LAPORAN RESMI

PRAKTIKUM KULTUR JARINGAN

STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIUM

Disusun oleh:

ELSA NURSYAHADAH 16304244017

BAYU KHRISNA INDRIYANI 16304244018
DIAN ANDISTRI 16304244020
YOANISA AMALIA INSANI 16304244021

Kelompok 11

Pendidikan Biologi (A) 2016

JURUSAN PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI YOGYAKARTA
2019
 BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Metode kultur jaringan merupakan prosedur laboratorium aseptis yang

membutuhkan fasilitas yang unik dan keahlian khusus. Ada beberapa hal yang perlu
diperhatikan agar metode kultur jaringan dapat dilaksanakan, diantaranya adalah
laboratorium kultur jaringan tumbuhan, alat dan bahan yang diperlukan dalam metode
kultur jaringan tumbuhan, metode sterilisasi, serta pembuatan media pertumbuhan.
Laboratorium kultur jaringan hendaknya memiliki luas yang memadai agar dapat berfungsi
secara maksimal. Pengaturan ruangan laboratorium harus dapat mengakomodasi berbagai
kegiatan yang berbeda.

Selain penataan ruang laboratorium kultur jaringan, hal yang perlu diperhatikan
adalah sterilisasi. Sterilisasi adalah proses membunuh dan menghilangkan semua
mikroorganisme dan spora dalam suatu material atau objek. Tujuan utamanya adalah untuk
meminimalisir atau meniadakan potensi kontaminasi dari mikroba yang tidak diinginkan.
Metode sterilisasi yang dilakukan diupayakan berlangsung secara cepat dan dapat
meminimalkan atau menghilangkan potensi kontaminasi mikroba seefektif mungkin.

Di dalam ruangan kultur jaringan harus dalam keadaan aseptik. Bermuara dalam
kondisi yang aseptik, maka perlu dijelaskan bahwa segala aktifitas yang berkaitan dengan
jaringan harus dalam kondisi aseptik. Untuk mendapatkan ruangan dengan kondisi yang
aseptik perlu dilakukan sterilisasi pada tiap ruangan dengan ketentuan tertentu, tergantung
karakter dari masing-masing fungsi ruangan kultur jaringan tersebut. Semua jenis tanaman
yang menyebabkan diciptakannya berbagai macam media yang disesuaikan dengan jenis
tanaman yang akan dikulturkan (Hendaryono, 1994).

Media pertumbuhan dalam kultur jaringan merupakan faktor penentu dalam

perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan
jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam

2
mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar,
gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya
maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Tiga
faktor tersebut, yaitu laboratorium kultur jaringan, teknik sterilisasi, dan media
pertumbuhan untuk kultur jaringan penting diketahui sebagai pengetahuan awal untuk
menunjang pelaksanaan praktikum kultur jaringan. Oleh karena itu, pada penyusunan
laporan kali ini dibahas lebih rinci mengenai teknik sterilisasi, dan media pertumbuhan.

Pembuatan larutan stok berdasarkan pengelompokan stok makro, stok mikro, stok
Fe, stok vitamin dan stok hormon sangat diperlukan terutama bila larutan stok tidak
disimpan terlalu lama (segera digunakan habis). Stok hormon dapat disimpan antara 2-4
minggu, sedangkan stok hara dapat disimpan 4-8 minggu. Dengan adanya larutan stok,
pembuatan media selanjutnya hanya dengan teknik pengenceran dan pencampuran saja.
Oleh karena itu, praktikkan membuat larutan stok terlebih dahulu untuk efisiensi waktu.
Larutan stok yang dibuat adalah larutan stok makro dengan 2 kali konsentrasi sebanyak
200 ml.

Larutan stok merupakan larutan yang berisi satu atau lebih komponen media yang
konsentrasinya lebih tinggi daripada konsentrasi kompenen tersebut dalam formulasi
media yang akan dibuat. Larutan stok biasanya dibuat dengan konsentrasi 10, 100 atau
1000 kali lebih pekat. Jika larutan stok dibuat, pembuatan media dapat dilakukan dengan
cara mengambil sejumlah larutan stok sehingga konsentrasinya menjadi sesuai dengan
yang terdapat pada formulasi media yang dikehendaki (Yusnita, 2003).

Dalam pembuatan larutan stok, yang perlu diperhatikan adalah penyatuan beberapa
komponen media sekaligus dalam suatu larutan stok dan harus mempertimbangkan
kecocokan dan kestabilan dari sifat kimianya. Dalam larutan stok yang berisi beberapa
komponen media jangan sampai ada endapan. Hal ini erat kaitannya dengan ketersediaan
hara dalam media eksplan atau tanaman yang dikulturkan. Setelah larutan stok dibuat,
pengambilanya untuk media dapat dilakukan dengan cara memipet atau menakarnya
dengan gelas ukur (Yusnita, 2003).

Pembutan larutan stok dimaksudkan untuk memberi kemudahan pekerjaan dalam

pembutan media selanjutnya antara lain; menghemat pekerjaan menimbang bahan media

3
 setiap kali ingin membuat media, mengatasi kesulitan penimbangan dalam jumlah yang
sangat kecil, mengurangi kerusakan bahan kimia akibat terlau sering dibuka dan ditutup
(Marlin dkk, 2007).

Keberhasilan kultur jaringan ditentukan oleh media tanam dan jenis tanaman.
Campuran media yang satu mungkin cocok dengan jenis tanaman tertentu, namun tidak
cocok untuk jenis tanaman yang lain. Hal ini disebabkan karena setiap spesies tanaman dan
bagian dari tanaman mempunyai kemampuan yang tidak sama dalam mensintesa atau
merombak zat- zat yang menyusun media. Oleh karena itu tidak ada formulasi yang sesuai
untuk semua jenis tanaman yang menyebabkan diciptakannya berbagai macam media yang
disesuaikan dengan jenis tanaman yang akan dikulturkan (Hendaryono, 1994).

Biasanya setiap tanaman mempunyai kebutuhan nutrisi untuk pertumbuhannya. Inti

dari teknik kultur jaringan yaitu menyediakan nutrisi dengan media yang tepat untuk
pertumbuhan eksplan. Masa kini banyak media yang dibuat khusus untuk penyediaan
nutrisi bagi eksplan, salah satunya yaitu media MS (Murashige and Skoog) yang
merupakan media yang paling banyak digunakan untuk teknik kultur jaringan. Zat pengatur
tumbuh (ZPT) yang digunakan adalah BAP. Menurut Noggle dan Fritz (1983) BAP
memiliki struktur yang mirip dengan kinetin dan juga aktif dalam pertumbuhan dan
proliferasi kalus, sehingga BAP merupakan sitokinin yang paling aktif.

B. Tujuan

1. Untuk mengetahui teknik sterilisasi dalam kultur jaringan.

2. Untuk mengetahui cara pembuatan stok mikro.

3. Untuk mengetahui cara pembuatan stok myoinositol.

4. Untuk mengetahui cara pembuatan medium kultur jaringan tanaman.

4
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Dasar Teori

Kontaminasi merupakan salah satu faktor pembatas dalam keberhasiln pembiakan

tanaman secara kultur jaringan, hal tersebut dapat terjadi setiap saat dalam masa kultur.
Mikroorganisme (jamur, bakter atau virus) yang masuk dan berkembang biak dengan pesat
akan menyerang tanaman dalam botol kultur yang akibatnya dapat menghambat
pertumbuhan atau mematikan tanaman.

Idealnya ruangan yang digunakan untuk proses kultur jaringan tanaman bersifat
aseptik. Sehingga dibutuhkan ruangan yang sangat bersih dan udara yang kering. Beberapa
upaya untuk mencegah munculnya mikro organisme harus dilakukan selama aktifitas
kultur jaringan berlangsung. Di dalam kultur jaringan dibutuhkan ruangan yang steril
sehingga disediakan ruang khusus dan tidak tercampur atau bersentuhan langsung dengan
lingkungannya/ruang lain. Karena hal ini dapat menimbulkan kontaminan masuk ke dalam
laboratorium atau bahan kultur.

Untuk mengantisipasi hal-hal tersebut maka diperlukan sterilisasi ruangan sebagai

langkah awal dalam usaha pembiakan tanaman secara kultur jaringan. Bahan-bahan
sterilisasi dapat berupa bahan pemutih, yang dicampur dengan air, dan kemudian dipelkan
ke lantai, dan dapat dilakukan menggunakan alkohol maupun menggunakan formalin 5%.
Seluruh kegiatan kultur jaringan harus dilakukan secara aseptik. Artinya, seluruh bahan
dan alat yang digunakan harus disterilkan terlebih dahulu. Termasuk ruangan
laboratoriumnya dan pekerja yang melakukan. Sterilisasi ruangan biasanya dilakukan
dengan menyalakan lampu UV selama beberapa menit dan menyemprotkan alkohol 70%.
Sementara itu alat dan bahan yang digunakan disterilkan dengan memanaskan dalam
autoclave atau direndam larutan sodium hipoklorit (kloroks). Bagi para pekerja, sebelum
melakukan aktivitas di dalam laboratorium seluruh permukaan tubuhnya disemprot dengan
alkohol 70% (Yuliarti, 2010).

Sterilisasi adalah segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat
yang steril, yaitu di laminar air flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Sterilisasi

5
juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara
merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus
steril (Aryulina, 2004).

Sterilisasi merupakan teknik membersihkan dan membebaskan suatu benda dari

segala kehidupan mikroorganisme (protozoa, fungi, bakteri, dan virus). Sterilisasi dalam
metode kultur jaringan, meliputi sterilisasi ruangan, sterilisasi alat tanam, sterilisasi media
tanam, dan sterilisasi eksplan (Lili Sugiyarto,2018 : 6-7).

1. Sterilisasi Ruang

Salah satu ruang yang harus dijaga kesterilannya adalah ruang transfer yang
digunakan untuk inokulasi, isolasi dan subkultur. Sterilisasi ruangan dilakukan
dengan menyemprotkan alkohol 95%, dan lantai dengan kain pel yang dibasahi
dengan alkohol 95% atau phenol. Sterilisasi ini mutlak, sterilisasi dilakukan
menjelang ruang inokulasi akan digunakan. Lampu ultraviolet dapat digunakan
untuk sterilisasi ruang, dan biasanya selalu dinyalakan apabila ruang inokulasi tidak
digunakan, serta dimatikan saat masuk dalam ruang ini (Edhi Sandra, 2013).

2. Sterilisasi Alat Tanam

Sterilisasi laminar dilakukan dengan spirtus atau alkohol 70%. Permukaan

laminar sebelum mulai bekerja dibersihkan dengan tisu yang sudah dicelupkan
alkohol 70%. Laminar yang dilengkapi dengan lampu UV, sebelum digunakan juga
dinyalakan selama 1-2 jam untuk mematikan kontaminan yang ada di permukaan
laminar. Hal serupa juga dilakukan setelah selesai melakukan penanaman atau
inokulasi. Laminar harus tetap dijaga kebersihannya (Lili Sugiyarto,----: 7).

3. Sterilisasi Alat dan Media

Alat-alat logam dan gelas yang akan digunakan dalam kultur jaringan dapat
disterilkan dengan autoclave. Alat-alat gelas dan logam disterilkan dengan autoclave
pada temperatur 121°C dan tekanan 1 atm, selama 30 menit, sedangkan sterilisasi
bahan atau media kultur selama 15 menit. Alat- alat seperti pinset dan scalpel and
blade selain disterilkan dengan autoclave dapat dilakukan dengan pembakaran di atas
api bunsen. Botol-botol yang akan disterilisasi sebelumnya ditutup dengan kertas

6
 payung dan diikat dengan karet. Aquadest disterilkan seperti sterilisasi alat selama
30 menit.

4. Sterilisasi Eksplan

Eksplan adalah bagian tanaman yang akan dikulturkan. Bahan eksplan dapat
berupa organ, jaringan, maupun sel. Eksplan dari organ lebih mudah dikulturkan,
misalnya: daun, batang, akar. Metode sterilisasi setiap eksplan berbeda, tergantung
pada jenis tanamannya, bagian tanaman yang digunakan, morfologi permukaannya,
umur tanamannnya, kondisi tanamannnya (sakit atau sehat pada saat pengambilan),
musim saat pengambilan, dan lingkungan tumbuhnya. Pada prinsipnya, sterilisasi
eksplan adalah mensterilkan dari kontaminasi mikroorganisme, tanpa mematikan
eksplannya (Edhi Sandra, 2013). Beberapa jenis bahan kimia yang umum digunakan
dalam sterilisasi eksplan beserta kisaran konsentrasi dan lama waktu perendaman
sebagai berikut.

Tabe l 1. Beberapa Bahan Kimia untuk Sterilisasi Eksplan beserta Kisaran Konsentrasi
dan Lama Waktu Perendaman

Bahan kimia Konsentrasi Lama Perendaman

Kalsiummhipokorit 1-10 % 5-30 menit
Natriumhipoklorit 1-2 % 7-15 menit
Hidrogenperoksida 3-10 % 5-15 menit
Perak nitrat 1% 5-30 menit
Merkuriklorida 0,1-0,2 % 10-20 menit
Gas klorin - 60-240 menit
Betadine 10 % 5-10 menit
Benlate 2 g/L 20-30 menit
Antibiotik 50 mg/L 30-60 menit
Alkohol 70 % ½-1 menit
(Sumber: Zulkarnain, 2009: 95).

Sterilisasi eksplan dilaksanakan dengan tahap menyiapkan bahan sterilisasi, alat

sterilisasi, bahan tanaman. Penyiapan bahan tanaman dilakukan dengan cara mencuci

7
bersih pada air mengalir baigan-baigan tanaman yang akan dijadikan eksplan, sedangkan
bahan yang tidak diperlukan dibuang. Bagian yang sudah dicuci bersih lalu direndam
berturut-turut dalam fungisida dan bakterisida, yang telah diberi beberapa tetes Tween-20
atau Tween-80 selama 30-60 menit bergantung pada bagian tanaman. Kemudian dibilas
dengan air steril dan dipotong menjadi bagian-bagian yang lebih kecil yang dapat masuk
ke dalam cawan petri/gelas piala 250 mL. Bagian eksplan kemudian direndalm dalam
larutan antibiotik selama 60 menit, dan selanjutnya dilakukan dalam LAFC (Zulkarnain,
2009: 96-97). Tanaman memerlukan makanan pokok dan makanan tambahan. Nutrisi
tanaman terbagi dalam dua kategori, yakni elemen makro sebagai makanan pokok, dan
elemen mikro sebagai makanan tambahan/pelengkap (Anonim, 2013).

Pada saat memulai melakukan kegiatan kultur jaringan diperlukan ruang dan
peralatan. Ukuran ruang yang diperlukan disesuaikan dengan volume aktivitas kultur
jaringan yang dilakukan. Ruang yang diperlukan untuk kegiatan kultur jaringan, idealnya
laboratorium memiliki ruang persiapan, ruang transfer, ruang kultur. Dimana ruang
persiapan didalamnya terdapat lemari pendingin, autoclave, oven, pH meter, alat-alat gelas
standar. Didalam ruang transfer terdapat LAFC (Laminar Air Flow Cabinet) atau kotak
pindah, lemari tempat penyimpanan alat-alat steril, microwave, sedangkan di dalam ruang
kultur dilengkapi dengan rak kultur dan lampu fluorescent, AC (Air Conditioner) untuk
menjaga temperatur dan RH (Barahima, 2011).

Media kultur jaringan merupakan tempat hidup dan sumber nutrisi bagi jaringan.
Bahan-bahan media kultur jaringan terdiri dari garam-garam anorganik, sumber karbon,
vitamin, ZPT, Nitrogen organik, asam-asam makroorganik, dan substansi kompleks.
Garam-garam anorganik meliputi unsur makro dan mikro. Unsur hara makro antara lain
(N, P,K, Ca, S, Mg). Sedangkan unsur hara mikro (fe, Mn, Zn, B, Cu, Mo). Sumber karbon
yang digunakan dapat berupa sukrosa, galaktosa, fruktosa, laktosa, galaktosa, maltosa atau
pati dengan konsentrasi 2-3%. Vitamin berupa tiamin (B1), piridoksin (B6), dan asam
nikotinat, dapat juga niasin, glisin, mioinositol, sianokoba amin, asam folat, asam
askorbat, ribovlavin dll. Tiamin digunakan untuk mempercepat pembelahan sel pada
meristem akar, sebagai koenzim, dan reaksi yang menghasilkan energi. Asam nikotinat
berfungsi untuk reaksi enzimatik, sebagai prekursor dari alkaloid. Asam askorbat berfungsi

8
untuk mencegah warna coklat pada permukaan jaringan. Selain itu dalam sedia perlu
ditambahkan ZPT namun dibutuhkan dalam jumlah sedikit. Nitrogen organik dapat berupa
asam amino, glutamin, asparagin, dan adenin. Nitrogen organik dibutuhkan setelah
pembentukan kalus. Asam-asam organik dapat berupa sitrat, malat, suksinat, atau fumarat.
Penambahan asam-asam organik dibutuhkan untuk membantu pertumbuhan sel-sel pada
jaringan di media amonium sebagai sumber nitrogen. Untuk mendapatkan media padat
dibutuhkan agar-agar sebnayak 0,8-1% larutan (Any Fitriani, 2013:1-10).

Zat pengatur tumbuh adalah persenyawaan organik selain dari nutrient yang dalam
jumlah yang sedikit (1mM) dapat merangsang, menghambat, atau mengubah pola
pertumbuhan dan perkembangan tanaman (Moore, 1979 dalam Gunawan, 1992). Mio-
Inositol atau meso-insitol merupakan heksitol (gula alkohol berkarbon 6) sering digunakan
sebagai salah satu komponen media yang penting, karena terbukti merangsang
pertumbuhan jaringan yang dikulturkan (Yusnita, 2004;58).

Myo-inositol atau meso-inositol atau i-inositol digunakan dalam media untuk

memperbaiki pertumbuhan dan morfogenesis, sehingga myo-inositol dianggap sebagai
golongan vitamin untuk tanaman. Menurut Myo-inositol berperan dalam keikutsertaan
dalam lintasan biosintesa asam-D-galakturonat yang menghasilkan vitamin C dan pectin
serta kemungkinan inkorporasinya dalam fosfoinositida dan fosfatidil inositol yang
berperanan dalam pembelahan sel. Penambahan myo-inositol dengan konsentrasi antara
20-100 mg/l pertama kali ditunjukkan oleh Jacquiot dalam kultur kambium tanaman elm
(George dan Sherringtone, 1984).

Myo-inositol berpengaruh dalam morfogenesis kultur, misalnya dalam kultur

Haworthiasp. Pembentukan pucuk dalam Haworthiasp tergantung dari keberadaannya
myo-inositol (Kaul dan Sabharwal, 1972, 1975). Di alam Myoinositol ditemukan dalam air
kelapa, dan dalam jumlah kecil didalam agar dipasaran. Myo-inositol juga digunakan dalam
pembuatan media Wood & Braun dan Murashige & Skoog (George dan Sherringtone,
1984).

Kebutuhan nutrisi mineral untuk tanaman yang dikulturkan secara in-vitro pada
dasarnya sama dengan kebutuhan hara tanaman yang ditumbuhakn di tanah. Unsur-unsur
hara yang dibutuhkan tanaman di lapangan merupakan kebutuhan pokok yang harus

9
tersedia dalam media kultur jaringan. Antara lain adalah unsur hara makro dan unsur hara
mikro. Unsur-unsur hara tersebut diberikan dalam bentuk garam-garam mineral.
Komposisi media dan perkembangannya didasarkan pada pendekatan masing-masing
peneliti (Gunawan, 1992: 44). Unsur hara makro adalah hara yang dibutuhkan tanaman
dalam jumlah yang banyak. Hara makro tersebut meliputi, Nitrogen (N), Fosfor (P),
Kalium (K), Kalsium (Ca), Sulfur (S), Magnesium (Mg), dan Besi (Fe). Kegunaan unsur
hara makro tersebut dalam kultur jaringan menurut Qosim (2006:3) dalam Sukarasa
(2007:21) adalah sebagai berikut :
1. Nitrogen (N) diberikan dalam bentuk NH4NO3, NH2PO4, NH2SO4. Berfungsi untuk
membentuk protein, lemak, dan berbagai senyawa organik lain, morfogenesis
(pertumbuhan akar dan tunas), pertumbuhan dan pembentukan embrio, pembentukan
embrio zigotik dan pertumbuhan vegetatif.
2. Fosfor (P), diberikan dalam bentuk KH2PO. Berfugsi untuk metabolisme energi,
sebagai stabilitor membran sel, pengaturan metabolisme tanaman, pengaturan
produksi pati/amilum, pembentukan karbohidrat, sangat penting dalam transfer
energi, protein, dan sintesis asam amino serta konstribusi terhadap struktur dan asam
nukleat.
3. Kalium (K), diberikan dalam bentuk CaCl2.2H2. Berfungsi untuk pemanjangan sel
tanaman, memperkuat tubuh tanaman, memperlancar metabolisme dan penyerapan
makanan, ion kalsium ditransfer secara cepat menyebrangi membran sel dan
mengatur pH dan tekanan osmotik di antara sel.
4. Kalsium (Ca), diberikan dalam bentuk CaCl2.2H2O. Berfungsi untuk merangsang
bulu-bulu akar, penggandaan atau perbanyakan sel dan akar, pembentukan tabung
polen, dinding dan membran sel lebih kuat, tahan terhadap serangan patogen,
mengeraskan batang, memproduksi cadangan makanan.
5. Sulfur (S). Berfungsi dalam berbagai reaksi-reaksi reduksi oksidasi.
6. Magnesium (Mg), diberikan dalam bentuk MgSO4.7H2. Berfungsi untuk
meningkatkan kandungan fosfat, pembentukan protein.
7. Besi (Fe), diberikan dalam bentuk Fe2(SO4)3; FeSO4.7H2. Berfungsi untuk membantu
asilmilasi nitrogen.

10
 Keasaman (pH) adalah nilai yang menyatakan derajat keasaman atau kebasaan
larutan dalam air. Sel-sel tanaman yang dikembangkan dengan teknik kultur jaringan
mempunyai toleransi pH yang relatif sempit dengan titik optimal antara pH 5,0 – 6,0
(Daisy, 1994). Faktor pH dalam media juga perlu mendapat perhatian khusus, pH tesebut
harus diatur sedemikian rupa sehingga tidak mengganggu fungsi membran sel dan pH dari
sitoplasma. Pengaturan pH selain memperhatikan kepentingan beberapa fisiologi sel, juga
harus mempertimbangkan faktor-faktor: kelarutan dari garam-garam penyusun media,
pengambilan (uptake) dari zat pengatur tumbuh dan garam–garam lain, efisiensi
pembekuan agar-agar, Gamborg dan Shyluk, 1981 dalam Gunawan, 1992. Sel-sel tanaman
membutuhkan pH yang sedikit asam berkisar antara 5,5–5,8. Pengaturan pH, biasa
dilakukan dengan dengan menggunakan NaOH (atau kadang-kadang KOH) atau HCL pada
waktu semua komponen sudah dicampurkan (Gunawan, 1992).

Kultur jaringan tanaman merupakan teknik menumbuh-kembangkan bagian

tanaman, baik berupa sel, jaringan atau organ dalam kondisi aseptik secara in vitro. Teknik
ini dicirikan oleh kondisi aseptik, penggunaan media kultur buatan dengan kandungan
nutrisi lengkap dan ZPT (zat pengatur tumbuh), serta kondisi ruang kultur yang suhu dan
pencahayaannya terkontrol (Yusnita, 2003). Selain itu teknik kultur jaringan memiliki dua
kegunaan utama. Pertama adalah untuk perbanyakan cepat dalam jumlah yang banyak dan
seragam sesuai induknya, dan yang kedua untuk menghasilkan bibit-bibit baru yang unggul
dalam perbaikan tanaman (Mattjik, 2005).

Sedangkan menurut Welsh (1981) penciptaan tanaman-tanaman baru secara efisien,

murah dan bebas dari virus maupun cendawan. Keberhasilan dalam penggunaan metode in
vitro terutama disebabkan pengetahuan yang lebih baik tentang kebutuhan hara sel dan
jaringan yang dikulturkan. Hara terdiri dari komponen utama dan komponen tambahan.
Komponen utama meliputi garam mineral, sumber karbon (gula), vitamin dan pengatur
tumbuh. Komponen lain seperti senyawa nitrogen organik, berbagai asam organik,
metabolit dan ekstrak tambahan tidak mutlak, tetapi dapat menguntungkan ketahanan sel
dan perbanyakannya (Wetter dan Constabel, 1991).

11
 Media kultur jaringan adalah media tanam yang terdiri dari berbagai komposisi dan
macam unsur hara dan sebagainya. Menurut Ryugo (1988) media tanam pada kultur
jaringan berisi kombinasi dari asam amino essensial, garam-garam anorganik, vitamin-
vitamin, larutan buffer, dan sumber energi (glukosa). Media kultur jaringan merupakan
salah satu faktor penentu keberhasilan dalam perbanyakan tanaman secara in vitro
(Yusnita, 2003). Dikarenakan media merupakan faktor penting dalam penentu keberhasilan
in vitro maka menurut Rahardja (1994) untuk membuat media dengan jumlah zat seperti
yang ditentukan, diperlukan penimbangan dan penakaran bahan secara tepat.
Ketidaktepatan ukuran dapat menyebabkan terjadinya proses yang tidak dikehendaki.

Beberapa media dasar yang banyak digunakan dalam kultur jaringan antara lain
media dasar Murashige dan Skoog (1962) yang dapat digunakan untuk hampir semua jenis
kultur, media dasar B5 untuk kultur sel kedelai dan legume lainnya, media dasar White
(1934) sangat cocok untuk kultur akar tanaman tomat, media dasar Vacin dan Went (1949)
digunakan untuk kultur jaringan anggrek, media dasar Nitsch dan Nitsch (1969) digunakan
dalam kultur tepung sari (pollen) dan kultur sel, media dasar Schenk dan Hildebrandt
(1972) untuk kultur jaringan tanaman monokotil, media dasar WPM (Woody Plant
Medium, 1981) khusus untuk tanaman berkayu. Dari sekian banyak media dasar di atas,
yang paling banyak digunakan adalah media Murashige dan Skoog (MS) (Widyastuti,
2002). Keistimewaan medium MS adalah kandungan nitrat, kalium dan ammoniumnya
yang tinggi, dan jumlah hara anorganiknya yang layak untuk memenuhi kebutuhan banyak
sel tanaman dalam kultur (Wetter dan Constabel, 1991).

12
 BAB III

METODE
A. Waktu dan Tempat
Praktikum ini dilaksanakan pada Hari Jumat, 1 dan 8 Maret 2019 pukul 11.10-12.50
WIB di Labolatorium Kultur Jaringan Jurusan Pendidikan Biologi FMIPA UNY.
B. Alat dan bahan
1. Alat

Alat Tulis Pipet Tetes Solasi

Kamera Autoclave Tissue
Kranjang Botol Kultur Spatula
Pel Beker glass Kertas
Sapu pH stick Gelas ukur
Hot plate Magnetic stirer -
Magnetic stirer Botol semprot -
Timbangan analitik Alumuniumfoil -
Erlenmeyer 1000 ml Plastic warp -

2. Bahan

Aquadest Iron Stok 2,5 ml

NH4NO3 3300 mg Vitamin stok 1 ml
KNO3 3800 mg Mikronutrien stok 0,625 ml
MgSO4.7 H2O 740 mg Larutan hormon 2,4 D
KH2PO4 340 mg Agar-agar powder 7 gram
CaCl2.2H2O 880 mg Vitamin stok 0,8 ml
Larutan hormon BAP Sukrosa 20 gram
Larutan Stok Makro 25 ml
Myo Inositol 2,5 ml

13
C. Cara kerja

a. Sterilisasi Alat

Siapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Petridish, botol jam, pinset, scalpel,
kertas payung, karet gelang, plastic wrap, dan label. Pertama botol, petridish, pinset dan
scalpel direndam dengan deterjen kurang lebih 1 hari dan dibilas dengan air keran
kemudian keringkan. Selanjutnya, alat yang sudah bersih disimpan pada tempat yang
bebas debu dan dikeringkan tanpa di lap. Setelah botol kering, botol ditutup dengan
plastik, petridish dengan kertas dan dililit dengan karet gelang. Lalu, semua alat
diletakkan dalam autoklaf untuk disterilisasi selama 20 menit pada suhu 121⁰C-126⁰C
dan pada tekanan 15-20 Psi. Setelah diautoklaf, alat-alat disimpan di dalam rak inkubasi.
Untuk sterilisasi LAF digunakan alkohol 96%.

b. Larutan Stok Mikro NP

Siapkan alat dan bahan yang digunakan. Aquadest steril 300 ml dimasukkan ke dalam
erlenmeyer ukuran 1 L. Kemudian, semua bahan (MnSO₄.4H₂O, ZnSO₄.7H₂O, H₃BO₃,
KI, Na₂MoO₄.2H₂O, CoCl₂.6H₂O, dan CuSO₄.5H₂O) dimasukkan ke dalam erlenmeyer
satu per satu. Dimana bahan yang dimasukkan tersebut sebesar :

• MnSO4.4H2O 11.15mg x400= 4460 mg

• ZnSO4.7H2O 4.3 mg x400= 1720 mg

• H3BO3 3.1 mg x 100 = 1240 mg

• KI 0.415 mg x 100 = 166 mg

• Na2MoO4.2H2O 0.125 mg x 100 = 50 mg

• CoCl2.6H2O 0.0125 mg x 100 = 5 mg

• CuSO4.5H2O 0.0125 mg x 100 = 5 mg

Selanjutnya bahan-bahan tadi dimaksukkan (secara urut), dilarutkan 1 per satu

dengan cara di stirer sampai bening dan tidak ada endapan atau serbuk yang masih belum
larut. Jika 1 sudah larut, baru zat yang baru dilarutkan dengan cara yang sama. Jika semua

14
 sudah larut, tambahkan aquades sampai 500 ml. Penggunaan 400x.(500 / 400 = 1.25
ml/L).

c. Larutan Stok Myoinositol

Langkah pertama yaitu aquades 200 ml diukur dengan gelas ukur yang berukuran
100ml sebanyak 2 kali, lalu ditaruh di atas stirer. Untuk berat bubuk myoinositol itu 5x
jadi 500 mg yang dimasukkan ke aquades 200 ml. Setelah di stirer sekitar 5 menit (hingga
homogen) lalu ditutup dengan aluminium foil. Diberi label keterangan (tanggal dan kelas)
lalu dimasukkan kedalam kulkas.

d. Pembuatan Media NP

Siapkan alat dan bahan yang dibutuhkan. Siapkan aquades steril sebanyak 400 ml
yang diukur dengan gelas ukur yang dituang ke dalam labu erlenmeyer kapasitas 1000
ml, dan selanjutnya labu erlenmeyer berisi aquades tersebut ditaruh di atas hot plate dan
stirer, dan di dalamnya disertakan magnetic stirer agar saat pencampuran bahan–bahan
tersebut dapat benar–benar homogen. Setelah pemanas dan stirer dinyalakan, bahan-
bahan yang dimasukkan secara berurutan yaitu larutan makro sebanyak 40 ml, stok besi
5 ml, larutan mikro 1,25 ml (1250 µliter), vitamin NP 10 ml/liter. Lalu, berturut–turut
dimasukkan bahan–bahan yaitu mioinositol 100 mg, sukrosa 20 gram/liter. Langkah
selanjutnya, ditambahkan aquades steril hingga volume mencapai 800 ml, dan diukur pH
dengan indikator pH. Setelah diukur, apabila masih berada di pH 4, maka ditambah
dengan larutan NaOH. Karena indikator pH belum berada pada range pH antara pH 5 dan
pH 6, maka terus ditetesi sekitar total 24 tetes NaOH (dengan rincian tetesan 2 tetes, lalu
1, 3, 3, 2, 5, 5, dan terakhir 3 tetes), pH ideal untuk pembuatan media yaitu sekitar 5,7 –
5,8. Kemudian, aquades steril ditambahkan ke dalam labu erlenmeyer hingga volumenya
1000 ml.

Saat pembuatan media di atas hot plate dan stirer tersebut, labu erlenmeyer ditutup
menggunakan aluminium foil agar tetap steril. Setelah volume 1000 ml, ditambahkan
bubuk agar dengan takaran 7 gram/liter, dan ditunggu sampai mendidih. Setelah
mendidih, labu erlenmeyer berisi media NP AK tersebut diangkat, kemudian isinya dibagi
jadi dua, yaitu 250 ml pada labu erlenmeyer A untuk mengisi 24 petri NP AK, dan 750

15
 ml untuk mengisi 24 botol jam. Masing–masing petri diisi sebanyak 10 ml, dan masing–
masing botol jam diisi sebanyak 30 ml. Labu erlenmeyer dengan isi 250 ml media NP AK
disterilisasi terlebih dahulu dengan dimasukkan ke dalam autoklaf, tetapi labu erlenmeyer
yang berisi 750 ml media NP AK tidak perlu disterilisasi di dalam autoklaf, dan langsung
dituang ke dalam botol jam (masing–masing 30 ml). Setelah labu erlenmeyer berisi media
NP AK 250 ml sudah disterilisasi, segera dituang ke dalam petri, masing–masing 10 ml.
Setelah selesai proses penuangan, maka disterilisasi di dalam autoklaf selama 15 menit.

e. Pembuatan Media MS

a) Media MS AK (MS Air Kelapa untuk kultur biji)

Siapkan alat dan bahan yang digunakan. Aquadest steril 300 ml dimasukkan ke
dalam erlenmeyer ukuran 1 L. Kemudian, semua bahan (makro, iron, mikro, vitamin,
myoinositol, air kelapa) dimasukkan ke dalam erlenmeyer satu per satu. Dimana bahan
yang dimasukkan tersebut sebesar :

 Makro (40 ml/L)>> 40 : 1000 x 750 = 30 ml

Sebesar 30 ml makro dimasukkan ke dalam Erlenmeyer
 Iron (5 ml/L) >> 5 : 1000 x 750 = 3,75 ml
Sebesar 3,75 ml iron dimasukkan ke dalam Erlenmeyer
 Mikro (5 ml/L) >> 5 : 1000 x 750 = 3,75 ml
Sebesar 3,75 ml mikro dimasukkan ke dalam Erlenmeyer
 Vitamin (20 ml/L) >> 20 : 1000 x 750 = 15 ml
Sebesar 15 ml vitamin dimasukkan ke dalam Erlenmeyer
 Myoinositol (40 ml/L) >> 40 : 1000 x 750 = 30 ml
Sebesar 30 ml myoinositol dimasukkan ke dalam Erlenmeyer
 Air kelapa >> sebesar 150 ml dimasukkan ke dalam erlenmeyer

Setelah semua bahan di atas larut, lalu gula sukrosa 20 gram dimasukkan dan
dilarutkan. Kemudian aquadest steril dimasukkan sampai 750 ml. pH diatur 5,6 – 5,8
jika terlalu basa makan ditambah dengan HCL, jika terlalu asam maka ditambah
dengan NaOH. Setelah itu, agar sebanyak 7 gram dimasukkan ke dalam erlenmeyer
tersebut, lalu dipanaskan hingga mendidih. Setelah mendidih, diangkat kemudian di

16
 setrilisasi dengan autoklaf dengan temperature 121oC selama 15 menit. Lalu, dituang
ke botol jam sebanyak 30 ml dengan jumlah botol jam 24 buah di dalam ruangan LAF
(Laminar Air Flow) agar media tetap steril.
b) Media MS Petri

Siapkan alat dan bahan yang digunakan. Aquadest steril 300 ml dimasukkan ke
dalam erlenmeyer ukuran 1 L. Kemudian, semua bahan (makro, iron, mikro, vitamin,
myoinositol) dimasukkan ke dalam erlenmeyer satu per satu. Dimana bahan yang
dimasukkan tersebut sebesar :

 Makro (40 ml/L)>> 40 : 1000 x 600 = 24 ml

Sebesar 24 ml makro dimasukkan ke dalam Erlenmeyer
 Iron (5 ml/L) >> 5 : 1000 x 600 = 3 ml
Sebesar 3 ml iron dimasukkan ke dalam Erlenmeyer
 Mikro (5 ml/L) >> 5 : 1000 x 600 = 3 ml
Sebesar 3 ml mikro dimasukkan ke dalam Erlenmeyer
 Vitamin (20 ml/L) >> 20 : 1000 x 600 = 12 ml
Sebesar 12 ml vitamin dimasukkan ke dalam Erlenmeyer
 Myoinositol (40 ml/L) >> 40 : 1000 x 600 = 24 ml

Sebesar 24 ml myoinositol dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Setelah semua bahan

di atas larut, lalu gula sukrosa 20 gram dimasukkan dan dilarutkan. Kemudian
aquadest steril dimasukkan sampai 600 ml. Dari jumlah 600 ml larutan tersebut, maka
dibagi menjadi 2 (300 ml untuk MS Petri 2,4 D dan 300 m,l untuk MS Petri BAP)

f. MS + 2,4 D 1 ppm (Induksi Kalus)

Sebanyak 300 ml larutan yang telah dibuat di atas kemudian ditambahkan hormone
2,4 D sebanyak 300 μl. Lalu pH diatur 5,6–5,8 jika terlalu basa makan ditambah dengan
HCL, jika terlalu asam maka ditambah dengan NaOH. Setelah itu, agar sebanyak 7 gram
dimasukkan ke dalam erlenmeyer tersebut, lalu dipanaskan hingga mendidih.Setelah
mendidih, diangkat kemudian di setrilisasi dengan autoklaf dengan temperature 121oC

17
 selama 15 menit. Lalu,dituang ke botol jam sebanyak 10 ml dengan petri dish 30 buah di
dalam ruangan LAF (Laminar Air Flow) agar media tetap steril.

g. MS + BAP 2 ppm (Induksi Tunas)

Sebanyak 300 ml larutan yang telah dibuat di atas kemudian ditambahkan hormon
BAP sebanyak 600 μl. Lalu pH diatur 5,6–5,8 jika terlalu basa makan ditambah dengan
HCL, jika terlalu asam maka ditambah dengan NaOH. Setelah itu, agar sebanyak 7 gram
dimasukkan ke dalam erlenmeyer tersebut, lalu dipanaskan hingga mendidih. Setelah
mendidih, diangkat kemudian di setrilisasi dengan autoklaf dengan temperature 121oC
selama 15 menit. Lalu,dituang ke botol jam sebanyak 10 ml dengan petri dish 30 buah di
dalam ruangan LAF (Laminar Air Flow) agar media tetap steril.

18
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

1. Hasil Pembuatan Media NP

Hasil pembuatan media NP tidak terdapat kontaminasi pada botol jam.

2. Hasil Pembuatan Media MS 1)

Media MS AK

Gambar Keterangan
Dari 24 media MS AK terdapat 1 media
pada botol jam yang terkena
kontaminasi.

19
 2) Media MS Petri

Gambar Keterangan
Dari 30 media MS Petri 2,4 D terdapat
1 mediapada petri dishbagian pinggir
tempat penuangan dari erlenmeyer
yang terkena kontaminasi.

Dari 30 media MS Petri BAP terdapat

1 media pada petri dish bagian pinggir
tempat penuangan dari erlenmeyer
yang terkena kontaminasi.

B. Pembahasan

a. Sterilisasi Alat

Syarat utama dalam kegiatan kultur jaringan adalah kondisi yang aseptis atau steril
untuk semua komponen dalam kultur jaringan. Kegiatan kultur diawali dengan
sterilisasi alat dan bahan. Sterilisasi alat dan bahan adalah perlakuan untuk menjadikan
suatu alat atau bahan yang bebas dari mikroorganisme yang tidak diingikan seperti jamur
dan bakteri. Alat-alat yang digunakan yaitu botol kultur, cawan petri, erlenmeyer, batang
pengaduk, gelas piala, pipet serta peralatan glass ware lainnya harus bersih dan steril.
Sterilisasi alat yang dilakukan pada praktikum ini adalah menggunakan autoclave. Alat-
alat yang di sterilisasi yaitu peralatan yang berupa glass ware dan dissecting kit. glass

20
ware dan dissecting kit ini di sterilisasi dengan menggunakan autoclave pada suhu 120˚
C dengan tekanan 17,5 psi selama 30 menit karena pada tekanan ini bakteri dan jamur
yang terdapat dalam peralatan akan mati. Tidak hanya glass ware dan dissecting kit saja
yang digunakan pada praktikum kultur jaringan. Berikut adalah peralatan yang akan
digunakan pada praktikum kultur jaringan beserta fungsinya.

1. Autoclave

Autoclave merupakan alat yang digunakan untuk sterilisasi alat dan media
kultur jaringan, peralatan yang biasa di sterilisasi menggunakanautoclave adalah
glass ware dan dissecting kit. Autoclave merupakan alat yang mampu mensterilkan
bermacamp macam alat dan bahan yang digunakan dalam lingkup mikrobiologi
yakni menggunakan uap air yang bertekanan panas. Jadi autoclave adalah alat yang
digunakan untuk mensterilkan alat atau bahanp bahan yang dalam hal ini
dugunakan pada teknik kultur jaringan. Autoclave bekerja berdasarkan prinsip
tekanan panas uap air. Beberapa mikroba akan mati apabila berada pada kondisi
lingkungan panas tinggi, tetapi ada pula mikroba yang masih bisa hidup pada
kondisi lingkungan yang ekstrim seperti mampu hidup di lingkungan yang suhunya
tinggi. Autoclave digunakan pada tekanan 17,5 psi dan suhu 120°C.

2. Laminar Air Flow (LAF)

Laminar Air Flow (LAF) merupakan lemari yang digunakan sebagai tempat
ketika akan melakukan penanaman eksplan dalam kultur jaringan. Prinsip kerja dari
laminar air flow ini adalah dengan mengalirkan arus udara yang laminair ke dalam
almari penabur melalui saringan yang besar dengan ukuran mesh 0,22p0,24 mikron.
Bakteri dan jamur ditahan oleh saringan ini, sehingga udara yang masuk kedalam
laminar air flow sudah steril dan membuat ruangan menjadi steril pula.Sama seperti
peralatan yang lainnya, laminar air flow pun harus melalui tahap sterilisasi.
Laminar air flow terlebih dahulu disemprot dengan alkohol 70 % di bagian
dalamnya. Setelah sterilisasi dengan alkohol, pintu laminar air flow ditutup dan
lampu ultraviolet (UV) dinyalakan selama ½ sampai 1 jam. Setelah sterilisasi
dengan lampu ultraviolet (UV) pekerjaan dapat segera dimulai.

21
3. Botol Jam

Botol jam digunakan sebagai tempat media yang digunkanan untuk menanam
eksplan. Botol kultur ini harus dicuci hingga bersih terlebih dahulu menggunakan
detergen. Hal ini dilakukan untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang menempel
pada dinding botol guna menghindari kontaminasi.

4. Gelas Piala

Gelas piala merupakan wadah yang terbuat dari borosilikat.Gelas piala yang
digunakan untuk bahan kimia yang bersifat korosif terbuat dari PTPE. Fungsi gelas
piala pada kultur jaringan adalah untuk mengaduk, mencampur dan memanaskan
larutan yang akan digunkan untuk pembuatan media.

5. Gelas ukur

Gelas ukur adalah gelas berbentuk tabung dengan skala pada dindingnya.
Pada praktikum ini gelas ukur digunakan untuk mengukur jumlah larutan yang akan
digunakan dalam jumlah cukup banyak seperti akuades. Gelas ukur termasuk dalam
glass ware, ukuran volume gelas ukur bermacampmacam misalnya : 100 ml, 300
ml sampai 1000 ml. Gelas ukur biasanya jarang disterilkan karena penggunaannya
hanya untuk pembuatan medium saja.

6. Botol Erlenmeyer

Botol erlemeyer adalah botol berdasar lebar, botol ini terbuat dari kaca bening
yang tahan panas. Erlemeyer pada kultur jaringan dipergunakan untuk tempat dan
sarana menuangkan air suling maupun untuk tempat media dan penanaman eksplan.
Ukuran erlemeyer bermacampmacam dari volume 50 ml, 100 ml, 200 ml, 250 ml,
sampai 2 liter.

7. Cawan Petri

Cawan petri atau petridish adalah jenis gelas piala yang dibutuhkan dalam
kultur jaringan untuk memotong eksplan yang akan ditanam pada media. Cawan
petri biasanya disterilisasi bersama dengan kertas saring di dalamnya tetapi

22
 sebelumnya cawan petri ini harus dicuci bersih kemudian dikeringkan dan setelah
kering dibungkus dengan kertas payung coklat untuk disterilisasi dengan autoclave.

8. Bunsen Lampu

Spirtus atau bunsen digunakan untuk sterilisasi dissecting kit(scalpel dan

pinset) di dalam laminar air flow pada saat penanaman atau subpculture. Sterilisasi
dengan menggunakan bunsen ini dengan cara mencelupkandissecting kit kedalam
alkohol kemudian dibakar diatas api bunsen.
9. Pipet Tetes

Pipet tetes (drop pipette) berfungsi membantu memindahkan cairan dari

wadah yang satu ke wadah yang lain dalam jumlah yang sangat kecil tetes demi
tetes. Pipet tetes ini memiliki ketelitian yang kurang dalam memindahkan larutan
karena hanya dapat digunakan dengan perkiraan.

10. Pinset

Dalam kultur jaringan pinset digunakan untuk memegang atau mengambil

irisan eksplan atau untuk menanam eksplan. Teknik penanaman eksplan harus
diusahakan agar ujung pinset tidak mengenai media supaya tidak terkontaminasi.

11. Scalpel

Scalpel atau pisau dalam kultur jaringan digunakan untuk mengiris atau
memotong eksplan. Scalpel ini termasuk dalam peralatan yang masuk kategori
dissecting kit. Sebelum digunkan scalpel harus disterilisasi di dalamautoclave dan
dengan di flamir yaitu scalpel dicelupkan dalam alkohol kemudian dibakar di atas
api Bunsen.

12. Alumunium Foil dan Seal

Alumunium foil digunakan sebagai penutup botol kultur. Aluminium foil

dipotong persegi dan ukuran potongan aluminium foil dibuat sedemikian rupa
sehingga aluminium foil tersebut menutupi bagian terbuka dari botol kultur sampai
2 inchi ke bawah pada tepi botol kultur atau wadah lainnya. Dan untuk lebih

23
 merapatkan penutupan dapat dipakai seal. Aluminium foil ini tahan panas sehingga
saat dipanaskan dalam autoclave pun tidak masalah.

13. Magnetik Stirrer dan Hot Plate

Magnetic stirrer digunakan untuk menghomogenkan larutan media yang akan

dibuat nantinya. Magnet pengaduk ini nantinya akan berputar pada dasar botol
dimana magnet akan menempel karena adanya gaya tarik menarik magnet.
Kecepatan putaran dapat diatur sesuai keinginan.Ada beberapa jenis magnetic
stirrer yang dilengkapi dengan hot plate yang bisa digunakan untuk memanaskan.

14. Kertas

PayungKertas payung berguna untuk membungkus peralatan seperti

dissecting kit saat di sterilisasi di dalam autoclave.

Selain peralatanpperalatan tersebut ada pula peralatanpperalatan lain yang

digunakan dalam kegiatan kultur jaringan, seperti spatula untuk mengaduk larutan
secara manual saat pembuatan media, rak kultur untuk menempatkan botol kultur baik
setelah sterilisasi maupun yang sudah berisi media dan eksplan, tisu untuk
membersihkan atau mengelap botol yang basah, serta sarung tangan untuk membungkus
tangan dan masker yang digunakan untuk menutupi mulut agar tidak terjadi kontaminasi
pada media maupun eksplan yang ditanam.

b. Larutan stok Mikro NP dan Myoinositol

Larutan stok merupakan larutan yang berisi satu atau lebih komponen media yang
konsentrasinya lebih tinggi daripada konsentrasi kompenen tersebut dalam formulasi
media yang akan dibuat. Larutan stok biasanya dibuat dengan konsentrasi 10, 100 atau
1000 kali lebih pekat. Jika larutan stok dibuat, pembuatan media dapat dilakukan dengan
cara mengambil sejumlah larutan stok sehingga konsentrasinya menjadi sesuai dengan
yang terdapat pada formulasi media yang dikehendaki.
Pembuatan larutan stok dimaksudkan untuk memberi kemudahan pekerjaan dalam
pembuatan media salanjutnya antara lain,menghemat pekerjaan menimbang bahan
media setiap kali ingin membuat media, mengatasi kesulitan penimbangan dalam jumlah

24
 yang sangat kecil. Lalu mengurangi kerusakan bahan kimia akibat terlalu sering dibuka
dan ditutup (Marlin 2012).
Dalam pembuatan larutan stok yang perlu diperhatikan adalah penyatuan beberapa
komponen media sekaligus dalam suatu larutan stok dan harus mempertimbangkan
kecocokan dan kestabilan dari sifat kimianya, oleh karena itu itu pencampuran larutan
stok harus satu per satu dan volume yang dicampurkan harus sesuai, dalam larutan stok
yang berisi beberapa komponen media jangan sampai ada endapan. Untuk menjaga agar
larutan stok yang mengandung besi, botol yang telah diisi oleh larutan stok harus
dilapisi dengan aluminium foil agar larutan tersebut terjaga dari sinar matahari yang ada
dan menjaganya agar tidak cepatrusak. Penyimpanan larutan stok harus sesuai dan tidak
boleh pada ruangan yang terkena sinar matahari langsung untuk menjaga kualitas dari
larutan stok tersebut.
Unsur hara mikro adalah hara yang dibutuhkan dalam jumlah yang sedikit. Unsur
hara mikro ini merupakan komponen sel tanaman yang penting dalam proses fisiologi
lainnya (Gunawan, 2001). Unsur mikro, terdiri dari boron (B), cobalt (Co), tembaga
(Cu), Iodium (I), besi (Fe), mangan (Mn), molybdenum (Mo) dan seng (Zn). Sedangkan
Myoinositol merupakan molekul penting dalam memproduksi dinding sel. Umumnya
tumbuhan memiliki dinding sel primer dan sekunder yang terdiri dari
polisakarida,protein dan lignin. Myoinositol sangat dibutuhkan dalam pertumbuhan dan
perkembangan tanaman, serta banyak digunakan dalam pembuatan media kultur in vitro
sehingga dapat meningkatkan pertumbuhan. Myoinositol merupakan senyawa
karbohidrat meskipun bukan merupakan gula pada umumnya (Barnejee et al.,2007).
Karbohidrat selain sebagai bahan baku yang menghasilkan energi untuk proses respirasi
juga sebagai bahan pembentukan sel-sel baru,dalam konsentrasi yang tepat dapat
merangsang petumbuhan tunas. Pertambahan jumlah disebabkan terjadinya proses
pembelahan sel pada meristem pucuk ,selanjutnya diikuti oleh proses pemanjangan dan
pembesaran sel.
c. Pembuatan Media NP dan Media MS (MS AK dan MS Petri)
Media kultur merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan. Media kultur
merupakan komponen faktor lingkungan yang menyediakan unsur pertumbuhan
tanaman seperti unsure hara makro, unsure hara mikro, karbohidrat, vitamin dan zat

25
pengatur tumbuh, garam-garam organic, persenyawaan komplek alamiah, arang aktif
dan bahan pemadat. Pada praktikum pembuatan media kali ini yakni membuat media
NP dan media MS (MS AK dan MS Petri (MS Petri 2,4 D dan MS Petri BAP).
Pada umumnya komposisi utama media tanam kultur jaringan, terdiri dari hormon
(zat pengatur tumbuh) dan sejumlah unsur yang biasanya terdapat di dalam tanah yang
dikelompokkan ke dalam unsur makro dan unsur mikro. Hasil yang lebih baik akan
dapat kita peroleh bila, kedalam media tersebut, ditambahkan vitamin, asam amino, dan
hormon, bahan pemadat media (agar), glukosa dalam bentuk gula maupun sukrosa, air
destilata (akuades), dan bahan organik tambahan (Gunawan, 1992).
Penambahan sukrosa digunakan sebagai sumber energi dalam media kultur, karena
umumnya bagian tanaman atau eksplan yang dikulturkan tidak autotrof dan mempunyai
laju fotosintesis yang rendah. Oleh sebab itu tanaman kultur jaringan membutuhkan
karbohidrat yang cukup sebagai sumber energi. Menurut Gautheret dalam Gunawan
(1992), sukrosa adalah sumber karbohidrat penghasil energi yang terbaik melebihi
glukosa, maltosa, rafinosa.Namun jika tidak terdapat sukrosa, sumber karbohidrat
tersebut dapat digantikan dengan gula pasir. Gula pasir cukup memenuhi syarat untuk
mendukung pertumbuhan kultur. Selain sebagai sumber energi, gula juga berfungsi
sebagai tekanan osmotik media.Sedangkan untuk medium NP0 digunakan untuk
menabur biji anggrek pada praktikum selanjutnya.
Pada praktikum yang telah di laksanakan dilakukan penambahan NaOH untuk
mencapai pH netral setelah semua bahan tercampur rata pada pembuatan medium.
Menurut Gamborg dan Shyluk (1981) dalam Gunawan (1992), sel-sel tanaman
membutuhkan pH yang sedikit asam berkisar antara 5,5–5,8. Pengaturan pH, biasa
dilakukan dengan dengan menggunakan NaOH (atau kadang-kadang KOH) atau HCL
pada waktu semua komponen sudah dicampurkan.
Faktor pH dalam media juga perlu mendapat perhatian khusus.pH tesebut harus
diatur sedemikian rupa, hal ini ditujukan agar tidak mengganggu fungsi membran sel
dan pH dari sitoplasma, sehingga media yang dibuat sesuai dengan kondisi yang menjadi
syarat untuk tumbuhnya eksplan dalam kultur jaringan. Selain itu, jika pH lebih tinggi
dari 6.0, media mungkin menjadi terlalu keras dan jika pH kurang dari 5.2, agar tidak

26
dapat memadat. Pengaturan pH selain memperhatikan kepentingan beberapa fisiologi
sel, juga harus mempertimbangkan faktor-faktor:

- Kelarutan dari garam-garam penyusun media.

- Pengambilan (uptake) dari zat pengatur tumbuh dan garam – garam lain.

- Efisiensi pembekuan agar-agar.

Bahan pemadat media yang digunakan adalah agar-agar.Agar-agar adalah

campuran polisakarida yang diperoleh dari beberapa spesies algae.Dalam analisa unsur,
diperoleh data bahwa agar-agar mengandung sedikit unsur Ca, Mg, K, dan Na (Debergh,
1982 dalam Gunawan, 1992).Agar ditambahkan pada larutanharus dalam takaran yang
tepat, karena, konsentrasiagar yang terlalu tinggi dapat mengurangi difusi persenyawaan
dari dan ke arah eksplan sehingga pengambilan hara dan zat tumbuh berkurang,
sedangkan zat penghambat dari eksplan tetap berkumpul di sekitar eksplan. Smith
(1992) menyatakan pemilihan media kultur jaringan merupakan kunci sukses dalam
kultur jaringan. Hal ini menyebabkan banyak diadakan penelitian untuk memodifikasi
media-media yang memberikan respon berbeda terhadap berbagai macam tanaman.
Sumber karbon merupakan salah satu faktor yang sangat penting untuk menentukan
keberhasilan kultur jaringan selain kombinasi zat tumbuh (ZPT). Zat pengatur tumbuh
adalah persenyawaan organik selain dari nutrient yang dalam jumlah yang sedikit (1
mM) dapat merangsang, menghambat, atau mengubah pola pertumbuhan dan
perkembangan tanaman (Moore, 1979 dalam Gunawan, 1992).Mio-Inositol atau meso-
insitol merupakan heksitol (gula alkohol berkarbon 6) sering digunakan sebagai salah
satu komponen media yang penting, karena terbukti merangsang pertumbuhan jaringan
yang dikulturkan (Yusnita, 2004 : 58).

Myoinositol atau meso-inositol atau i-inositoldigunakan dalam media untuk

memperbaiki pertumbuhan dan morfogenesis, sehingga myo-inositol dianggap sebagai
golongan vitamin untuk tanaman. MenurutMyo-inositolberperan dalam keikutsertaan
dalam lintasan biosintesa asam-D-galakturonat yang menghasilkan vitamin C dan pectin
serta kemungkinan inkorporasinya dalam fosfoinositida dan fosfatidil inositol yang
berperanan dalam pembelahan sel. Penambahan myo-inositol dengan konsentrasi antara

27
20-100 mg/l pertama kali ditunjukkan oleh Jacquiot dalam kultur kambium tanaman
elm (George dan Sherringtone, 1984).
Myoinositol berpengaruh dalam morfogenesis kultur, misalnya dalam
kulturHaworthiasp. Pembentukan pucuk dalamHaworthiasp.tergantung dari
keberadaannya myo-inositol (Kaul dan Sabharwal, 1972, 1975). Di alam Myo-inositol
ditemukan dalam air kelapa, dan dalam jumlah kecil didalamagardipasaran.Myoinositol
juga digunakan dalam pembuatan media Wood & Braun dan Murashige & Skoog
(George dan Sherringtone, 1984).

Berdasarkan hasil pengamatan selama 1 minggu setelah pembuatan media NP dan

MS dapat diketahui jika media NP tidak terdapat kontaminasi.Sedangkan pada media
MS AK (air kelapa) dan MS Petri terdapat kontaminasi. Dimana pada media MS AK
(air kelapa) terdapat kontaminasi berupa jamur di bagian pinggir botol jam
dimungkinkan pada saat penuangan media ke dalam botol jam tidak dekat dengan lampu
Bunsen sehingga terjadi kontaminasi. Sedangkan pada media MS Petri terjadi
kontaminasi pada MS Petri 2,4 D dan MS Petri BAP, dimana keduanya mengalami
kontaminasi berupa jamur pada bagian pinggir dekat dengan tempat dituangkan media
dari tabung Erlenmeyer ke petri dish. Sehingga dimungkinkan kontaminasi itu terjadi
akibat mulut tabung Erlenmeyer menempel pada petri dish ketika media MS
dituang.Seharusnya pada saat penuangan media di dalam ruangan LAF mulut tabung
Erlenmeyer tidak boleh menempel pada petri dish ataupun botol jam.

28
 BAB V

PENUTUP

A. Kesimpulan

Dari hasil pengamatan pada praktikum kali ini, maka dapat disimpulkan bahwa:

1. Teknik sterilisasi

Syarat utama dalam kegiatan kultur jaringan adalah kondisi yang aseptis atau
steril. Alat-alat yang digunakan yaitu botol kultur, cawan petri, erlenmeyer, batang
pengaduk, gelas piala, pipet serta peralatan glass ware lainnya harus bersih dan
steril.Alat yang digunakan adalah autoclave. Alat-alat yang di sterilisasi yaitu
peralatan yang berupa glass ware dan dissecting kit pada suhu 120˚ C dengan tekanan
17,5 psi selama 30 menit.

2. Pembuatan larutan stok mikro

Larutan stok biasanya dibuat dengan konsentrasi 10, 100 atau 1000 kali lebih
pekat. Jika larutan stok dibuat, pembuatan media dapat dilakukan dengan cara
mengambil sejumlah larutan stok sehingga konsentrasinya menjadi sesuai dengan
yang terdapat pada formulasi media yang dikehendaki. Dalam pembuatan larutan
stok yang perlu diperhatikan adalah penyatuan beberapa komponen media sekaligus
dalam suatu larutan stok dan harus mempertimbangkan kecocokan dan kestabilan
dari sifat kimianya. Untuk menjaga agar larutan stok yang mengandung besi, botol
yang telah diisi oleh larutan stok harus dilapisi dengan aluminium foil agar larutan
tersebut terjaga dari sinar matahari yang ada dan menjaganya agar tidak cepat rusak.
3. Larutan myoinositol

Myoinositol atau meso-inositol atau i-inositoldigunakan dalam media untuk

memperbaiki pertumbuhan dan morfogenesis, sehingga myo-inositol dianggap
sebagai golongan vitamin untuk tanaman. Myoinositol berperan dalam keikutsertaan
dalam lintasan biosintesa asam-D-galakturonat yang menghasilkan vitamin C dan
pectin serta kemungkinan inkorporasinya dalam fosfoinositida dan fosfatidil inositol

29
 yang berperanan dalam pembelahan sel. Di alam Myoinositol ditemukan dalam air
kelapa, dan dalam jumlah kecil didalam agar dipasaran.

4. Media kultur

Media kultur merupakan komponen faktor lingkungan yang menyediakan

unsure pertumbuhan tanaman seperti unsure hara makro, unsur hara mikro,
karbohidrat, vitamin dan zat pengatur tumbuh, param-garam organic, persenyawaan
komplek alamiah, arang aktif dan bahan pemadat. Apabila larutan media pH-nya
rendah kurang dari 5.8 maka ditambah NaOh, dan apabila pH nya lebih dari 6.0 maka
ditambahkan KCl. Pada praktikum ini, media kultur yang dibuat yaitu media NP dan
MS. Dalam proses pembuatan media kultur harus benar-benar diperhatikan tingkat
sterilitas dan kebutuhan atau jumlah komponen penyusun media kultur.

30
 Daftar Pustaka

Aryulina, D., dkk. 2004. Biologi SMA/MA. Jakarta: Erlangga.

Barahima, Abbas. 2011. Prinsip Dasar Teknik Kultur Jaringan. Bandung: Alfabeta.

Edhi Sandra .2013. Cara Mudah Memahami dan Menguasai Kultur Jaringan. Bogor: IPB
Press.

George, E. T and P. O. Sherington. 1984. Plant Popagation by Tissue Culture Handbook

And Directory Comercil Collaboration. Exogetis Ltd, England.

Gunawan, L.W. 1992. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. Bogor: Institut Pertanian
Bogor.

Hendaryono, D.P.S dan A. Wijayani. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Jogyakarta :

Kanisius.

Lili Sugiyarto.2018. Pengenalan Laboratorium Kultur Jaringan. Yogyakarta: Jurdik

Biologi FMIPA UNY.

Marlin, Yulian, dan Hermansyah. 2012. Inisiasi Kalus Embriogenik Pada Kultur Jantung

Pisang “Curup” Dengan Pemberian Sukrosa, BAP dan 2,4-D. Jurnal Agrivigor.
11(2) : 276-284.

Mattjik, N. A. 2005. Peran kultur Jaringan Dalam Perbaikan Tanaman. Bogor: FPIPB.

Noggle, G.R and Frits, G.J. 1983. Introduction Plant Physiology, Second Edition.New
Jersey: Prentice Hall, Inc, Englewood Clifts.

Yuliarti, Nurheti. 2010. Kultur Jaringan Skala Rumah Tangga.ANDI : Yogyakarta

Yusnita, 2003. Kultur Jaringan Cara Memperbanyak Tanaman Secara Efisien.

Tangerang : P.T Agromedia Pustaka.

Zulkarnain.2009. Kultur Jaringan Tanaman. Jakarta: Bumi Aksara.

31
 Lampiran

1. Sterilisasi alat

Memotong kertas payung. Membungkus petridish Memberi label pada setiap

dengan kertas payung. bungkus petridish.

Membungkus botol jam Memasukkan botol jam dan Otoklaf selama 15 menit
dengan plastik dan diikat patridish yang telah dengan suhu 121⁰C.
dengan karet. dibungkus ke ketanjang
otoklaf.

32
 2. Larutan stok dan
pembuatan media

Saat menambahkan bahan untuk Saat menyampurkan bahan Larutan Myoinositol.

media MS. sampai homogen.

Larutan stok Mikro Larutan stok Iron Larutan stok Makro

33
Larutan stok Vitamin Saat membuat Media MS Petri Media MS Petri + 2,4 D

Media MS Petri + BAP Media MS AK Saat membuat Media NP

34