Anda di halaman 1dari 37

PENUNTUN PRAKTIKUM

PENGUJIAN BAHAN FARMASI

Tim Penyusun:

Arsyik Ibrahim, S.Si., M.Si., Apt


M. Arifudin, S.Si., M.Si., Apt.
Viriyanata Wijaya, S.Farm., M.Farm., Apt.
Akhmad Jaizzur Rijai, S.Farm., M.Si., Apt
PROGRAM STUDI SARJANA (S1) FARMASI
LABORATORIUM KIMIA FARMASI
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS MULAWARMAN
2019

KATA PENGANTAR

Buku penuntun ini disusun agar para praktikan dapat lebih memahami
maksud serta cara-cara praktikum yang akan dilakukan, maka setiap praktikan
sebelum acara praktikum dimulai harus mengikuti membaca penuntun ini.
Praktikum Pengujian Bahan Farmasi pada Program Studi strata satu (S1)
Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Mulawarman, diberikan dalam 1 mata
kuliah yang terintegrasi dengan mata kuliah teori 2 sks yang disajikan pada
semester genap setiap semester.
Praktikum Pengujian Bahan Farmasi dimaksudkan memberikan
mahasiswa suatu keterampilan tentang dasar-dasar yang diperlukan untuk
mengetahui dan memahami pengujian bioaktivitas ekstrak dari bahan alam
hayati serta cara menganalisis hasil praktikum dan menarik kesimpulan dari
pengujian tersebut.
Praktikum ini diharapkan dapat menjadi modal dasar pengetahuan bagi
mahasiswa dalam rangka persiapan pemilihan judul penelitian khususnya kepada
mereka yang memiliki keinginan penelitian di bidang pengujian bioaktivitas
bahan farmasi.

Samarinda, Februari 2019

Penyusun

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 2


DAFTAR ISI

i
SAMPUL.....................................................................................................................
KATA
ii
PENGANTAR......................................................................................................
iii
DAFTAR ISI..................................................................................................................
I. PENGUJIAN TOKSISITAS EKSTRAK BAHAN METODE BRINE SHRIMP LETHALITY
TEST.....................................................................................................................……...
1
II. PENGUJIAN ANTIOKSIDAN EKSTRAK BAHAN ALAM METODE
SPEKTROFOTOMETRI…………………………………………………………..…………………………………...
III. PENGUJIAN ANTIMITOSIS EKSTRAK BAHAN ALAM TERHADAP PEMBELAHAN SEL
6
TELUR BABI ………
IV. PENGUJIAN AKTIVITAS IMUNOGLOBULIN M (IgM) EKSTRAK BAHAN ALAM (UJI
MITOSIS SEL) …………..
10
V. UJI BIOAKTIVITAS ANTIMIKROBA EKSTRAK BAHAN ALAM DENGAN METODE
SKRINING DAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)
BIOAUTOGRAFI...............................................................................................................
14
VI. PENGUJIAN AKTIVITAS MUCOLITIK EKSTRAK BAHAN ALAM MENGGUNAKAN MUCUS
USUS SAPI.......................................................................................................................
LAMPIRAN..............................................................................................................................

19

24

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 3


28

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 4


PRAKTIKUM I
PENGUJIAN TOKSISITAS EKSTRAK BAHAN ALAM
METODE BRINE SHRIMP LETHALITY TEST (BSLT)

A. TEORI UMUM
Uji toksisitas sebagai skrining awal dapat dilakukan dengan berbagai
metode antara lain adalah metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Metode
BSLT adalah suatu metode uji guna menentukan toksisitas suatu senyawa bahan
alam dengan cepat, murah dan cukup akurat untuk penapisan ekstrak bahan aktif
dengan menggunakan hewan uji Artemia salina Leach. yang berumur 48 jam.
Metode BSLT juga digunakan untuk mendeteksi kebeadaan senyawa
toksik dalam proses isolasi senyawa dari bahan alam yang berefek sitotoksik
dengan menentukan harga LC50 dari senyawa aktif. Metode BSLT dapat
digunakan untuk berbagai sistem uji seperti: uji pestisida, mikotoksin, polutan,
anastetik, komponen seperti morfin, karsinogenik dan ketoksikan dari hewan dan
tumbuhan laut serta senyawa beracun dari tumbuhan darat.
Metode ini kemudian berkembang menjadi salah satu skrining awal
metode bioassay dalam rangka mencari dan mengisolasi senyawa aktif termasuk
antikanker yang terdapat dalam suatu ekstrak tanaman atau hewan. Pembuktian
kebenaran metode ini adalah telah dilakukannya uji BSLT dari beberapa obat
antikanker yang sudah digunakan secara klinik seperti podofilotoksin (Mayer,
1982) dan adriamisin (Gu, 1995), (Carballo,2002) juga melaporkan bahwa
terdapat korelasi yang baik antara metode BSLT dengan uji sitotoksik
menggunkan kultur sel kanker.

B. TUJUAN PERCOBAAN
Untuk menentukan Median Lethal Concentration (LC50) dari ekstrak
bahan alam terhadap larva dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)
terhadap larva udang (Artemia Salina Leach).

C. KEGUNAAN PERCOBAAN DALAM ILMU KEFARMASIAN


Percobaan ini merupakan percobaan pendahuluan dalam rangka
menemukan senyawa sitotoksik yang diharapkan dalam perkembangan
selanjutnya dapat digunakan sebagai obat antikanker.

D. HUBUNGAN PERCOBAAN DENGAN MATERI KULIAH TEORI


Pengetahuan mengenai toksisitas suatu bahan kimia disimpulkan dengan
mempelajari efek-efek dari pemaparan bahan kimia terhadap hewan percobaan,

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 5


pemapaaran bahan kimia terhadap organisme tingkat rendah seperti bakteri dan
kultur sel-sel dan mamalia di laboratorium dan pemaparan bahan kimia terhadap
manusia.
Untuk skrining dan fraksionasi fisiologi aktif dari ekstrak tanaman dapat
dilakukan uji standar toksisitas akut (jangka pendek). Suatu metode yang
digunakan secara luas dalam penelitian bahan alam untuk maksud tersebut adalah
Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). BSLT merupakan suatu cara yang cepat dan
murah untuk uji aktivitas farmakologi dan ekstrak tanaman dengan menggunakan
hewan laut yaitu larva udang Artemia Salina Leach.
Uji aktivitas BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) berhubungan dengan
materi kuliah pengujian bahan farmasi dengan menggunakan teknologi bahan
alam yang memberi pengetahuan tentang bahan alam sebagai bahan baku obat
(metabolit primer dan metabolit sekunder) dan kontrol kualitas bahan alam.

E. METODE PRAKTIKUM
1. Alat dan Bahan
Alat-Alat yang digunakan : Aerator, Erlenmeyer, Gelas ukur, Keranjang, Mikro
pipet 1, 10, 50, 100, 1000 µl, Pipet tetes, Seperangkat alat penetas larva : (Toples,
Plastik, karet, selang plastik), Timbangan analitik, Seperangkat alat penerangan :
lampu 40 atau 60 watt, Statif, dan Vial/flakon
Bahan – bahan yang digunakan : Air laut, Aquadest, Larva udang (Artemia
salina Leach), Makanan ikan atau ragi Saccharomices cereviceae, Pelarut organik
: etanol 98 %, Sampel uji : obat / ekstrak

2. Prosedur Kerja
a. Penyiapan Larva Udang
Telur udang (Artemia salina Leach) sebanyak 0,5 atau 1 gram
direndam dalam wadah penetasan yang berisi air laut 1 liter pada kondisi pH 7-
8 dibawah cahaya lampu pijar 40 atau 60 watt pada suhu kamar (25 oC), yang
dilengkapi dengan aerator (jarak sinar lampu dengan wadah penetasan ± 20
cm). Telur akan menetas selama 24 jam menjadi larva. Setelah larva berumur
48 jam larva udang siap diujikan.
b. Pembuatan Konsentrasi Sampel
1) Sampel Uji Ekstrak
a) Ekstrak ditimbang sebanyak 50 mg. Kemudian dilarutkan dalam pelarut
organik yang sesuai sebanyak 10 ml, sehingga diperoleh konsentrasi 5
mg/ml sebagai larutan stok.
b) Stok dipipet masing-masing 1 µl, 10 µl, 100 µl dan 1000 µl dengan mikro
pipet, dimasukkan ke dalam vial-vial. Masing-masing konsentrasi dibuat 5
replikasi.

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 6


c) Dibuat satu kontrol negatif untuk semua konsentrasi uji dengan
konsentrasi 1000 µg/ml (v/v) menggunakan pelarut organik yang
digunakan.
d) Larutan sampel uji dan kontrol kemudian diuapkan hingga pelarut
menguap sempurna pada suhu kamar (pelarut dikatakan telah menguap
sempurna jika tidak berbau pelarut lagi).
e) Kemudian ditambahkan air laut sebanyak 5 ml, sehingga diperoleh
konsentrasi 1 µg/ml, 10 µg/ml, 100 µg/ml, 1000 µg/ml.
c. Sampel Obat
Sampel obat yang ditimbang adalah dosis maksimumnya, kemudian
dilarutkan dengan pelarut yang sesuai (yang dapat melarutkan sampel uji).
Dibuat pula kontrol negatif. Konsentrasi sampel uji dan kontrol, pembuatan
dan perlakuannya seperti cara pembuatan dan perlakuan sampel uji ekstrak
(no. 1 di atas).
d. Pengujian Aktivitas
a) Larva udang (Artemia salina Leach) sebanyak 10 ekor dimasukkan ke
dalam masing-masing vial yang berisi ekstrak/sampel obat uji.
b) Ke dalam vial-vial tersebut dimasukkan 1 tetes makanan ikan/ragi
sebanyak 3 mg/5 ml air laut sebagai pakan.
c) Vial-vial uji kemudian disimpan di tempat yang cukup mendapat sinar
lampu.
d) Setelah 24 jam diamati jumlah larva yang mati pada masing-masing vial.
e) Catat jumlah larva yang mati.
f) Hitung LC50 dengan menggunakan Analisa Probit atau Analisis Reed-
Muench

3. TABEL PENGAMATAN
a) Analisis Probit
Jumlah mati pada konsentrasi sampel (ppm)
Replikasi Sampel
a µg/ml b µg/ml c µg/ml d µg/ml
1
2
3
Total penghambatan
% penghambatan
Harga Probit

Log Konsentrasi (X) Harga Probit (Y)


m µg/ml Q
n µg/ml R

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 7


o µg/ml S
p µg/ml T

b) Analisis Reed-Muench
Mortalita
Rasio mati :
Konsent Log Jumlah Terakumulasi s
total
rasi Konsentrasi (%)
(%) (%) Mat Hidu Terakumulas Rasio x
Mati (x) Hidup (y)
i p i x:(x+y) 100
KE1 k+l+m+n+
F K F
o
KE2 G L f+g l+m+n+o
KE3 H M f+g+h m+n+o
KE4 I N f+g+h+i n+o
KE5 f+g+h+i+
J O O
j
Untuk mendapatkan nilai LC50 dan LC90, analisis data menggunakan rumus:
50%− 𝛼 90%− 𝛼 𝑘
ℎ= dan ℎ= 𝑖 = 𝑙𝑜𝑔
𝑏− 𝛼 𝑏− 𝛼 𝑠

g= hxI

y = g + log s

LC50 dan LC90 = log y

Keterangan :
h = Jarak proporsi
i = Logaritma pertambahan konsentrasi
a = Presentase kematian lebih kecil dari 90%
b = Presentase kematian lebih besar dari 90%
k = Konsentrasi yang lebih besar dari 90% kematian
s = konsentrasi yang lebih kecil dari 90% kematian
g = Hasil kali jarak proporsi dengan logaritma pertambahan dosis
y = Persamaan

4. SOAL-SOAL
a. Soal Pre-test
1. Uraikan prosedur kerja praktikum dengan menggunakan skema kerja?
2. Buatlah perhitungan pembuatan konsentrasi yang digunakan dalam
praktikum?

b. Soal Post-test

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 8


1. Uraikan cara kerja yang anda lakukan pada pengujian aktivitas BSLT?
2. Uraikan kegunaan atau fungsi dari air laut, aquadest, larva udang, dan
ragi yang diberikan?
3. Uraikan fungsi teknik atau cara kerja yang digunakan setiap percobaan:
a. Perlunya penyiapan larva udang
b. Dilakukan pembuatan konsentrasi sampel
c. Dilakukannya pengujian aktivitas
4. Hitunglah LC50 dari masing-masing konsentrasi yang diujikan dengan
analisis probit dan Reed and Muench?
5. Apa perbedaan dari analisis probit dan analisis Reed and Muench dalam
menghasilkan data pengujian berupa LC50?
6. Jelaskan mengapa perbedaan tersebut terjadi pada hasil analisis dalam
data pengujian yang sama?
7. Simpulkan hasil percobaan yang diperoleh yang disesuaikan dengan
tujuan percobaan?

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 9


PRAKTIKUM II
PENGUJIAN ANTIOKSIDAN EKSTRAK BAHAN ALAM
METODE SPEKTROFOTOMETRI

A. TEORI UMUM
Perubahan pola konsumsi makanan sebagai dampak dari kemajuan sains
dan teknologi menyebabkan semakin meningkatnya masyarakat yang menderita
penyakit degeneratif seperti liver, hepatitis, jantung koroner, hipertensi, kanker,
diabetes dan aterosklerosis. Pada dasarnya penyakit degeneratif tersebut
diakibatkan karena proses metabolisme tubuh yang menghasilkan radikal bebas
berlebihan sehingga mengakibatkan kerusakan pada fungsi sel-sel tubuh (Helliwel
dan Gutteridge, 1989).
Senyawa radikal bebas tersebut timbul akibat berbagai proses kimia
kompleks dalam tubuh, berupa hasil sampingan dari proses oksidasi atau
pembakaran sel yang berlangsung pada waktu bernapas, metabolisme sel,
olahraga yang berlebihan, peradangan atau ketika tubuh terpapar polusi
lingkungan seperti asap kendaraan bermotor, asap rokok, bahan pencemar, dan
radiasi matahari. Makanan tertentu seperti makanan cepat saji (fastfood), makanan
kemasan, makanan kalengan juga berpotensi meninggalkan racun dalam tubuh
karena kandungan lemak, pengawet serta sumber radikal bebas. Tubuh
memerlukan antioksidan yang dapat membantu melindungi tubuh dari serangan
radikal bebas dengan meredam dampak negatif senyawa ini (Indrayana, 2008).
Antioksidan adalah senyawa kimia yang dapat menyumbangkan satu atau
lebih elektron kepada radikal bebas, sehingga radikal bebas tersebut dapat
diredam (Ilham dan Sunardi).

B. TUJUAN PERCOBAAN
Mengetahui aktivitas antioksidan ekstrak bahan alam terhadap uji
perendaman radikal DPPH (2,2-Diphenyl-1-Picrylhidrazyl) berdasarkan nilai IC50.

C. KEGUNAAN PERCOBAAN DALAM ILMU KEFARMASIAN


Percobaan ini dilakukan untuk menentukan aktivitas antioksidan senyawa
tertentu atau ekstrak bahan alam secara cepat, mudah, dan sensitif dengan

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 10


menghitung nilai IC50 dalam rangka pengembangan selanjutnya dibuat menjadi
produk-produk farmasi.

D. HUBUNGAN PERCOBAAN DENGAN MATERI KULIAH TEORI


Percobaan ini berhubungan dengan pengujian bahan farmasi terutama
dalam bidang kimia farmasi. Percobaan ini menggunakan instrumen farmasi untuk
pengujian aktivitas antioksidan. Instrumen farmasi yang digunakan dapat
menentukan panjang gelombang maksimum suatu senyawa dan penetapan
absorbansi senyawa.

E. METODE PRAKTIKUM
1. ALAT DAN BAHAN
Alat –alat yang dibutuhkan : wadah kaca (toples kaca, timbangan analitik, gelas kimia,
labu takar, pipet mikro, pipet volume, pipet tentukur (gondok) dan lain-lain.
Bahan – bahan yang dibutuhkan : ekstrak bahan alam, aquadest, methanol, Vitamin C,
Tissue, Kertas label dan lain-lain.
2. PROSEDUR KERJA
a) Penentuan aktivitas antioksidan ekstrak
1) Pembuatan larutan induk
Kristal DPPH ditimbang sebanyak 4 mg untuk dilarutkan dalam 100
mL metanol didalam labu ukur gelap atau labu ukur cokelat, diperoleh larutan
DPPH konsentrasi 0,004 % atau 40 ppm (part per million) yang digunakan
pada pengujian. Larutan disimpan pada tempat tertutup rapat dan terlindung
dari cahaya.
2) Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum DPPH
Dipipet sebanyak 2 mL larutan DPPH 0,004 % dan ditambahkan
dengan 2 mL metanol. Setelah dibiarkan selama 30 menit di tempat gelap
serapan larutan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang
gelombang 515 - 520 nm untuk mendapatkan panjang gelombang maksimum.
3) Pembuatan seri konsentrasi ekstrak, dan kontrol positif
Dibuat larutan stok dengan konsentrasi 1000 ppm (10 mg ekstrak
kering dilarutkan dengan metanol hingga 10 mL). Selanjutnya dibuat derek
konsentrasi uji dengan teknik pengenceran (misalnya 20, 30, 40, 50 dan 60
ppm dst). Masing-masing konsentrasi dilakukan 3 (kali) ulangan pengukuran.
Disiapkan larutan kontrol negatif yaitu larutan DPPH dan metanol (tanpa
penambahan ekstrak) dan larutan kontrol positif vitamin C dengan 5 (lima)
seri konsentrasi, yaitu 1,2; 1,6; 2; 2,4 dan 2,8 ppm.
4) Uji antioksidan
1. Disiapkan larutan sampel uji, dan larutan kontrol
2. Dipipet 2 mL dari masing-masing larutan uji, ditambah 2 mL larutan
DPPH 40 ppm.

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 11


3. Campuran tersebut dihomogenkan dan dibiarkan pada suhu kamar di
tempat gelap selama 30 menit
4. Dilakukan pengukuran absorbansi masing-masing konsentrasi sampel uji
pada panjang gelombang maksimum.
5. Dihitung persen (%) inhibisi (peredaman) menggunakan rumus :
% Aktivitas Antioksidan =
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝐾𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 – 𝐴𝑏𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑆𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
x 100%
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝐾𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙
6. Hitung nilai konsentrasi penghambatan sampel uji (IC50)

3. TABEL PENGAMATAN
Nilai antioksidan dianalisis dengan regresi linear. Tabel Penentuan Nilai
IC50 sebagai berikut :
Tabel Penentuan Nilai IC50
Konsentrasi Absorbansi Sampel Persamaan Regresi
% AA (y)
Ekstrak (x) 1 2 3 Rata-rata Linier
K1
K2
K3 y = bx + a
K4
K5

Data yang diperoleh selanjutnya dianalisis metode regresi dengan


menghubungkan konsentrasi ekstrak (x) terhadap % aktivitas antioksidan (y),
maka didapat nilai intersep (a) dan slop (b), serta resultan (r). Kemudian nilai a
dan b tersebut dimasukkan ke dalam persamaan garis regresi linier berikut :
y = bx + a
Nilai IC50 dapat diperoleh dengan memasukkan nilai y = 50 ke dalam persamaan
di atas dan nilai x dinyatakan sebagai nilai IC50 ekstrak.

4) SOAL-SOAL
a. Soal Pre-test
1. Uraikan prosedur kerja praktikum dengan menggunakan skema kerja?
2. Buatlah perhitungan pembuatan konsentrasi yang digunakan dalam
praktikum?

b. Soal Post-test
1. Uraikan prosedur kerja yang anda lakukan pada pengujian aktivitas
antioksidan menggunakan spektrofotometri.

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 12


2. Uraikan kegunaan atau fungsi dari DPPH, metanol, aquades, dan vitamin
C.
3. Uraikan fungsi teknik atau cara kerja yang digunakan setiap percobaan:
a. Pembuatan larutan induk
b. Penentuan panjang gelombang maksimum
c. Pembuatan seri konsentrasi ekstrak dan kontrol positif
d. Pengujian aktivitas antioksidan
4. Hitunglah IC50 dari masing-masing konsentrasi yang diperoleh dari
ekstrak dan kontrol positif.
5. Jelaskan fungsi dari nilai IC50 yang diperoleh dan hubungannya dengan
kekuatan aktivitas antioksidan!
6. Jelaskan mengapa digunakan metode analisis regresi linear dalam
menentukan IC50!
7. Simpulkan hasil percobaan yang diperoleh yang disesuaikan dengan
tujuan percobaan!

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 13


PRAKTIKUM III
PENGUJIAN ANTIMITOSIS EKSTRAK BAHAN ALAM
TERHADAP AKTIVITAS PEMBELAHAN SEL TELUR BULU BABI

A. TEORI UMUM
Bioassay merupakan metode pengujian aktivitas suatu senyawa dari bahan
alam maupun sintetik menggunakan mahluk hidup. Bioassay terdiri dari banyak
metode diataranya yaitu uji toksisitas, uji antimitotik, uji daya hambat, dll.
Berdasarkan hasil bioassay tersebut dapat dilakukan isolasi senyawa alam atau
disebut Bioassay Guided Isolation), (Mayer, B.N, 1982)
Antimitosis disebut juga inhibitor mitotik atau antimikrotubular
merupakan senyawa obat yang menghambat pertumbuhan sel dengan cara
menghentikan pembelahan sel. Banyak bahan obat antikanker yang telah diisolasi
dari sumber alamiah, khususnya dari mikroorganisme dan tumbuhan. Zat
antimitosis ini bekerja dengan menghambat pembelahan sel pada metaphase
(tingkat kedua dari mitosis), jadi merintangi pembelahan inti dengan mencegah
masuknya belahan kromosom ke dalam anak inti.
Inhibitor mitotik, aktivitasnya terutama disebabkan karena efeknya
terhadap protein mikrotubular sehingga terjadi penghentian metaphase dan
inhibisi mitosis, (Sudoyo A.W., 2006). Beberapa antimitosis yang secara klinis
merupakan obat antikanker penting termasuk alkaloid Vinca (vinblastin,
vinkristin, dan vinorelbin) yang diperoleh dari Vinca rosea, Podofilin (serta
derivatnya etoposida dan tenoposida) yang diperoleh dari tanaman Podophyllum
pellatum dan obat dari kelompok taxaoida (peclitaxel dan docetaxel), yang
diperoleh dari kulit pohon cemara Taxus brevifolia (Tjay, HT, 2002).

B. TUJUAN PERCOBAAN
Untuk mengetahui aktivitas antimitosis dari sampel uji terhadap
pembelahan sel pada proses pembuahan

C. KEGUNAAN PERCOBAAN DALAM ILMU KEFARMASIAN


Percobaan ini dilakukan untuk memperoleh data aktivitas antimitosis
sampel uji yang menunjukkan kemampuan sitotoksik sebagai dasar untuk
menunjang pengembangan penelitian pemanfaatan bahan alam yang berpotensi
dalam bidang farmakologi dan mikrobiologi khususnya sebagai antikanker.

D. HUBUNGAN PERCOBAAN DENGAN MATERI KULIAH TEORI

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 14


Uji aktivitas antimitosis berhubungan dengan materi kuliah pengujian
bahan farmasi khususnya di bidang farmakologi dan mikrobiologi yang akan
memberi pengetahuan tentang bahan alam sebagai bahan baku obat (metabolit
primer dan metabolit sekunder) dan aktivitas bahan baku sebagai sitotoksik yang
menjadi awal penelitian antikanker.

E. METODE PRAKTIKUM
1. ALAT DAN BAHAN PRAKTIKUM
Alat-alat yang dibutuhkan : aerator, aquarium, seperangkat alat ekstraksi,
batang pengaduk, corong pisah, erlenmeyer, gelas kimia, gelas ukur, magnetik
stirrer, mikroskop kamera, objek glass, sentrifuge, vortex mixer, mikropipet, oven,
timbangan analitik, tabung eppendorf, vial.
Bahan-bahan yang dibutuhkan : Ekstrak bahan alam, Aqua destilata, Air laut
bebas protozoa, beberapa pelarut organik (metanol, heksan, etil asetat), DMSO
(dimetil sulfoksida), baku antikanker (vinkristin).

2. PROSEDUR KERJA
1. Penyiapan sampel dan Pengolahan sampel
Sampel berupa ekstrak kasar atau fraksi ekstrak dari tumbuhan disiapkan,
selanjutnya dibuat deretan konsentrasi uji menggunakan pelarut aguadest (jika
larut) atau dimetil sulfoksida (DMSO).

2. Uji Aktivitas dengan Metode Uji Antimitosis Sel Telur Bulu babi
a) Penyiapan Sel Telur dan Sperma Bulu babi
Bulu babi jantan dan betina diinduksi dengan menyuntikkan 1 ml KCL
10% ke dalam bagian gonad. Sperma yang berwarna putih susu dan sel telur yang
berwarna kuning keemasan masing-masing ditampung pada gelas kimia yang
berbeda (dapat dimasukkan dalam lemari pendingin bila tidak langsung
digunakan). Fertilisasi dilakukan dengan cara 1 ml sperma dan 4 ml sel telur
difertilkan dalam gelas kimia yang berisi 50 ml air laut bebas protozoa selama 30
menit.
b) Pelaksanaan Uji
1. Ditimbang ekstrak uji sebanyak 5 mg, ditambahkan 20 µL dimethyl
sulfoksida, kemudian dicukupkan dengan air laut hingga 5 mL dan diperoleh
konsentrasi 1 mg/mL sebagai stok.
2. Dari larutan stok ini dipipet masing-masing : 1 µL, 10 µL, dan 100 µL ke
3. Dalam tabung eppendorf yang masing-masing telah berisi 899 µL, 890 µL,
dan 800 µL air laut bebas protozoa.
4. Masing- masing tabung pada no. 2 di atas ditambahkan zygot sebanyak 100
µL yang diperoleh setelah 30 menit terjadi fertilisasi dan diperoleh konsentrasi
1, 10, dan 100 µg/mL.

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 15


5. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali tiap sampel uji dan kontrol.
6. Campuran sampel uji didiamkan selama 2 -3 jam, selanjutnya diambil sedikit
dan diletakkan di atas objek glass dan ditutup cover glass dan diamati dengan
mikroskop sesuai pembesaran yang diinginkan
7. Kontrol negatif menggunakan 1000 µL air laut, dan DMSO dengan
konsentrasi 10 µL/mL air laut.
8. Kontrol positif menggunakan bahan baku obat antikanker dengan konsentrasi
0,01 µg/mL, 0,1 µg/mL dan 1 µg/ml yang dilarutkan menggunakan Aquadest.
9. Dihitung prosentase jumlah sel yang mengalami penghambatan pembelahan
dari masing-masing konsentrasi uji, dengan rumus (lihat lampiran )
10. Dihitung nilai probit (y) sebenarnya dari masing-masing konsentrasi uji
menggunakan Rumus (lihat lampiran)
11. Dihitung nilai IC50 menggunakan persamaan regresi linear

3. TABEL PENGAMATAN
Data yang diperoleh dari hasil pengamatan dihitung Inhibit concentration
(IC) 50 %, dan diolah menggunakan analisis probit.
Jumlah
Log. Nilai
Kont. Sel Tidak Total Prosentase
Konst Probit a b
Uji Membela Sel (%)
(x) (y)
h

a ppm 1

x ppm
N
ke n

4. SOAL-SOAL
a. Soal Pre-test
1. Uraikan prosedur kerja praktikum dengan menggunakan skema kerja?
2. Buatlah perhitungan pembuatan konsentrasi yang digunakan dalam
praktikum?

b. Soal Post-test
1. Uraikan prosedur kerja yang anda lakukan pada pengujian aktivitas
antimitosis?
2. Uraikan kegunaan atau fungsi dari air laut bebas protozoa, aquades,
DMSO dan KCl 10%?
3. Uraikan fungsi teknik atau cara kerja yang digunakan setiap percobaan:
a. Pembuatan seri konsentrasi pada sampel
b. Penyiapan sel telur dan sel sperma dari bulu babi

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 16


c. Dilakukannya pengujian aktivitas antimitosis
4. Hitunglah IC50 dari masing-masing konsentrasi yang diujikan dengan
analisis probit?
5. Jelaskan mengapa digunakan analisis probit dalam menentukan IC50?
6. Jelaskan fungsi dan arti dari nilai IC50 dandalam hasil pengujian
aktivitas antimitosis?
7. Simpulkan hasil percobaan yang diperoleh yang disesuaikan dengan
tujuan percobaan?

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 17


PRAKTIKUM IV
PENGUJIAN AKTIVITAS IMUNOGLOBIN M (IgM)
EKSTRAK BAHAN ALAM

A. TEORI UMUM
Imunoglobulin adalah glikoprotein yang diproduksi oleh sel plasma (sel B)
yang dihasilkan dalam bentuk fraksi globulin y pada serum, yang mampu
menetralkan sejumlah mikroorganisme penyebab infeksi. Molekul ini dibentuk
oleh sel B dalam 2 bentuk yang berbeda yaitu sebagai reseptor permukaan untuk
antigen dan sebagai statisti yang disekresikan ke dalam cairan ekstraseluler.
Antibodi yang disekresikan dapat berfungsi sebagai adaptor yang mengikat
antigen melalui binding site-nya yang spesifik sekaligus merupakan jembatan
yang menghubungkan antigen dengan sel-sel sistem imun atau mengaktivasi
komplemen. Antibodi yang terbentuk sebagai reaksi terhadap salah satu jenis
antigen mempunyai susunan asam amino yang berbeda dengan statisti yang
dibentuk terhadap antigen lain dan masing-masing hanya terikat pada statisti yang
relevan.
Klasifikasi immunoglobulin dalam serum manusia terdiri atas 5 kelas
utama yaitu IgG, IgM, IgA, IgD dan IgE. IgG adalah immunoglobulin mayor, hal
ini ditunjukkan dengan jumlahnya yang lebih besar dan tersusun dari gobulin Y.
IgG adalah satu – satunya immunoglobulin yang dapat melewati plasenta. IgM
adalah sebuah statisti yang memiliki berat molekul terbesar dibandingkan kelas
imunoglobulin yang lain. IgM merupakan tipe immunoglobulin yang paling
banyak dan seringkali tidak eksklusif, disekresi selama respon primer statisti. IgA
adalah immunoglobulin yang banyak ditemukan dalam cairan sekret statisti itu
sering disebut immunoglobulin sekretoris. IgD adalah immunoglobulin dengan
kadar yang rendah dalam sirkulasi. Peran bologiknya sebagai statisti dalam reaksi
hipersensitifitas terhadap penisilin. IgE ditemukan dalam serum dengan kadar
yang rendah dan mengikat pada penyakit alergi asma. IgE merupakan
immunoglobulin dengan jumlah yang paling sedikit dalam serum tetapi efeknya
sangat efisien.

B. TUJUAN PERCOBAAN
Untuk memperoleh data aktivitas immunoglobulin M (IgM) sampel uji
dengan mengamati pengenceran tertinggi dari serum darah mencit yang masih
dapat mengaglutinasi sel darah merah domba.

C. KEGUNAAN PERCOBAAN DALAM ILMU KEFARMASIAN


Dapat menjadi acuan bagi farmasi veteriner dalam menciptakan suatu
produk obat imunostimulan dari suatu ekstrak bahan alam.

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 18


D. HUBUNGAN PERCOBAAN DENGAN MATERI KULIAH TEORI
Percobaan ini berhubungan dengan pengujian bahan farmasi terutama
pemanfaatan bahan alam yang menggunakan teknologi bahan alam dan
penggunaan hewan coba sebagai obyek.

E. METODE PRAKTIKUM
1. ALAT DAN BAHAN PRAKTIKUM
Alat-alat yang dibutuhkan : Seperangkat alat ekstraksi, gelas kimia, gelas ukur,
labu tentukur, needle, spoit injeksi, pengaduk elektrik, sumur mikrotitrasi (Wheel
plate 96 lubang), Sentrifuga, Timbangan analitik, timbangan gram O’haus,
Timbangan hewan.
Bahan-bahan yang dibutuhkan : Air suling, pelarut statisti, betadin, ekstrak
sampel uji, kapas, Larutan koloidal Na.CMC 1%, hewan uji mencit jantan, Sel
Darah Merah Domba (SDMD) 2%, v/v, larutan PBS (Phosphat Buffered Saline).

2. CARA KERJA
1. Disiapkan alat dan bahan praktikum
2. Dibua larutan koloidal Na. CMC 1 %
3. Dibuat larutan/ suspensi ekstrak uji dengan berbagai tingkat konsentrasi uji
4. Dibuat suspensi sel darah merah domba (SDMD) (lihat cara pembuatan)
5. Dibuat dapar Phosfat (lihat cara pembuatan)
6. Disiapkan hewan uji
7. Perlakuan dan pengujian aktivitas immunoglobulin terhadap hewan uji

1. PENYIAPAN BAHAN PRAKTIKUM


a. Pembuatan Larutan Koloidal NaCMC 1 % b/v
Sebanyak 1 gram Na.CMC dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam
wadah berisi 50 ml air suling panas (70oC) sambil diaduk dengan pengaduk
elektrik hingga terbentuk larutan koloidal dan cukupkan volumenya hingga
100 ml dengan air suling.
b. Penyiapan Suspensi Sel Darah Merah Domba (SDMD) 2 % v/v.
1) Ditampung darah domba dalam tabung bersih dan kering yang berisi
serbuk EDTA sebagai antikoagulan. Untuk 1 ml darah domba, diperlukan
1 mg EDTA.
2) Dipisahkan SDMD dari plasmanya dengan cara disentrifuga 1500 rpm.
3) Selanjutnya SDM dicuci dengan menambahkan PBS (Phosphat Buffered
Saline) dalam jumlah besar dan tabung berisi statisti tersebut dibolak
balik beberapa kali dan disentrifuga kembali.

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 19


4) Pencucian dilakukan paling sedikit 3 kali. Selanjutnya, PBS dibuang dan
diperoleh SDMD 100%. Kemudian ke dalam SDMD 100% ditambahkan
PBS dengan volume sama banyak, hingga diperoleh SDMD 50%.
5) Disiapkan antigen yang akan digunakan dengan mengencerkan 0,4 ml
statisti SDMD 50% dengan 9,6 Ml PBS sehingga diperoleh 10 Ml statisti
antigen (SDMD 2% v/v).
c. Penyiapan Phosphat Buffered Saline (PBS)
PBS disiapkan dengan terlebih dahulu membuat larutan A yaitu
larutan NaH2PO4 1,38 g/L dan NaCl 8,3 g/L; dan larutan B yaitu larutan
NaH2PO4 1,42 g/L dan NaCl 8,5 g/L. Selanjutnya 280 ml larutan A
ditambahkan pada 720 ml larutan B untuk mendapatkan larutan PBS dengan
Ph 7,2.
d. Pemilihan Hewan Uji dan Penyiapan Hewan uji
Hewan uji yang digunakan adalah mencit jantan (Mus musculus) yang
sehat dan aktivitas normal, dengan bobot badan statis 25 – 30 gram.
Selanjutnya disiapkan hewan uji sebanyak 12 ekor mencit yang dibagi atas 4
kelompok. Tiap kelompok masing – masing 3 ekor.

2. PERLAKUAN DAN PENGUJIAN AKTIVITAS IgM PADA HEWAN


UJI
a. Perlakuan pada hewan uji
1) Kelompok I (Kontrol )
Mencit uji diberi Na.CMC 1 % dengan volume 1 ml/gBB secara
oral setiap hari selama 6 hari. Setelah 6 hari, mencit uji diimunisasi dengan
SDMD 2% dengan volume 0,1 ml/ekor secara intraperitonial (ip).
Selanjutnya pada hari ke 5 setelah imunisasi, darah mencit diambil secara
intrakardial.
2) Kelompok II (Uji)
Mencit uji diberi ekstrak sampel sesuai konsentrasi uji masing-
masing kelompok uji dengan volume 1 ml/gBB secara oral setiap hari
selama 6 hari . Setelah 6 hari, mencit uji diimunisasi dengan statisti
SDMD 2% dengan volume 0,1 ml/ekor secara intraperitonial (ip).
Selanjutnya pada hari ke 5 setelah imunisasi, darah mencit diambil secara
intrakardial.
b. Pengujian Aktivitas IgM pada Hewan uji
1) Pengambilan Sampel Darah Hewan Uji
Pada hari ke -5 setelah imunisasi, darah diambil secara intrakardial,
kemudian dibiarkan membeku/menggumpal pada suhu kamar sela 1 -2
jam, selanjutnya disentrifuga dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit
dan diambil serumnya (supernatannya).
2) Uji Hemaglutinasi

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 20


Serum yang diperoleh selanjutnya diencerkan secara ‘double
dilution’: 1/4 ; 1/8; 1/16; 1/32; 1/64; 1/128; 1/256; 1/512 dengan PBS
sebanyak 50 µL untuk setiap sumur mikrotitrasi, selanjutnya pada setiap
sumur ditambahkan 50 µL statisti SDMD 2% v/v, diaduk rata (digoyang-
goyangkan) selama 5 menit. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC
selama 60 menit dan didiamkan semalam pada suhu kamar. Dilakukan
pengamatan perngenceran tertinggi dari serum darah mencit yang masih
dapat mengaglutinasi sel darah merah domba (SDMD).

3. TABEL PENGAMATAN
Untuk menentukan peningkatan aktifitas imunoglobulin M (IgM), data
diperoleh dari pembacaan titer antibodi pada reaksi hemaglutinasi dimana
pengumpulan data dilakukan dengan cara mengukur konsentrasi antibodi dengan
cara titrasi pengenceran bertingkat. Angka hasil pembacaan titer yang berupa
deret ukur dimasukan ke dalam deret hitung dengan rumus [2 (log titer) + 1].
Tabel Titer Antibodi dari Serum Darah Tikus Putih.
1 2 3
2 Angk 2 2 𝜇 𝛴𝜇
No log log Angka log Angka
a
Pengenceran Pengenceran Titer Pengenceran Titer
Titer
I
II
Ke-n
Keterangan:
2
log Pengenceran : Pengenceran bertingkat dari serum yang masih dapat
beraglutinasi.
Angka Titer : Ditentukan dari pengenceran tertinggi dari serum tikus
putih yang masih dapat beraglutinasi dengan sel darah
merah kambing.
I sampai V : Kelompok pelakuan.
µ : Rata-rata angka titer.
Σµ : Jumlah nilai dari angka titer.

4. SOAL-SOAL
a. Soal Pre-test
1. Uraikan prosedur kerja praktikum dengan menggunakan skema kerja?
2. Buatlah perhitungan pembuatan konsentrasi yang digunakan dalam
praktikum?

b. Soal Post-test
1. Uraikan prosedur kerja yang anda lakukan pada pengujian aktivitas
immunoglobulin?

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 21


2. Uraikan kegunaan atau fungsi dari larutan koloidal NaCMC 10%, sel
darah merah domba (SDMD), dan Phospat Buffered Saline (PBS)?
3. Uraikan fungsi teknik atau cara kerja yang digunakan setiap
percobaan:
a. Pembuatan larutan koloidal NaCMC 10%
b. Penyiapan sel darah merah domba (SDMD)
c. Penyiapan Phospat Buffered Saline (PBS)
d. Penyiapan dan pemilihan hewan uji
e. Perlakuan hewan uji (kontrol dan hewan uji)
f. Pengujian aktivitas IgM pada hewan uji meliputi pengambilan
sampel darah hewan uji dan uji hemaglutinasi
4. Hitunglah angka titer dari masing-masing kelompok perlakuan?
5. Jelaskan fungsi dari nilai angka titer dan hubungan angka titer dengan
peningkatan aktivitas imunoglobulin?
6. Jelaskan mengapa digunakan titrasi pengenceran bertingkat dalam
menentukan angka titer?
7. Simpulkan hasil percobaan yang diperoleh yang disesuaikan dengan
tujuan percobaan?

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 22


PRAKTIKUM V
UJI BIOAKTIVITAS ANTIMIKROBA EKSTRAK BAHAN ALAM
DENGAN METODE SKRINING DAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
(KLT) BIOAUTOGRAFI

A. TEORI UMUM
Antimikroba ialah obat pembasmi mikroba, khususnya mikroba yang
merugikan manusia. Kadar minimal yang diperlukan untuk menghambat
pertumbuhan mikroba atau membunuhnya, masing-masing dikenal sebagai kadar
hambat minimal (KHM) dan kadar bunuh minimal (KBM). Antimikroba tertentu
aktivitasnya dapat meningkat dari bakteriostatik menjadi bakterisid bila kadar
antimikrobanya ditingkatkan melebihi KBM.
Saat ini penyakit infeksi masih menjadi masalah serius di Indonesia,
ditambah lagi dengan semakin meluasnya resistensi mikroba terhadap obat-obatan
antibiotika yang telah tersedia. Hal tersebut mendorong pentingnya penggalian
sumber obat-obatan antimikroba lain dari bahan alam. Tanaman obat diketahui
potensial untuk dikembangkan lebih lanjut pada pengobatan penyakit infeksi,
namun masih banyak yang belum dibuktikan bioaktivitasnya secara ilmiah
(Hertiani, 2003).

B. TUJUAN PERCOBAAN
Untuk memperoleh data aktivitas antimikroba sampel uji sebagai dasar untuk
menunjang pengembangan penelitian pemanfaatan bahan alam khususnya di
bidang mikrobiologi.

C. KEGUNAAN PERCOBAAN DALAM ILMU KEFARMASIAN


Dapat digunakan sebagai pengembangan ilmu mikrobiologi dan Kimia
bahan alam. Sampel yang dipakai yaitu ekstrak bahan alam yang dapat diketahui
bioaktivitasnya dengan menggunakan kombinasi teknik kromatografi dan difusi
agar.

D. HUBUNGAN PERCOBAAN DENGAN MATERI KULIAH TEORI


Percobaan ini berhubungan dengan pemanfaatan bahan alam dari
tumbuhan sebagai obat, maka perlu dilakukan percobaan untuk menguji aktivitas
antimikroba ekstrak bahan alam terhadap beberapa mikroba uji dengan metode
Skrining dan KLT Bioautografi sebagai dasar pengembangan penelitian di bidang
farmasi khususnya bidang Bahan Alam-Mikrobiologi.

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 23


E. METODE PRAKTIKUM
1. ALAT DAN BAHAN PRAKTIKUM
Alat-alat yang dibutuhkan : autoklaf, batang pengaduk, cawan petri, chamber,
corong pisah, enkas, erlenmeyer, gelas kimia, gelas ukur, inkubator, lampu
spiritus, lampu UV 254 nm, dan 366 nm, mikropipet, oven, ose bulat, pinset, pipa
kapiler, penangas air, spektofotometer UV, spoit, tabung reaksi, timbangan
analitik, timbangan kasar dan vial.
Bahan-bahan yang dibutuhkan : aqua destilata, alkohol 70%, beberapa biakan
murni mikroorganisme (bakteri dan jamur), DMSO (dimetil sulfoksida),
ketokenazol, kloramfenikol, lempeng TLC G60 F254, larutan NaCl fisiologis
0,9%, medium GNA (Glukosa Nutrien Agar), medium GNB (Glukosa Nutrient
Broth), dan beberapa ekstrak sampel uji.
2. PROSEDUR PRAKTIKUM
a. Penyiapan sampel dan pengolahan sampel
Sampel berupa bagian dari tumbuhan/tanaman disiapkan,
selanjutnya dibuat simplisia berupa potongan kecil, kemudian
dikeringkan/diangin-anginkan.
b. Ekstraksi dan partisi
Simplisia berupa bagian tumbuhan/tanaman yang telah
dikeringkan, ditimbang sebanyak yang diinginkan kemudian ekstraksi sesuai
metode yang cocok dengan sampel uji. Ekstrak cair yang diperoleh diuapkan
dengan cara diangin-anginkan hingga diperoleh ekstrak kental, selanjutnya
ekstrak dapat dipartisi dengan menggunakan corong pisah. Ekstrak awal
maupun ekstrak hasil partisi dapat digunakan sebagai sampel uji.
c. Sterilisasi alat-alat
Alat-alat yang akan digunakan dibersihkan terlebih dahulu. Khusus
alat-alat yang terbuat dari kaca dicuci dengan deterjen sintetik menggunakan
air bersih kemudian dibilas dengan air suling. Alat-alat dikeringkan dengan
posisi terbalik di udara terbuka. Selanjutnya dibungkus dengan kertas
perkamen, lalu disterilkan dalam oven pada suhu 180⁰C selama 2 jam. Alat-
alat yang mempunyai skala dan alat-alat plastik disterilkan dalam autoklaf
pada suhu 121⁰C selama 15 menit. Ose dan pinset disterilkan dengan cara
dipijarkan langsung pada lampu spiritus.
d. Penyiapan mikroba uji
1) Peremajaan mikroba uji
Bakteri/jamur diambil dari biakan murni masing-masing satu ose kemudian
diinokulasikan pada medium NA untukmiring dengan cara digoreskan
secara aseptis. Masing-masing biakan bakteri diinkubasi selama 1 x 24
jam pada suhu 37⁰C sedangkan jamur diinkubasi selama 3 x 24 jam pada
suhu kamar.
2) Pembuatan suspensi mikroba uji

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 24


Mikroba hasil peremajaan, disuspensikan dengan larutan NaCl fisiologis 0,9%
sampai diperoleh transmitan 25% untuk bakteri dan 75% untuk jamur
menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 580 nm
sebagai blanko digunakan larutan NaCl fisiologis 0,9%.
e. Pengujian skrining antimikroba
1) Ekstrak sampel uji ditimbang sebanyak 10 mg.
2) Kemudian dimasukkan ke dalam vial steril dan dilarutkan dengan 200 µl
(0,2 ml) DMSO dan 9,8 mL medium GNA, sehingga diperoleh konsentrasi
1 mg/ml, kemudian dihomogenkan.
3) Campuran tersebut dituang ke dalam cawan petri steril dan dibiarkan
memadat. Setiap cawan petri dibagi tiga zona untuk masing-masing
mikroba uji.
4) Setelah media memadat ditambahkan 20 µL suspensi mikroba uji,
selanjutnya bakteri disebarkan menggunakan drigle sky secara merata.
5) Diinkubasikan pada suhu 37⁰C selama 24 jam untuk bakteri dan 27⁰C
selama 72 jam untuk jamur.
6) Kemudian diamati pertumbuhan mikroba uji pada media. Ekstrak
dikatakan aktif jika tidak adanya pertumbuhan mikroba uji pada
permukaan medium.
f. Pengujian Potensi Antimikroba
Untuk pengujian potensi antimikroba, digunakan bakteri-bakteri uji
yang memperlihatkan penghambatan/pembunuhan sampel uji terhadap
mikroba-mikroba uji pada pengujian skrining antimikroba.
i.Uji Kadar Hambat Minimum (KHM)
Sampel ditimbang dalam vial steril dengan konsentrasi yang dikehendaki
dalam pengujian. Konsentrasi yang buat sebaiknya dibuat dalam skala
deret ukur, selanjutnya dilarutkan dengan 0,5 ml DMSO hingga homogen.
Kemudian ditambahkan 4,5 ml medium GNB ke dalam vial yang telah
berisi sampel dan dihomogenkan. Kemudian setelah homogen dimasukkan
ke dalam masing-masing tabung dimasukkan suspensi bakteri uji.
Kemudian ke dalam masing-masing tabung dimasukkan suspensi bakteri
uji. Kemudian diinkubasikan pada suhu 37⁰C selama 24 jam dan
konsentrasi terendah yang menunjukkan larutan tetap jernih adalah harga
KHM-nya. Perlakuan yang sama juga dilakukan terhadap bakteri yang
lain.
ii.Uji Kadar Bunuh Minimum
Hasil inkubasi pada uji KHM kemudian digoreskan pada media GNA pada
cawan petri lalu diinkubasikan pada suhu 37⁰C selama 24 jam.
Konsentrasi terendah ekstrak uji yang membunuh atau menghambat
pertumbuhan mikroba uji merupakan Kadar Bunuh Minimumnya.
iii.Pemisahan senyawa secara Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 25


Ekstrak uji dipisahkan secara KLT dengan menggunakan campuran eluen
yang memperlihatkan partisi senyawa yang terbaik. Kemudian
kromatogram yang dihasilkan diamati bercaknya di bawah sinar UV pada
panjang gelombang 254 nm dan 366 nm serta penampak bercak H2SO4
10%.
iv.Pengujian secara KLT-Bioautografi
Ke dalam cawan petri dituang medium GNA sebanyak 10 ml dan
ditambahkan suspensi bakteri uji sebanyak 20 µL lalu dihomogenkan.
Kromatogram hasil pemisahan senyawa secara KLT kemudian diletakkan
di atas permukaan medium yang agak memadat. Setelah 60 menit,
lempeng (kromatogram) diangkat dan dikeluarkan. Selanjutnya diinkubasi
selama 24 jam pada suhu 37⁰C. Diamati daerah hambatan yang terbentuk.
Perlakuan yang sama juga dilakukan terhadap bakteri uji lainnya.

3. TABEL PENGAMATAN
Rf
No.
Sampel UV 254 UV 366 H2SO4 KLT
nm nm 10% Bioautografi

4. SOAL-SOAL
a. Soal Pre-test
1. Uraikan prosedur kerja praktikum dengan menggunakan skema
kerja?
2. Buatlah perhitungan pembuatan konsentrasi yang digunakan dalam
praktikum?

b. Soal Post-test
1. Uraikan prosedur kerja yang anda lakukan pada pengujian
bioaktivitas antimikroba dengan metode skrining dan KLT
bioautografi?
2. Uraikan kegunaan atau fungsi dari larutan NaCl fisiologis 0,9%,
medium GNA dan GNB, DMSO, lempeng TLC 60 GF 254,
penampak bercak H2SO4 10%?
3. Uraikan fungsi teknik atau cara kerja yang digunakan setiap
percobaan:
a. Sterilisasi alat-alat

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 26


b. Penyiapan mikroba uji
c. Pengujian skrining antimikroba
d. Pengujian potensi antimikroba
4. Hitunglah nilai Rf masing-masing skrining dan KLT
Bioautografi?
5. Jelaskan fungsi dari nilai Rf dan hubungan nilai Rf dengan
pemisahan senyawa?
6. Simpulkan hasil percobaan yang diperoleh yang disesuaikan
dengan tujuan percobaan?

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 27


PRAKTIKUM VI
PENGUJIAN AKTIVITAS MUCOLITIK
EKSTRAK BAHAN ALAM MENGGUNAKAN MUCUS USUS SAPI

A. TEORI UMUM
Salah satu penyakit yang kerap diobati dengan pengobatan tradisional adalah
batuk. Batuk dapat dibedakan menjadi batuk berdahak dan batuk tidak berdahak.
Batuk tidak berdahak yang disebut juga batuk kering terjadi apabila tidak ada
sekresi saluran pernapasan, iritasi pada tenggorokan sehingga timbul rasa sakit.
Batuk berdahak yaitu batuk yang terjadi karena adanya dahak pada tenggorokan
dan lebih sering terjadi pada saluran napas yang peka terhadap paparan debu,
lembab berlebihan dan sebagainya (Moelyono,1999).
Sekresi mukus (dahak) adalah bagian dari bentuk perlawanan dari saluran
pernapasan dengan jumlah yang disekresi bervariasi. Mukus berfungsi untuk
menahan bakteri, partikel asing, dan senyawa iritan. Hipersekresi mukus dapat
terjadi bila terdapat penyakit pada saluran pernapasan seperti bronkhitis, penyakit
paru obstruktif kronis, dan asma sebagai bentuk respon inflamasi. Adanya
gangguan pada saluran pernapasan merangsang pengeluaran mukus sehingga
mukus yang berlebihan dapat mengakibatkan terganggunya fungsi saluran
pernapasan (Leboe, 2015).
Senyawa kimia yang memiliki kemampuan meluruhkan/mengencerkan
dahak disebut mukolitik, yaitu obat yang bekerja dengan mengurangi kekentalan
dahak sehingga diharapkan dahak tersebut menjadi lebih mudah dikeluarkan.
Seiring dengan kemajuan teknologi dan ilmu pengetahuan telah banyak
dilakukan pencarian sumber bahan baku dan pengembangan obat khususnya obat-
obat yang dapat meluruhkan atau mengencerkan dahak.

B. TUJUAN PERCOBAAN
Untuk mengetahui aktivitas mukolitik dilihat dari perubahan viskositas
mukus usus sapi sebelum dan sesudah inkubasi serta konsentrasi terbaik ekstrak
uji yang memberikan efek mukolitik.

C. KEGUNAAN PERCOBAAN DALAM ILMU KEFARMASIAN


Dapat menjadi acuan bagi farmasis dalam pencarian bahan baku obat dari
bahan alam yang berkhasiat sebagai mukolitik.

D. HUBUNGAN PERCOBAAN DENGAN MATERI KULIAH TEORI


Percobaan ini berhubungan dengan materi pengujian bahan farmasi
terutama di bidang farmasi fisika. Viskositas dan rheologi berhubungan erat
dengan ilmu farmasi fisika. Viskositas adalah suatu cara untuk menyatakan berapa

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 28


daya tahan dari aliran yang diberikan oleh suatu cairan. Prinsip dasar penerapan
viskositas digunakan dalam sifat alir zat cair atau rheologi. Rheologi terlibat
dalam pembuatan, pengemasan atau pemakaian, konsistensi, stabilitas dan
ketersediaan hayati sediaan.
Prinsip percobaan ini adalah kemampuan ekstrak bahan alam dalam
mengencerkan mukus usus sapi secara in vitro dengan membandingkan hasil
viskositas mukus usus sapi sebelum dan sesudah inkubasi.

E. METODE PRAKTIKUM
1. ALAT DAN BAHAN PRAKTIKUM
Alat-alat yang dibutuhkan :
Batang pengaduk, cawan porselin, botol vial, timbangan analitik, gelas kimia 100
ml dan 250 ml, gelas ukur 10 ml dan 100 ml, labu ukur 10 ml dan 25 ml,
piknometer, pipet tetes, stopwatch, dan viskometer Ostwald.
Bahan-bahan yang dibutuhkan :
Ekstrak bahan alam, metanol, etil asetat, heksan, aquadest, mukus usus sapi, dapar
Posfat (Na2HPO4, NaH2PO4), asetilsistein 0,1% dan kertas label.

2. PROSEDUR PRAKTIKUM
a. Pembuatan dapar Posfat pH 7
1) Larutan A (Na2HPO4 0,1 M)
Ditimbang 8,885g Na2HPO4.2H2O, dimasukan pada gelas kimia
100 mL dengan penambahan aquadest sedikit demi sedikit aduk hingga
bahan larut kemudian masukan kelabu takar 500 mL, ditambah lagi
aquades sampai tanda batas.
2) Larutan B (NaH2PO4 0,1 M)
Ditimbang 3,4445g NaH2PO4.H2O; dimasukan pada gelas kimia
100 mL dengan penambahan aquades sedikit demi sedikit aduk hingga
bahan larut kemudian masukkan kelabu takar 250 mL, ditambah lagi
aquades sampai tanda batas.
Kedua larutan diatas masing-masing dipipet gondok, untuk larutan
A 305,5 mL dan larutan B 194,3 mL lalu dihomogenkan kemudian dicek
pH dengan menggunakan kertas lakmus (pH = 7,0).
b. Pembuatan mukus sapi 20% dalam dapar fosfat
Diambil 20 gram mukus sapi kemudian dilarutkan dalam dapar fosfat pH 7
hingga volume 100 mL.
c. Pengujian Mukolitik
1. Disiapkan bahan dan alat praktikum
2. Dibuat beberapa seri konsentrasi sampel uji dalam botol vial (jumlah seri
konsentrasi disesuaikan dan konsentrasi kontrol positif (obat Asetilsistein
0,1 %) dan kontrol negatif (disesuaikan pelarut yang digunakan).

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 29


3. Dalam gelas kimia dimasukkan masing-masing botol vial yang berisi
sampel uji sesuai konsentrasi uji, kontrol positif dan negatif.
4. Selanjutnya dimasukkan larutan mukus usus sapi 20% pada masing-
masing gelas kimia (perlakuan no.2). dengan menggunakan perbandingan
1:9 (misalnya 10 ml larutan uji : 90 ml larutan mukus)
5. Diinkubasi pada suhu 370C selama 30 menit.
6. Dilakukan pengukuran viskositas mucus awal sebelum inkubasi
menggunakan Viskometer Ostwald, hitung waktu alir dari masing-masing
(larutan uji, kontrol positif dan negatif)
7. Selanjutnya dilakukan pengukuran berat jenis mukus (kerapatan) dengan
piknometer.
8. Dihitung viskositasnya dengan mengalikan waktu alir dan kerapatan.
9. Tentukan konsentrasi terbaik ekstrak uji yang memberikan efek mukolitik
dengan metode analisis data Regresi Linier, Anova, dan uji t.

3. TABEL PENGAMATAN
Perhitungan Berat Jenis dan Pengukuran Waktu Alir
Perhitungan berat jenis untuk semua larutan menggunakan rumus :
Berat pikno berisi cuplikan – Berat pikno kosong
BJ =
Volume piknometer

Tabel Berat Jenis dan Waktu Alir


T (s) Berat Jenis (g/mL)
Sebelum Sesudah Pikno
Perlakuan Berat
inkubasi inkubasi + Pikno
Jenis
I II I II sampel
Air Suling
Kontrol
Positif
Kontrol
Negatif
Konsentras
ix%
Konsentras
i ke-n%

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 30


Perhitungan viskositas untuk semua larutan dilakukan dengan rumus :
rata-rata t larutan uji x BJ larutan uji
Viskositas = x viskositas kontrol negatif
rata-rata t kontrol negatif x BJ kontrol negatif

dimana :
t = waktu yang dibutuhkan oleh cuplikan untuk mengalir (detik)
BJ = berat jenis (gram/mL)
Tabel Viskositas Sebelum Inkubasi
Replikasi perubahan
Total Rata-
Konsentrasi viskositas mukus (Cp)
(Cp) rata (Cp)
R1 R2 R3
X%
Larutan uji
ke-n %
Kontrol positif 0,1%
Kontrol negatif 10%

Tabel Viskositas setelah Inkubasi


Replikasi perubahan
Total Rata-
Konsentrasi viskositas mukus (Cp)
(Cp) rata (Cp)
R1 R2 R3
x%
Larutan uji
ke-n%
Kontrol positif 0,1%
Kontrol negatif 10%

4. SOAL-SOAL
a. Soal Pre-test
1. Uraikan prosedur kerja praktikum dengan menggunakan skema kerja?
2. Buatlah perhitungan pembuatan konsentrasi yang digunakan dalam
praktikum?

b. Soal Post-test
1. Uraikan prosedur kerja yang anda lakukan pada pengujian aktivitas
mukolitik.
2. Uraikan kegunaan atau fungsi dari mukus sapi, asetilsistein 0,1%, dan
dapar fosfat.
3. Uraikan fungsi dari perlakuan yang digunakan dalam percobaan:
a. Pembuatan dapar fosfat pada pH 7
b. Pembuatan mukus sapi dalam dapar fosfat
Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 31
c. Pembuatan seri konsentrasi sampel, kontrol positif, dan kontrol
negative
d. Inkubasi pada suhu 37⁰C selama 30 menit
e. Pengukuran viskositas sebelum dan sesudah inkubasi
4. Mekanisme kerja asetilsistein sebagai obat batuk?
5. Hitunglah nilai perubahan viskositas mukus (Cp) pada masing-masing
kelompok perlakuan!
6. Jelaskan fungsi dari nilai Cp dan hubungannya dengan konsentrasi
ekstrak dalam menghasilkan aktivitas mukolitik!
7. Jelaskan perbedaan analisis data dengan metode anova dan uji t terkait
percobaan ini!
8. Simpulkan hasil percobaan yang diperoleh sesuai dengan tujuan
percobaan!

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 32


LAMPRAN

METODE- METODE ANALISIS PERHITUNGAN DAN PELAPORAN


1. TABEL PENGAMATAN UJI BSLT
Jumlah mati pada konsentrasi sampel (ppm)
Replikasi Sampel
a µg/ml b µg/ml c µg/ml d µg/ml
1
2
3
Total penghambatan
% penghambatan
Harga Probit
Tabel Perhitungan
Log Konsentrasi (X) Harga Probit (Y)
m µg/ml q
n µg/ml r
o µg/ml s
p µg/ml t

1. Dari data di atas dapat dihitung nilai intersep (a) dan slop (b) serta resultan (r)
dengan persamaan regresi linear : y = a + bx menggunakan Kalkulator atau
rumus Statistik.
2. Jika nilai a dan b telah di peroleh, maka nilai LC50 dapat diperoleh dengan
memasukkan nilai (y) = jumlah replikasi, sehingga nilai (x ) dapat pula
diperoleh.
3. Jika nilai (x) telah diperoleh maka gunakan rumus :
LC50 = anti log x

4. Jika nilai LC50 telah diketahui maka dapat diketahui pula konsentrasi
dimana 50 % hewan uji mati.

Tambahan:
* Beberapa metode analisis perhitungan nilai LC50 yang dapat digunakan :
1. Metode Analisa Probit
2. Metode Reed and Muench
3. Metode Grafik
4. Metode Perhitungan Matematika

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 33


RUMUS PERHITUNGAN PROBIT UJI ANTIMITOSIS
1. Prosentase jumlah sel yang mengalami penghambatan pembelahan :

∑ TM
% TM = x 100
∑ ST

Keterangan :
% TM = % sel tidak membelah
∑ TM = jumlah sel tidak membelah
∑ ST = jumlah sel total

2. Nilai probiy (y) rata-rata yang sebenarnya :


(Npb - Npa) x C
y = Npa
1

Keterangan :
Npa = nilai tabel probit hasil persentase rata-rata
Npb = nilai tabel probit satu angka lebih besar dari probit rata-rata
C = angka/nilai desimal dari kelebihan perhitungan persentase rata-rata

2. TABEL ANALISIS REED & MUENCH.


Mortalita
Rasio mati :
Konsent Log Jumlah Terakumulasi s
total
rasi Konsentrasi (%)
(%) (%) Mat Hidu Terakumulas Rasio x
Mati (x) Hidup (y)
i p i x:(x+y) 100
KE1 k+l+m+n+
F K F
o
KE2 G L f+g l+m+n+o
KE3 H M f+g+h m+n+o
KE4 I N f+g+h+i n+o
KE5 f+g+h+i+
J O O
j
Untuk mendapatkan nilai LC50 dan LC90, analisis data menggunakan rumus:
50%− 𝛼 90%− 𝛼 𝑘
ℎ= dan ℎ= 𝑖 = 𝑙𝑜𝑔
𝑏− 𝛼 𝑏− 𝛼 𝑠

g= hxI
y = g + log s

LC50 dan LC90 = log y

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 34


Keterangan :
h = Jarak proporsi
i = Logaritma pertambahan konsentrasi
a = Presentase kematian lebih kecil dari 90%
b = Presentase kematian lebih besar dari 90%
k = Konsentrasi yang lebih besar dari 90% kematian
s = konsentrasi yang lebih kecil dari 90% kematian
g = Hasil kali jarak proporsi dengan logaritma pertambahan dosis
y = Persamaan

3. TABEL ANALISIS OF VARIAN (ANOVA)


Sumber keteranga
keragaman Db JK KT Fhitung Ftabel n

Perlakuan
Galat
Total

Dimana : Db = Derajat bebas


KT = Kuadrat tengah
JK = Jumlah kuadrat
Perhitungan Anava
a. Menghitung FK
𝑇𝑖𝑗 2
𝐹𝐾 = 𝑛.𝑡
b. Menghitung JK total
JK total = T(yij2) – FK
c. Menghitung JK perlakuan
𝑇𝐴2
𝐽𝐾 𝑝𝑒𝑟𝑙𝑎𝑘𝑢𝑎𝑛 = 𝑛
− 𝐹𝐾
d. Menghitung JK galat
JK galat = JK total - JK galat
e. Menghitung derajat bebas
1) db total = (n.t) – 1
2) db perlakuan = t – 1
3) db galat = db total – db perlakuan
f. Menghitung kuadrat tengah (KT)
𝐽𝐾𝑃
1) 𝐾𝑇 𝑝𝑒𝑟𝑙𝑎𝑘𝑢𝑎𝑛 =
𝑑𝑏𝑝

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 35


𝐽𝐾𝐺
2) 𝐾𝑇𝑔𝑎𝑙𝑎𝑡 = 𝑑𝑏𝐺
g. Menghitung harga F hitung
𝐾𝑇𝑃
𝐹 ℎ𝑖𝑡𝑢𝑛𝑔 = 𝐾𝑇𝐺
Bila F hitung > F Tabel (X = 0,01), maka Ha diterima artinya ada
pengaruh pemberian variasi dosis ekstrak buah mengkudu (Morinda citrifolia L.)
terhadap aktivitas imunoglobulin M (Ig M) terhadap tikus putih (Rattus
Norvegicus).
Bila F hitung < F Tabel (a = 0,01), maka H0 diterima artinya tidak ada
pengaruh pemberian variasi dosis ekstrak buah mengkudu (Morinda citrifolia L.)
terhadap aktivitas imunoglobulin M (Ig M) terhadap tikus putih (Rattus
Norvegicus).
Apabila hasil anova signifikan uji dilanjutkan dengan menghitung
koefisien keseragaman (KK).
√𝐾𝑇𝐺
𝐾𝐾 = 𝑥 100%
𝑌
Dari hasil Anava, diperoleh nilai KK (Koefisien Keragaman), maka untuk
pengujian lanjutan disesuaikan dengan persentase dari nilai KK yaitu :
1. Jika hasil KK lebih besar (minimal 10% untuk perlakuan homogen) dan
(minimal 20 % untuk hetrogen) digunakan uji Duncan dimana uji ini
merupakan uji yang paling teliti.
2. Jika hasil KK (antar 5-10% untuk perlakuan homogen) dan (antara 10-20%
untuk hetrogen) digunakan uji BNT dimana uji ini merupakan uji yang
memiliki ketelitian sedang.
3. Jika hasil KK (maksimal 5% untuk perlakuan homogen) dan (maksimal 10%
untuk perlakuan hetrogen) digunakan uji BNJ dimana uji ini kurang teliti.

4. TABEL UJI t

Perlakuan
Analisa
K E

Waktu kematian cacing


Ascaridia galli

Rata-rata

Simpangan Baku S1 S2

Varians S12 S22

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 36


t=
Keterangan :
= rata-rata kematian Acaridia galli untuk pirantel pamoat
= rata-rata kematian Acaridia galli untuk ekstrak kulit buah Mangga gadung
(Mangifera indica. L).
S1 = simpangan baku untuk pirantel pamoat
S2 = simpangan baku untuk ekstrak kulit buah Mangga gadung (Mangifera indica. L)
S1 2 = varians untuk pirantel pamoat
S1 2 = varians ekstrak ekstrak kulit buah Mangga gadung (Mangifera indica. L).

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019 37