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PRUEBAS BIOQUIMICAS CONVENCIONALES PARA BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTATIVOS

IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM POSITIVOS A TRAVÉS DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS RÁPIDAS Y


CONVENCIONALES
Los microorganismos a diferencia de las plantas no son capaces de crear materia orgánica a partir de los elementos
inorgánicos, por eso, han de nutrirse a expensa del medio en que se encuentren, y de ahí que en el interior de estos ocurran
una serie de reacciones de síntesis y de descomposición de sustancias orgánicas, las cuales, reciben el nombre de
metabolismo. A partir de las características metabólicas se realizan pruebas obtenidas para la identificación de
microorganismo y productos obtenidos de la relación microorganismo-medio; otro de los aspectos importantes de la
realización de estas pruebas, es que a partir de estas ayudan a dar una respuesta ante la posible contaminación de los
alimentos por medio de microorganismos patógenos. Las técnicas de bioquímica han proporcionado una herramienta útil
para la detección directa de los microorganismos contaminantes. La identificación bacteriana se puede realizar por medio
de una serie de análisis que necesitan de diferentes cultivos y procedimientos para llegar a identificar las especies
bacterianas que contaminan los alimentos o aguas.

Por lo cual, con el término de bacilos gramnegativos no fermentadores (BNF), se designa un heterogéneo grupo de
microorganismos que constituye, aproximadamente, el 15,0 % de todos los aislamientos en los laboratorios de microbiología
clínica, se comportan usualmente como patógenos oportunistas y, recientemente, han cobrado importancia por su elevada
incidencia en infecciones hospitalarias. La necesidad de dilucidar si se trata de una infección o una simple colonización, así
como su elevada resistencia a los antimicrobianos, convierte al aislamiento de estos agentes bacterianos en muestras
clínicas en un problema grave para los pacientes ya que compromete su recuperación de forma importante. Los BNF son
un grupo de microorganismos aerobios, no esporulados, que o bien no utilizan hidratos de carbono como fuente de energía,
o los degradan a través de vías metabólicas diferentes a la fermentación. La identificación de BNF ocasiona numerosas
dificultades en los laboratorios, ya que la mayoría de las pruebas bioquímicas corrientemente usadas para el diagnóstico
bacteriológico resultan, con frecuencia, poco útiles para estos gérmenes. La literatura reporta que las tres especies de BNF
más relevantes clínicamente son: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii y Stenotrophomonas maltophilia.
Estas tres especies son frecuentemente multirresistentes a los antibacterianos (Sánchez Roitz, et al, enero 2002). Al igual,
que los bacilos gran negativos no fermentadores, existen los cocos gran positivos, los cuales, son microorganismos que se
aíslan con mas frecuencia en muestras de pacientes y se han involucrado como agentes importantes en enfermedades
infecciosas, estos microorganismos se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza y algunos hacen parte de la
microbiota normal de la piel y mucosas del hombre y así mismo de animales. Es de vital importancia identificar estos tipos
de microorganismos tanto bacilos gran negativos y cocos gran positivos, puesto de que de ellos depende que se lleve a
cabo un buen diagnostico y procedimiento cuando se este frente a este tipo de patógenos.

OBJETIVOS

- OBJETIVO GENERAL

Desarrollar un análisis práctico sobre las pruebas bioquímicas convencionales, para la identificación de bacilos Gram-
negativos no fermentadores y los cocos Gram-positivos, a través de las rutas metabólicas, fuentes de carbono y nitrógeno
que necesita el microorganismo para sobrevivir en los medios, para así obtener un amplio conocimiento en las practicas.

- OBJETIVOS ESPECIFICOS

 Identificar las pruebas bioquímicas utilizadas para los cocos Gram-positivos y bacilos Gram-negativos no
fermentadores.
 Practicar siembras en medios de cultivos sólidos, líquidos y semisólidos.
 Interpretar los resultados que nos dan las pruebas bioquímicas para los cocos Gram-positivos y bacilos Gram-
negativos no fermentadores.

MARCO TEÓRICO

Las bacterias son microorganismos unicelulares de tipo procariótico, es decir, son organismos que solo se pueden observar
al microscopio, constituidos por una sola célula autónoma que además no tiene membrana nuclear. Las bacterias tienen
diferentes formas, tamaños, y envoltura celular bacteriana. Sus morfologías son: la de forma esférica o las llamadas cocos
o en forma de barra o llamadas bacilos, y su envoltura celular bacteriana son: las Gram-positivas y las Gram-negativas,
que se distinguen por su reacción a la tinción de Gram.

Por lo cual, para distinguirlas usaremos pruebas bioquímicas convencionales para identificar bacilos Gram-negativos no
fermentativos y cocos Gram-positivos.
Para los bacilos Gram-negativos no fermentadores utilizaremos unas pruebas bioquímicas convencionales
que son:

1. Prueba de Oxidación – Fermentación: Las bacterias pueden utilizar los carbohidratos por la vía fermentativa o por
la vía oxidativa. Las bacterias anaerobias los fermentan; las facultativas pueden fermentarlos o degradarlos
oxidativamente; las aerobias estrictas sólo pueden oxidarlos.

Para detectar si las bacterias utilizan los carbohidratos por la vía oxidativa o fermentativa se utiliza el agar OF, que
contiene agar, peptona y azul de bromotimol como indicador de pH. Inicialmente el medio es de color verde (pH 7,1)
y vira a amarillo cuando el medio se acidifica (pH de 6 a 7,6) producto de la fermentación u oxidación del carbohidrato.
Por lo cual si el tubo de oxidación "O" se torna amarillo, pero el de fermentación "F" queda verde la bacteria es una
oxidadora, no fermenta ese carbohidrato
Si el tubo "O" permanece verde y el tubo "F" se torna amarillo: la bacteria fermenta pero no oxida, es una
fermentadora, una anaerobia estricta, no oxida.
- Si ambos tubos quedan amarillos: bacteria anaerobia facultativa, oxida y fermenta el carbohidrato.

- Si ambos tubos quedan verdes: bacteria inerte, no utiliza el carbohidrato por ninguna vía metabólica.

2. Urea: En el medio de cultivo, la tripteína y la glucosa, aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos.
El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el rojo de fenol es el indicador de pH. El agar es el agente
solidificante.
Las bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa, liberan amoníaco y dióxido de carbono. Estos
productos alcalinizan el medio de cultivo haciendo virar el indicador rojo de fenol del color amarillo al rojo.
Es recomendado especialmente para la detección de la actividad ureásica en bacterias que hidrolizan lentamente la
urea ya que la fermentación de la glucosa presente activa la enzima ureasa microbiana. En los resultados: si el medio
torno color rosado significa que la prueba dio positiva y si es de color amarillo su reacción será negativa para actividad
ureasica.
3. Medio SIM (Sulfuro-Indol-Movilidad): En el medio de cultivo, la presencia de tiosulfato en el medio o la degradación
de proteínas liberando aminoácidos azufrados, algunos microorganismos forman H 2S gaseoso por medio de las
enzimas tiosulfato reductasa y cisteína desulfurasa. El gas incoloro H2S reacciona con el citrato de amonio férrico
para producir un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso metálico. El medio de cultivo tiene consistencia
semisólida por lo que la movilidad se observa por el crecimiento del microorganismo en todo el tubo, más allá de la
zona de inoculación (picadura). Los microorganismos inmóviles solo crecerán en la zona inoculada. Y para la
observación de indol, le agregamos al medio SIM reactivo de Kovac’s, si forma un anillo color cereza significa que
es indol positivo y si no forma es indol negativo.

4. Reducción de nitratos: Sirve para determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos. Para
ello, el medio manitol movilidad incorpora 1 g/l de potasio nitrato y para revelar la presencia de nitritos después de
su incubación se añaden los reactivos A y B de GriessIlosvay en cantidades iguales (1ml aprox.). Un cambio de color
(rojo) dentro de los 30 segundos indica prueba completa con resultado positivo. Si no cambia de color, se agrega
directamente al tubo una pizca (unos 20mg) de polvo de cinc puro, totalmente exento de nitratos o nitritos, y se
observa el cambio de color durante otros 30 segundos, al cabo de los cuales se realiza la interpretación final.
Además, el fundamento consiste en identificar si el microorganismo en este medio produce la enzima reductasa y
transforme los nitratos a nitritos o gas nitrógeno libre. La reducción de nitrato (NO 3-) a nitrito (NO2- ) y a nitrógeno
gaseoso (N2).

para cocos Gram-Positivos se utilizan estas pruebas que son:

1. Agar nutritivo: Medio de cultivo nutritivo no selectivo, en el cual, la pluripeptona y el extracto de carne constituyen
la fuente de carbono, nitrógeno y aportan nutrientes para el desarrollo bacteriano. El agregado de cloruro de sodio
mantiene el balance osmótico y el agar es el agente solidificante.
Puede ser suplementado con sangre ovina desfibrinada estéril para favorecer el crecimiento de microorganismos
exigentes en sus requerimientos nutricionales y permite una clara visualización de las reacciones de hemólisis.
2. Prueba de la catalasa: Pone de manifiesto la presencia del enzima catalasa en una bacteria. Esta enzima es capaz
de descomponer el peróxido de hidrógeno (agua oxigenada) en agua y oxígeno, con la consiguiente aparición de
burbujas.

3. Prueba de la coagulasa: La coagulasa es una proteína producida por varios microorganismos que permite la
conversión del fibrinógeno en fibrina. En el laboratorio, se usa para distinguir entre diferentes tipos
de Staphylococcus. Un resultado de coagulasa positivo indica que la muestra contiene Staphylococcus aureus, se
usa para diferenciar el Staphylococcus aureus de los Staphylococcus coagulasa negativos. existen 2 formas de
coagulasa (por ejemplo, coagulasa ligada y coagulasa libre). La coagulasa ligada también conocida como "factor de
Clumping " se puede detectar mediante la realización de una prueba de portaobjetos y la coagulasa libre con una
prueba de coagulasa de tubo.

4. Agar BHI: Es un medio muy rico en nutrientes, que proporciona un adecuado desarrollo microbiano. La infusión de
cerebro de ternera, la infusión de corazón vacuno y la peptona, son la fuente de carbono, nitrógeno, y vitaminas. La
glucosa es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el fosfato disódico
otorga capacidad buffer. El agar es el agente solidificante.
El agar cerebro corazón mantiene los mismos principios que el caldo para el cultivo de estreptococos y otras
bacterias exigentes. Puede ser suplementado con sangre ovina desfibrinada estéril o con sangre equina desfibrinada
estéril, permitiendo así el desarrollo de hongos de difícil crecimiento. Con el agregado de 10% de sangre de caballo
desfibrinada, fue utilizado para el crecimiento de Histoplasma capsulatum y de hongos patógenos. Por tratarse de
un medio que contiene glucosa, no es un agar sangre apropiado para la observación de reacciones de hemólisis.
Con el agregado de 20 Ul de Penicilina y 40 µg/ml de estreptomicina, se utiliza este medio para el aislamiento
selectivo de hongos patógenos.

5. Agar DNasa: En el medio de cultivo, la tripteína es la fuente de nitrógeno, aminoácidos, y aporta los nutrientes
necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano. El ácido desoxirribonucleico (DNA), se encuentra en grado
altamente polimerizado, y es el sustrato de la enzima desoxirribonucleasa (DNAsa), la cual lo hidroliza. El cloruro
de sodio mantiene el balance osmótico y el agar es el agente solidificante. Este, medio de cultivo, permite diferenciar
bacterias que poseen la enzima desoxirribonucleasa de aquellas que no la poseen. La presencia de la enzima, se
puede detectar mediante el agregado de ácido clorhídrico 1N. El ácido desoxirribonucleico hidrolizado presenta
transparencia, mientras que el ácido desoxirribonucleico polimerizado, precipita y torna opacidad al medio de cultivo.
Observar el crecimiento microbiano y cubrir la placa con de ácido clorhídrico 1N. Observar dentro de los primeros 5
minutos. positivo: halo claro, transparente alrededor del crecimiento bacteriano. Negativo: el medio se observa
opaco.

6. Presencia de Hemolisis con Agar sangre: Es un medio enriquecido que se utiliza además para la investigación
de los diversos tipos de hemólisis (α, ß o gamma). Se utiliza para el crecimiento de estreptococos. Para la
preparación del agar sangre se puede utilizar el agar nutritivo enriquecido con cloruro sódico o un preparado
enriquecido con otras sustancias como Columbia o el triplicase de soja. La adición de sangre a un medio de cultivo
no proporciona las sustancias que están en el interior de los hematíes, pero sí puede añadir factores inhibidores del
crecimiento bacteriano presentes en el suero. Este es un inconveniente que puede solucionarse calentando la sangre
para romper los eritrocitos y para que se destruyan las sustancias inhibidoras, que son termolábiles. La sangre
utilizada como aditivo a estos medios suele ser sangre de carnero diluida al 5%, pero en algunas ocasiones es
necesario utilizar sangre de otras especies (caballo, conejo, humana), pues facilitan las reacciones hemolíticas o
contienen determinados factores de enriquecimiento o no poseen sustancias inhibidoras del crecimiento de
determinados gérmenes.

7. Agar Manitol Salado: El agar sal manitol en una fórmula diseñada por Chapman para la diferenciación de
estafilococos positivos a la coagulasa (por ejemplo, Staphylococcus aureus) de los estafilococos negativos a la
coagulasa:

1. Este agar se utiliza para el aislamiento de estafilococos a partir de muestras clínicas,


2. de cosméticos
3. y de pruebas de límite microbiano.
4. El agar sal manitol contiene peptonas y extractos de carne bovina, que suministran los nutrientes esenciales.

Una concentración de cloruro sódico de 7,5% tiene como resultado una inhibición parcial o completa de los
organismos bacterianos diferentes de los estafilococos. La fermentación de manitol, indicada por el cambio del
indicador de rojo fenol, facilita la diferenciación de la especie de estafilococos. Los estafilococos positivos a la
coagulasa (por ejemplo, Staphylococcus aureus) producen colonias de color amarillo y un medio circundante de
color amarillo, mientras que los estafilococos negativos a la coagulasa producen colonias de color rojo y no
producen cambio de color en el indicador de rojo fenol.
RESULTADOS Y/O DISCUSIÓN

Imagen 1. TINCIÓN DE GRAM DE Pseudomonas aeruginosa

Objetivo de 100X, se observa una reacción negativa a la tinción de gram.


(bacilos gran negativos)

Imagen 2. TINCIÓN DE GRAM DE Staphylococcus aureus


Objetivo de 100X, reacción positiva a la tinción de gram con una morfología semejante a racimos de uva. (cocos gram
positivos)

Imagen 3. TINCIÓN DE GRAM DE Micrococcus


Objetivo de 100X, reacción positiva a la tinción de gram. (cocos gram positivos).

Imagen 4. PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA IDENTIFICACIÓN


Entre las pruebas bioquímicas a utilizar en esta práctica están:

1. Medio OF
A la derecha el medio fue incubado en
presencia de oxígeno, contrario a esto el de la
izquierda fue sellado con aceite estéril con lo
cual se inhibió el oxígeno creando así un
ambiente anaerobio. El microorganismo
sembrado fue
P. aeruginosa, los resultados obtenidos nos
muestran que esta bacteria oxida el hidrato de
carbono presente en el medio, pero no lo
fermenta esto se evidencia en el crecimiento
que experimento en el tubo sin aceite y su
ausencia en el tubo con aceite (ambiente
anaerobio).

2. Medio urea
En el medio Urea se determinó la actividad
ureasica por medio de la presencia de la
enzima ureasa. En este caso el
microorganismo presente en el medio es P.
aeruginosa. Se observa un color rosado pálido
en el bisel del medio lo que podría hacernos
pensar que la prueba es positiva. Según la
literatura pseudomonas aeruginosa es urea
variable. Según Koneman, la aparición de un
tinte rosado tardío y débil en la posición
inclinada del tubo hace probablemente indica
una degradación inespecífica de los
aminoácidos y debe ser leída como un
resultado negativo de la prueba.

3. Caldos nutritivos Caldos nutritivos con indicador de PH, la


diferencia entre ellos es la presencia de un
hidrato de carbono diferente (sacarosa,
glucosa, maltosa y manitol). Inicialmente los
medios eran de color rojo luego de la
incubación se tornaron amarillos como se
muestra en la foto. estos resultados nos
muestras que el microorganismo inoculado en
ellos (Staphylococcus aureus) fermenta estos
4 hidratos de carbono. Este microorganismo
tiene un metabolismo de tipo fermentativo y
anaerobio facultativo.
4. Agar DNAsa

Staphylococcus aureus es la cepa que fue


sembrada en el agar DNAsa. Luego de
incubación fue necesario agregar a las colonias
HCl 0,1N como revelador, con lo cual se
observaron zonas claras alrededor de las
colonias lo que indica que el microorganismo
tiene la enzima desoxirribonucleasa (DNAsa)
que es capaz de hidrolizar el Acido
desoxirribonucleico polimerizado que contiene
el medio.

5. Agar Manitol Medio selectivo por la alta concentración salina


y diferencial debido a la alta capacidad de
fermentación del manitol. La caja 1 tiene
crecimiento de Staphylococcus aureus y la caja
2 de Micrococcus. los Staphylococcus
coagulasa positivo fermentan el manitol y se
visualizan como colonias amarillas en este
medio, la coagulasa negativa vira a un color
rosado.
Los microorganismos que crecen en estas
altas concentraciones de sal y usan manitol
en su metabolismo producen ácidos con lo
que se modifica el pH del medio produciendo
así las coloraciones de las colonias.

6. Agar sangre
Resistencia a Novobiocina
En agar sangre se sembró Staphylococcus
aureus con el fin de observar su reacción a un
antibiótico, (la novobiocina), esto colocando en
la placa de Petri luego de la siembra
sencidiscos con este antibiótico.
Como muestra la fotografía, alrededor de los
sencidiscos se muestra un halo de inhibición
que nos permiten saber que este
microorganismo no es resistente a dicho
antibiótico.
 Hemolisis
El Staphylococcus aureus es la cepa que fue
sembrada en el agar sangre. Luego, de
terminar la siembra por estría, se procedió
hacer la previa incubación a 37 °C; después de
pasado un tiempo de 24 horas se observó
detalladamente el cultivo, en el cual, se pudo
observar que hubo Hemolisis beta (β – halo
semitransparente a las horillas del
microorganismo) a esto se le conoce como
hemolisis total.
El fundamento de la hemolisis se da por la
presencia de la enzima hemolisina la cual es la
responsable de la lisis de los glóbulos rojos por
el microorganismo.

7. Caldo BHI Inoculamos el microorganismo Staphylococcus


aureus en caldo BHI para poder revelarla
dentro de 24 horas, al pasar el tiempo,
procedemos a preparar el plasma, se realiza,
sacando 1 ml de sangre humana y lo
centrifugamos, y en tubo de ensayo,
colocamos los 0,5 ml del microorganismo
presente en el caldo BHI y 0,5 ml de plasma y
esperamos 4 horas al aire ambiente y se pudo
observar que se obtuvo una textura viscosa, es
decir, se forma un coagulo, se desarrolló todo
en el líquido y se solidifico totalmente.
8. Prueba Nitrato En la prueba de nitrito y nitrato fue necesaria la
utilización de utilización 2 tubos uno con la
presencia de la campana de Durham y el otro
sin la campana luego con ayuda de una asa
bacteriológica previamente estéril se inoculo en
cada tubo una pequeña proporción de la
bacteria pseudomonas eruginosa y llevo a
incubar a una temperatura de 37 grados por 24
horas los resultados obtenidos después de
haber pasado el tiempo estipulado fueron los
siguientes; en ambos tubos se evidencio
turbidez por lo que indica crecimiento pero en
el tubo que contenía la campana de Durham se
detectó la presencia de gas lo que indica la
reducción de nitratos a nitrógeno molecular y al
otro tubo sele agrego el reactivo de griees y se
evidencio la formación de un anillo oscuro,
basándonos en los resultados obtenidos
podemos decir que la bacteria es Positiva para
la reducción de nitrato a nitrito y que puede ser
variable para reducción de nitrato a nitrógeno
gaseoso.

SIM
El medio SIM se utiliza para diferenciar microorganismos sobre la base de la producción
de sulfuro de hidrógeno, la producción de indol y la motilidad en un entorno. los medios
semisólidos se han utilizado ampliamente en la determinación de la motilidad bacteriana,
ya que en estos se puede evidenciar de mejor manera.

Resultados
En este laboratorio sembramos Pseudomonas aeruginosa en el medio SIM, para
determinar solo la producción de indol y motilidad.

Indol Motilidad
Tenemos que el indol es un compuesto que se Para motilidad Pseudomonas aeruginosa
genera mediante la desaminación reductiva del es positiva ya que se evidencio turbidez en
triptófano y esta reacción es llevada a cabo por todo el tubo.
algunas bacterias que poseen las enzimas
denominadas triptofanasas.
Pseudomonas
aeruginosa, al agregarle unas gotas del Pseudomonas aeruginosa
reactivo de kovacs al medio dio negativo
para Indol. Esto debido que al agregarle el Indol: Negativo (-)
reactivo no se produjo un anillo de color
cereza en el medio. Motilidad: Positivo (+)

CONCLUSIÓN

En conclusión, utilizamos pruebas bioquímica para identificar los bacilos Gramnegativos no fermentadores, como por
ejemplo el microorganismo llamado Pseudomonas aeruginosa, este microbio no hidroliza la urea, a través de la prueba
urea, como puede desnitrificar y reducir nitratos a nitratos a partir de un caldo nutritivo de nitrato de potasio como fuente de
nitrógeno, este microorganismo es móvil, no produce sulfuro de Hidrogeno e indol negativo, gracias al medio llamado SIM,
y como oxidan los azucares que están presentes en el agar, a través del medio O.F. En el caso contrario, de las pruebas
para cocos Grampositivos, usamos Micrococcus y Staphylococcus aureus, que para Staphylococcus aureus, usamos la
prueba de la oxidasa que nos dio resultado negativo, usamos 2 agares Sangre para determinar si el microorganismo
presenta hemolisis y nos resultó que presenta hemolisis tipo β porque se observaron zonas claras

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