam situs pembatasan. Ketika kelompok metil hadir di sana, restriksi endonuklease dicegah untuk
memotong DNA (Gambar 7-5b). Bersama dengan restriksi endonuklease, enzim methylating
membentuk sistem modifikasi-restriksi yang melindungi DNA inang ketika menghancurkan DNA
asing. Enzim restriksi telah dimurnikan dari beberapa ratus spesies bakteri yang berbeda,
memungkinkan molekul DNA untuk dipotong pada sejumlah besar urutan yang berbeda sesuai
dengan situs pengakuan dari enzim-enzim ini.

Tabel 7.1 Enzim Endonuklease Restriksi dan Sekuens Spesifiknya

* Enzim diberi nama dengan singkatan dari strain bakteri dari mana mereka diisolasi; Angka romawi menunjukkan prioritas
enzim penemuan dalam strain tersebut (misalnya, AluI adalah enzim restriksi pertama yang diisolasi dari Arthrobacter
luteus

† Pengenalan sekuens dituliskan 5 ′ → 3 ′ (hanya satu untai yang diberikan), dengan situs pembelahan yang ditunjukkan oleh panah. Enzim
menghasilkan ujung tumpul memotong kedua helai di tempat yang ditunjukkan; ujung batang yang menghasilkan potongan tidak rata,
dengan pembelahan yang terjadi antara nukleotida yang sama di setiap untai seperti yang ditunjukkan pada Fig 7-5a

‡ Situs pembelahan untuk HphI dan HgaI terjadi beberapa nukleotida dari sekuens yang dikenali. HgaI memotong lima nukleotida 3 ′ ke
urutan GACGC pada untaian atas dan sepuluh nukleotida 5 ′ ke urutan GTGCG komplementer pada untaian bawah. HphI memotong
delapan nukleotida 3 ′ ke urutan GGTGA pada untai atas dan tujuh nukleotida 5 ′ ke urutan CCACT komplementer pada untai bawah.
Fragmen Restriksi dengan Ujung ”Sticky" Mudah mengalami Ligasi

Seperti yang diilustrasikan pada Gambar 7-5a, EcoRI membuat potongan yang tidak rata pada dua
untai DNA. Banyak enzim restriksi lain membuat potongan serupa, menghasilkan fragmen yang
memiliki "ekor" single-stranded di kedua ujungnya. Ekor pada fragmen yang dihasilkan di situs
restriksi yang diberikan adalah pelengkap untuk semua fragmen lain yang dihasilkan oleh enzim
restriksi yang sama. Pada suhu kamar, daerah-daerah beruntai tunggal ini, sering disebut "ujung
sticky," dapat secara sementara berpasangan dengan yang ada pada fragmen DNA lain yang
dihasilkan dengan enzim restriksi yang sama, terlepas dari sumber DNA. Pasangan dasar dari ujung
lengket ini memungkinkan DNA dari spesies yang sangat berbeda untuk diikat, membentuk molekul
chimeric.

Selama replikasi DNA in vivo, DNA ligase mengkatalisis pembentukan ikatan 3’ → 5 ′ fosfodiester
antara fragmen pendek untaian DNA yang disintesis secara sintetis pada garpu replikasi. Dalam
teknologi DNA rekombinan, ligase DNA yang dimurnikan digunakan untuk bergabung dengan ujung
fragmen restriksi in vitro secara kovalen. Enzim ini dapat mengkatalisis pembentukan ikatan 3’ → 5 ′
fosfodiester antara ujung 3'-hidroksil dari satu untai fragmen restriksi dan ujung 5′-fosfat dari untai
fragmen restriksi lain selama waktu ketika ujung sticky berpasangan (Gambar 7-7). Ketika DNA
ligase dan ATP ditambahkan ke solusi yang mengandung fragmen restriksi dengan ujung lengket,
fragmen restriksi secara kovalen diikat bersama melalui ikatan fosfodiester 3 ′ → 5 ′ DNA standar.

Fig 7.7 Ligasi Fragmen Restriksi dengan ujung


Sticky Komplementer

Dalam contoh ini, fragmen EcoRI dari DNA I (kiri)


dicampur dengan beberapa fragmen restriksi yang
berbeda, termasuk fragmen EcoRI, yang dihasilkan
dari DNA II (kanan). Urutan DNA singkat yang
menyusun ujung-ujung sticky dari setiap jenis
fragmen ditampilkan. Ujung sticky komplementer
pada dua jenis fragmen EcoRI, (a ′) dan (a), dapat
secara sementara berpasangan basa, sedangkan
fragmen TaqI (b) dan fragmen HindIII (c) dengan
ujung sticky nonkomplementer tidak berpasangan
ke Fragmen EcoRI. Kelompok 3′-hidroksil dan 5′-
fosfat yang berdekatan (merah) pada pecahan
berpasangan kemudian secara kovalen bergabung
(diligasi) oleh ligase DNA T4. Satu ATP
dikonsumsi untuk setiap ikatan fosfodiester (merah) terbentuk

Polylinkers Memfasilitasi Insersi dari Fragmen Restriksi Ke dalam Plasmid Vector

Enzim restriksi untuk membuat fragmen dengan sticky ends dan DNA ligase yang
menghubungkan fragmen DNA memungkinkan insersi langsung DNA ke dalam plasmid
vektor secara in vitro. Plasmid E. coli dapat dibentuk dengan sebuah polylinker, sebuah
sequencing multipel sintetis yang mengandung masing masing satu salinan situs restriksi
yang berbeda. Ketika sebuah vektor diberikan enzim restriksi yang mengenali sequens dalam
polylinkers, pemotongan akan dilakukan pada sequens tersebut, dan membentuk sticky ends.
Dengan adanya DNA ligase, fragmen DNA diproduksi dengan enzim restriksi yang akan
dimasukkan ke dalam plasmid. Rasio fragmen DNA yang dimasukkan untuk memoton DNA
vektor dan kondisi reaksi lain dipilih sampai memenuhi kapasitas maksimum insersi fragmen
tiap plasmid. Plasmid rekombinan diproduksi dalam reaksi ligasi in vitro kemudian dapat
digunakan untuk membentuk E coli yang sensitif terhadap antibiotik. Semua sel di tiap klon
resistan antibiotik yang didapat setelah seleksi plasmid dengan fragmen DNA yang sama,
namun tiap klon membawa fragmen yang berbeda.

Molekul Kecil DNA dapat Disintesis Secara Kimiawi

Kemajuan di bidang sintesis DNA membuat kita mampu untuk mensintesis molekul
satu strand DNA dari sequens manapun sampai sekitar 100 nukleotid. DNA sintesis memiliki
memiliki banyak manfaat dalam teknologi rekombinasi DNA. ssDNAs komplementer dapat
disintesis dan dihibridasi masing – masing untuk membentuk sebuah dsDNA dengan sticky
end. Sintesis kompli dsDNA dapat dikloning menjadi plasmid vektor sebagai fragmen
restriksi DNA yang disiapkan untuk organisme hidup. Sebagai contoh, sekuens 57-bp
polylinker telah disintesis secarakimiawi dan kemudian dimasukkan ke dalam plasmid vektor
untuk memfasilirasi proses kloning fragmen DNA yang dihasilkan oleh enzim restriksi lain.
DNA sintesis digunakan dalam pengurutan DNA dan sebagai probe untuk mengidentifikasi

Seperti yang dijelaskan kemudian dalam bab ini, DNA sintetis digunakan dalam pengurutan
DNA dan sebagai probe untuk mengidentifikasi klon bunga. DNA sintetis juga dapat
digantikan untuk sekuens DNA alami dalam DNA kloning untuk mempelajari efek mutasi
spesifik; topik ini diperiksa dalam Bab 8.
Teknik untuk sintesis kimia oligonukleotida DNA diuraikan pada Gambar 7.9. Perhatikan
bahwa rantai muncul dari arah 3 menuju 5, berlawanan dengan arah pertumbuhan rantai DNA
yang dikatalisis oleh DNA polimerase. Setelah prosedur kimiawi untuk memproduksi DNA
sintetis terstandard, instrumen otomatis dikembangkan sehingga memungkinkan peneliti
untuk memprogram sintesis oligonukleotida dari urutan spesifik hingga sekitar 100
nukleotida panjang.

KESIMPULAN
 Dalam kloning DNA, molekul DNA rekombinan terbentuk secara in vitro dengan
memasukkan fragmen DNA ke dalam molekul DNA vektor. Molekul DNA
rekombinan kemudian dimasukkan ke dalam host, di mana mereka akan bereplikasi,
dan menghasilkan sejumlah besar molekul DNA rekombinan yang mencakup fragmen
DNA yang awalnya terkait dengan vektor.
 Vektor yang paling sering digunakan adalah plasmid E. coli, yaitu rantai molekul
DNA yang melingkar yang mencakup tiga wilayah fungsional: (1) asal replikasi, (2)
gen resistensi obat, dan (3) daerah di mana DNA dapat disisipkan tanpa mengganggu
replikasi plasmid atau ekspresi gen resistensi obat.
 Dua enzim digunakan untuk menghasilkan plasmid rekombinan. Enzim restriksi yang
memotong DNA pada urutan 4-8-bp spesifik, sering meninggalkan ekor tunggal-
beruntai self-complementer (sticky ends). Enzim ini digunakan untuk memotong
molekul DNA panjang menjadi beberapa fragmen restriksi dan memotong vektor
plasmid di satu situs. Jika fragmen restriksi dan memotong vektor plasmid dengan
ujung komplementer dicampur di bawah kondisi yang tepat, DNA ligase akan
membentuk ikatan fosfodiester antara fragmen restriksi dan DNA vektor (lihat
Gambar 7-7).
 Ketika plasmid rekombinan diinkubasi pada sel E. coli yang pertama kali diterapi
dengan kation divalen dengan konsentrasi tinggi, fraksi yang sangat kecil dari sel
mengambil satu plasmid rekombinan tunggal. Sel-sel yang mengalami transformasi
ini, yang membawa gen resistensi obat plasmid, dapat dipilih dengan melapisi nutrien
agar yang mengandung antibiotik (lihat Gambar 7-3). Semua sel di setiap koloni yang
tumbuh di media ini mengandung plasmid identik yang diturunkan dari plasmid
tunggal yang memasuki sel pendiri koloni. Koloni terisolasi dengan demikian
mewakili klon dari fragmen restriksi yang berbeda yang semula dimasukkan ke dalam
vektor plasmid.
 Polylinkers adalah oligonukleotida sintetis yang terdiri dari satu salinan dari beberapa
situs pembatasan yang berbeda. Vektor plasmid yang mengandung polylinker hanya
akan dipotong sekali oleh beberapa enzim restriksi, masing-masing bertindak di
situsnya sendiri. Pencantuman polylinker dalam vektor plasmid memungkinkan
terjadinya kloning fragmen restriksi yang dihasilkan oleh pembelahan DNA.
 DNA beruntai tunggal yang mengandung hingga 100 nukleotida dari setiap urutan
yang diinginkan dapat disintesis secara kimia menggunakan instrumen otomatis.
Sintetis dsDNA diproduksi dengan mensintesis ssDNA komplementer dan kemudian
hibridisasi mereka.