1.1.

TEHNICA PCR PCR TECHNIQUE (PO Cercetări privind polimorfismul la locusul genei leptinei în scopul
aplicării selecţiei asistate de markeri genetici la taurine 13 Tehnica PCR exploatează unele caracteristici ale
replicării ADN, unde pentru amplificarea secvenţei de ADN dorite se utilizează o secvenţă de
oligonucleotide numită primer sau amorsă. Primerii sunt secvenţe scurte de 15 – 35 nucleotide,
complementare capetelor 3’ ale secvenţei de ADN ce se doreşte a fi amplificată; ei sunt specifici fiecărei
gene şi sunt sintetizaţi cu ajutorul unor sintetizatoare automate de ADN. Pentru amplificarea secvenţelor
specifice de ADN, prin tehnica PCR, se foloseşte o soluţie tampon (PCR buffer) în care se introduce ADN ce
conţine gena de interes, primerii sintetizaţi, Taqpolimeraza şi cele patru tipuri de deoxinucleotid-trifosfaţi
(dATP, dGTP, dCTP şi dTTP). Tehnica PCR presupune parcurgerea a trei etape principale, într-un aparat în
care realizarea ciclurilor termice este controlată automat de Termocycler: 1. Denaturarea ADN, presupune
încălzirea soluţiei în care se află ADN la 940C timp de 5 minute, efectul fiind ruperea legăturilor de hidrogen
şi separarea celor două catene. 2. Ataşarea primerilor se realizează prin răcirea la 40 – 600C a soluţiei în care
se află secvenţa de amplificat. Primerii se leagă la capetele 3’ a celor două catene de ADN ale genei pe care
dorim să o amplificăm. De obicei, este nevoie de doi primeri numiţi sens şi antisens, dar amplificarea se
poate realiza şi cu un singur primer, în cazul tehnicii PCR ancorat. 3. Elongaţia se produce la temperatura de
circa 720C, temperatură la care Taqpolimeraza funcţionează optim, în faza de extensie, iar ciclul se repetă de
25 – 40 ori. Amplificarea este aproximativ exponenţială, realizându-se după 3 cicluri 2 copii, după 10 cicluri
256 copii, iar după 32 cicluri 1,73 miliarde copii ale secvenţei supuse amplificării. (Vlaic A. şi colab.,1997).
După amplificare, gena de interes se vizualizează în lumină ultravioletă, la nivelul gelului de agaroză în care
fragmentele au fost colorate cu bromură de etidiu. Dacă amplificarea s-a produs, în gel se vor observa una
sau mai multe benzi, corespunzătoare secvenţei specifice de ADN. În tehnica PCR, alegerea primerilor este
primordială şi putând fi utilizaţi două tipuri de primeri: Cercetări privind polimorfismul la locusul genei
leptinei în scopul aplicării selecţiei asistate de markeri genetici la taurine 14  primeri specifici - sunt dirijaţi
spre un situs foarte precis al ADN, reprezentat de genele sau fragmentele de gene cunoscute. Prin primer
specific se înţelege o secvenţă cunoscută de ADN utilizată pentru începerea sintezei unei anumite gene, cu
structură cel puţin parţial cunoscută. Primeri specifici pot fi dirijaţi şi spre regiunile situate în amonte sau
aval de secvenţele unice, la nivelul secvenţelor minisatelit (Edwards A., şi colab., 1991) sau microsatelit
(Hubert R., şi colab.,1989). Secvenţele de tip satelit, specifice fiecărui individ sunt astfel amplificate.
Evidenţierea acestor polimorfisme se utilizează în momentul de faţă în medicina criminalistică pentru
identificarea suspecţilor, pornind de la diferite mostre de ţesut (sânge, spermă, bulbi de păr etc.), pentru
marcarea cărnii, sau altfel spus, urmărirea ei pe parcursul filierei de distribuţie şi consum. (Fabrice D., şi
colab.,2002).  primeri aleatori - sunt de dimensiuni reduse (10 – 20 perechi baze, în medie). Alegerea
secvenţelor care constituie aceşti primeri este complet arbitrară. În cursul reacţiei PCR aceşti primeri se vor
hibrida de fiecare dată când în ADN se vor găsi secvenţe care le sunt complementare şi de orientare opusă.
1.2. 1.2. VARIANTE ALE TEHNICII PCR VARIANTS OF THE TECHNIQUE 1.2.1. Tehnica RFLP RFLP
technique (Restriction Fragment Length Polymorphism) Această tehnică se bazează pe proprietăţile de
hibridare care există între două fragmente de ADN, prezentând un grad înalt de omologie (RFLP- bazat pe
hibridare) şi tehnica PCR – denumită PCR-RFLP, în care se evidenţiază polimorfismele existente la nivelul
situsurilor enzimelor de restricţie. 1. Tehnica RFLP bazată pe hibridare cu o sondă, implică parcurgerea
următoarelor etape:  extracţia ADN din organismele ce urmează să fie analizate;  digestia ADN cu
ajutorul enzimelor de restricţie;  separarea fragmentelor obţinute în urma digestiei, în funcţie de mărimea
lor, prin electroforeză în gel de agaroză;  transferul ADN sub formă denaturată pe o membrană de nylon
(Southern blotting) în care poziţia relativă a diferitelor fragmente de ADN din gel se păstrează pe parcursul
transferului;  hibridarea ADN cu sonda marcată prealabil, în regiunile în care prezintă omologie; Cercetări
privind polimorfismul la locusul genei leptinei în scopul aplicării selecţiei asistate de markeri genetici la
taurine 16  vizualizarea regiunilor hibridate cu ajutorul unui film sensibil la radiaţii (autoradiografie) sau cu
ajutorul unei reacţii enzimatice, care dă o coloraţie specifică. În tehnica RFLP pot fi utilizate diferite tipuri
de sonde, care permit evidenţierea unor tipuri diferite de polimorfism (Favre D.,1996). Sondele mono- sau
oligogenice pun în evidenţă unul sau mai mulţi loci; ele dau un profil simplu care include câteva benzi.
Utilizarea acestui tip de sonde permite vizualizarea polimorfismelor de secvenţă, localizate la nivelul
situsurilor de restricţie, precum şi a polimorfismelor de inserţie/deleţie, situate între situsurile de restricţie.
Acest tip de sondă a fost utilizat pentru a alcătui hărţi genetice la om, pentru a identifica unele varietăţi de
măr şi pentru a pune la punct un test de depistare a anemiei falciforme (Myrick K.V. şi colab., 2002).
Sondele poligenice sau multilocus pot fi dirijate spre zonele care prezintă variabilitate foarte mare, cum sunt
secvenţele de tip micro şi minisatelit, alcătuite de 2 până la 16 perechi de baze, repetate în tandem. Cu
ajutorul sondelor multilocus, se observă, în general un grad ridicat de polimorfism între genotipurile înrudite.
Acest tip de sondă a fost utilizat pentru prima dată de Jeffreys şi colab., (1985) la hibridarea cu ADN
genomic uman digerat şi amprentizarea genetică a fiecărui individ. Ulterior, au fost descoperite alte secvenţe
satelit şi la alte mamifere, la insecte şi plante. Sondele multilocus permit evidenţierea polimorfismului de
 secvenţă la nivelul situsurilor de restricţie, polimorfismului de inserţie/deleţie precum şi polimorfismului
determinat de numărul unităţilor repetitive, pentru fiecare individ în parte (Barroso A., şi colab., 1998). 2.
Tehnica RFLP, bazată pe PCR, utilizează o enzimă de restricţie pentru digerarea unui produs de amplificare,
obţinut cu primeri specifici, iar în gelul de agaroză se vor obţine benzi de dimensiuni diferite,
corespunzătoare celor trei genotipuri (homozigoţi pe una din cele două alele şi heterozigoţi). Markerii RFLP
sunt markeri cu polimorfism limitat ce identifică variaţiile secvenţei de ADN la nivelul unui situs de
restricţie, prin analiza RFLP. O sursă abundentă de markeri genetici, utilizaţi în tehnicile de cartare a
genomului animal au la bază modificările unor secvenţe de ADN care se produc la nivelul situsurilor de
restricţie De regulă aceste variaţii sunt cauzate de mutaţii punctiforme (substituţia unei nucleotide Cercetări
privind polimorfismul la locusul genei leptinei în scopul aplicării selecţiei asistate de markeri genetici la
taurine 17 cu o alta), inserţii sau deleţii, în interiorul situsului de restricţie şi astfel, enzima de restricţie, nu
mai recunoaşte situsul respectiv şi nu mai taie. Aceasta va determina obţinerea unor fragmente de restricţie
de lungimi diferite (polimorfice) care pot fi uşor vizualizate şi identificate în gelul de agaroză datorită
lungimii lor diferite. Din această cauză ele se vor separa în gelul de electroforeză sub forma unor benzi
situate în diferite regiuni. Greutatea moleculară se apreciază cu ajutorul unui ADN standard de etalonare
”leadder” În practică, mărimea unui fragment ce se detectează prin Southern blotting este de 300 pb – 15 kb
cu diferenţe detectabile mai mici de 50 pb. Prin tehnica PCR se detectează produşi între 60 pb-2kb, cu
diferenţe chiar de câteva baze. Indivizii diferiţi genetic pentru un anumit locus, vor prezenta fragmente de
restricţie de lungimi diferite, într-un număr diferit pentru un anumit cuplu format din sonda moleculară –
enzimă de restricţie. În acest context, fiecare sistem format din ADN genomic – enzimă de restricţie, poate
defini un locus polimorf care are cel mult două alele diferite.( Pierce K.E. şi colab., 2007). Cu ajutorul RFLP
se pot identifica variaţiile genetice dintre indivizi doar la nivelul situsurilor de recunoaştere a enzimelor de
restricţie, respectiv dintre indivizii care posedă unul din cele trei genotipuri existente în locusul de interes
(AA, Aa, aa) şi nu se pot detecta variaţiile la nivelul întregului genom, care la mamifere este de ordinul 3x
109 pb(Bekman , J.S. şi colab., 1983).
1.3. 1.4. TEHNICI BAZATE PE SECVENŢIERE TECHNIQUES BASED ON SEQUENCING Prima secvenţă
descifrată a fost a ARNt pentru alanina de la drojdie (1964), făcută de către Robert Holley şi colegii săi de la
Universitatea Cornell. Aceştia au utilizat enzime specifice care au rupt molecula de ARNt în segmente mici
până când s-a reuşit secvenţierea directă prin metode de degradare enzimatică. Abia în 1976 a fost descifrată
secvenţa completă a ARN monocatenar de la fagul MS2, de către Walter Fiers în laboratorul din Ghent. S-a
stabilit atunci structura completă a genomului viral şi organizarea acestuia, corespondenţa dintre codoni şi
cele trei proteine codificate de genele fagului MS2 şi că un codon stop cauzează terminarea transcripţiei
(Watson şi colab., 1992). Secvenţierea ADN poate fi făcută prin procedee chimice (metoda Maxam şi
Gilbert) sau cu ajutorul terminatorilor de lanţ (metoda dideoxi sau Sanger), aceasta din urma fiind astăzi
utilizată mai mult. Prima metodă a fost pusă la punct de către Maxam si Gilbert (1977) şi este de fapt o
clivare chimică. Cea de-a doua, metoda dideoxi sau Sanger, a fost pusă la punct în acelaşi an de către Sanger
şi se bazează pe întreruperea controlată a sintezei enzimatice a ADN, amplificat prin PCR. În ambele cazuri,
fragmentele obţinute sunt supuse marcării radioactive (cu 32P, de exemplu) înaintea separării pe baza
greutăţii moleculare într-un gel de poliacrilamidă. Vizualizarea şi analizarea produşilor rezultaţi se face prin
autoradiografie. O metodă mult mai convenabilă şi mai precisă este marcarea fluorescentă a fragmentelor şi
secvenţierea automată. Fragmentele de ADN sunt migrate într-un gel de poliacrilamidă iar aparatul
(secvenţiatorul), prevăzut cu un fascicul laser, excită fiecare moleculă marcată Cercetări privind
polimorfismul la locusul genei leptinei în scopul aplicării selecţiei asistate de markeri genetici la taurine 31
fluorescent şi transformă valorile fluorescente în secvenţa în nucleotidice a fragmentului analizat. Un astfel
de aparat (ALFexpress Auto Read) poate detecta 200 pb pe oră. Fiecărei secvenţe de acizi nucleici îi
corespunde o diagramă a succesiunii de baze numită electroforegramă. În această diagramă fiecărei baze îi
corespunde un vârf şi o coloraţie caracteristică. O altă tehnică este secvenţierea automată, în cazul căreia,
catena de ADN care va intra în reacţia de secvenţiere depinde de primerul utilizat, putând fi supusă
secvenţierii atât catena sens cât şi cea antisens. În studiile de secvenţiere a genelor, pentru precizia
rezultatelor obţinute sau atunci când sunt căutate mutaţii punctiforme, se recomandă secvenţierea ambelor
catene şi compararea rezultatelor obţinute. În acest caz, este necesară cunoaşterea ambilor primeri, care să
iniţieze sinteza genei ce urmează să fie descifrată. În cazul în care se doreşte descifrarea structurii unui
fragment de ADN, sau a unei gene, de la specii a căror genom nu este saturat în hărţi genetice, pentru
amplificare se utilizează primeri universali, cum este cel de la fagul M13 (Veira ,J şi colab., 1982.. Pentru
fragmente de dimensiuni diferite se aleg vectori corespunzători pentru clonare, de exemplu: plasmide (0,1-10
kb), fagi (8-20 kb), cosmide (35-50 kb), BAC (cromozom artificial bacterian 75-300 kb) şi YAC (cromozom
artificial de drojdie 100-1000 kb) la care genomul este complet descifrat şi sunt întocmite hărţile de
restricţie. Etapele secvenţierii: 1. Izolarea ADN genomic sau a fragmentului (genei) de interes ce urmează să
fie clonat sau secvenţiat; 2. Purificarea ADN izolat; 3. Amplificarea prin PCR a fragmentului de analizat cu
ajutorul primerilor specifici sau a primerilor universali, în prezenţa celor patru dNTP marcaţi florescent,
 fiecare cu altă culoare - (adenina în verde, timina în roşu, guanina în negru şi citozina în albastru) şi a
polimerazei ; 4. Vizualizarea produşilor de amplificare prin migrarea în gel de agaroză (procedeu care face
posibilă atât identificarea produşilor de amplificare, determinarea lungimii fragmentelor amplificate şi a
calităţii produsului de amplificare; Cercetări privind polimorfismul la locusul genei leptinei în scopul
aplicării selecţiei asistate de markeri genetici la taurine 32 5. Purificarea produşilor de amplificare; pentru ca
produşii de amplificare să poată fi utilizaţi în reacţii de secvenţiere trebuie să aibă un grad înalt de puritate
(evitându-se contaminarea cu inhibitori şi prezenţa rezultatelor eronate) ; 6. Secvenţierea automată; 7. Citirea
secvenţelor pe catena analizată; 8. Alinierea secvenţelor de pe cele două catene sens şi antisens; Reacţia de
secvenţiere începe întotdeauna după ce ADN supus secvenţierii a fost iniţial amplificat prin PCR, purificat şi
cuantificat (Coşier Viorica, 2007).
1.4. Tehnicile moleculare disponibile pentru studierea polimorfismului dintr-un genom vizează descoperirea
mutaţiilor la nivelul situsurilor de restricţie prin tehnica PCR-RFLP sau depistarea polimorfismelor
punctiforme din regiunile genice sau intergenice, denumite generic SNP. Aceste tehnici împreună cu cele ale
amprentelor genetice, fac practic posibilă localizarea şi vizualizarea directă, la nivel molecular, atât a genelor
responsabile de fenogeneza unui anumit caracter calitativ (monogenic), cât şi a sectoarelor de ADN,
denumite generic markeri moleculari, care delimitează anumite gene majore sau anumiţi loci cantitativi,
prezenţi în vecinătatea lor. Alegerea unei tehnici în studierea polimorfismelor depinde de acurateţea
rezultatelor obţinute, reproductibilitate, costuri şi echipamentele disponibile în laborator. În cazul cercetării
noastre am ales studierea polimorfismelor de tip RFLP datorită disponibilităţii tehnicii în laborator,
existenţei unei aparaturi de înaltă performanţă, costurilor relativ scăzute, existenţa literaturii de specialitate
mai bogate şi a avantajelor Cercetări privind polimorfismul la locusul genei leptinei în scopul aplicării
selecţiei asistate de markeri genetici la taurine 84 date de această tehnică, furnizarea markerilor codominanţi
de tip RFLP ce pot fi urmăriţi în descendenţă, dar şi a reproductibilităţii ridicate. Tehnica PCR-RFLP se
bazează pe modificările unor secvenţe din ADN la nivelul situsurilor de restricţie. De regulă, aceste variaţii
sunt cauzate de mutaţii punctiforme (substituţia unei nucleotide cu alta), inserţii sau deleţii în interiorul
situsului de restricţie. În acest fel, enzima de restricţie nu mai recunoaşte situsul respectiv şi nu mai
realizează scindarea. Variaţia secvenţelor de tip RFLP, ne arată de fapt, un polimorfism de lungime a
fragmentelor de ADN după tratare cu o enzimă de restricţie şi analiza electroforetică a lungimii
fragmentelor. Polimorfismele de tip SNP, caracterizează un polimorfism punctiform prin detectarea
mutaţiilor, determinate de substituţia unei singure nucleotide cu alta. Acest tip de polimorfism este cel mai
frecvent întâlnit, fiind determinat fie de agenţi mutageni chimici, fie de greşelile din timpul replicării ADN.
Şi tehnica RFLP detectează polimorfismul datorat unei singure nucleotide, dar la nivelul unui situs de
restricţie. Diferenţa între SNP şi RFLP este că majoritatea acestor profile de tip SNP nu sunt recunoscute de
către o anumită enzimă de restricţie

1.1.1 Diagnostic direct - bazat pe identificarea nemijlocită a mutaţiilor în gena de interes – are o precizie
ridicată (pînă la 100%), nu necesită prezenţa pacientului bolnav pentru DP şi analiza informativităţii familiei. Este
util pentru identificarea mutaţiilor majore, frecvenţa cărora este ridicată şi prezintă o mare valoare de diagnostic,
dar nu şi în cazul mutaţiilor minore, aceasta şi fiind dezavantajul acestuia deoarece în cazul că lipsesc mutaţiile
majore în genă se cere o analiză moleculară detaliată, ceea ce include scanarea totală a genei cu scopul de a
identifica aceste mutaţii mici. Este cunoscut faptul că frecvenţa diferitor mutaţii în fiecare genă variază. Există
mutaţii „majore” care au o frecvenţă ridicată şi există mutaţii minore (sporadice) care se întîlnesc rar. Pentru
multe din genele răspunzătoare de moştenirea unor maladii, spectrul de mutaţii este bine cercetat şi se alcătuiesc
algoritme de identificare ale acestora (de ex.: pentru gena DMD, codificatoare a protenei distrofina sunt
caracteristice deleţiile exstinse în proporţie de 60% la persoanele bolnave de miodistrofie Duchenne).
1.1.2 Diagnostic indirect. Acesta are la bază analiza site-urilor polimorfice intra- şi inter- genice. Condiţia
esenţială pentru acest tip de diagnostic este prezenţa copilului bolnav şi/sau posibilitatea investigării ADN-ului
său. Determinarea informativităţii presupune identificarea site-ului polimorfic ce poate fi utilizat ca marker
molecular pentru discriminarea alelelor mutante de cele normale. În cazul patologiilor autozomal-recesive-
părinţii vor fi heterozigoţi după acest polimorfism, iar bolnavul- homozigot. Heterozigotivitatea după
polimorfisme moleculare determină informativitatea familiei cu risc crescut de naştere a unui copil bolnav. În
dependenţă de amplasarea alelică a markerilor pe cromozomii omologi la pacient şi părinţii săi, familia poate fi
deplin informativă, parţial informativă şi neinformativă. Metoda indirectă are avantajul diagnosticului fără a
identifica mutaţia în gena respectivă, dar este imposibilă în absenţa copilului bolnav, întrucît nu e determinată
alela polimorfă cu care e linkată gena mutantă.
Autenticitatea diagnosticului molecular prin metode directe oferă o exactitate înaltă şi se apropie de
absolut. Cu toate acestea, luând în considerare multitudinea de schimbări posibile în genom datorită crossing-
overului sau datorită „efectului mutagen” prezent în primul trimestru de sarcină, diagnosticul direct oferă o
precizie de 99,9%.
 Evaluarea rezultatelor în cazul metodelor indirecte este mai dificilă. Pentru identificarea polimorfismului
markerilor intragenici precizia diagnosticului indirect atinge 99%. Excepţie fac genele extrem de mari, de
exemplu gena distrofina, gena implicată în hemofilia A, gena neurofibromatozei şi altele. Astfel, în gena
distrofina, greşeala în timpul diagnosticului indirect poate fi de aproximativ de 2%, acest lucru datorându-se
frecvenţei crossing-overului în această genă gigantă.
Deasemenea, este important ca analiza prin metoda indirectă să fie facută corect în ceea ce priveşte gradul
de rudenie între persoana căruia i se face analiza, sau fătului şi persoana bolnavă de o maladie ereditară (sibs).
Posibilitatea apariţiei unei erori de diagnostic este cu atît mai mare cu cât marcarea (identificarea) alelei
purtătoare de mutaţie nu se face la persoana bolnavă dar la alte rude. Atenţie merită şi situaţiile când se evaluează
rezultatele diagnosticului indirect prin folosirea locusurilor polimorfice intragenice (extragenice). Şi în acest caz
diagnosticul prenatal este posibil doar dacă se testează mai multe site-uri adiacente genei mutante. O astfel de
abordare oferă posibilitatea diagnosticului indirect să atingă 99% exactitate.
Distrofia musculară este o afecţiune rară din clasa miopatiilor (Miopatie- din greacă mys, myos – muşchi; pathos-
suferinţă, durere), mai specific afecţiuni neuromusculare cu progresie lentă, ereditară şi caracterizată prin
deteriorare progresivă a muşchilor corpului, antrenând slăbiciune musculară şi ulterior invaliditate. Pentru a nu fi
induşi în eroare de termenul „neuromusculare” precizăm faptul că aceasta este o afecţiune non-inflamatorie, fără
o patologie a nervilor centrali sau periferici care, afectează în mare parte fibrele musculare striate [11].
Degenerarea musculaturii fiind de fapt provocată de produsul truncat al codării a proteine musculare numită
distrofina [10].
1.1.3 Gena DMD (distrofina)
Gena distrofina a fost descoperită în 1987 de către Louis M. Kunkel. Ea este cea mai lungă genă a
genomului uman. Ca mărime ea cuprinde 0.08% din genomul uman. Gena distrofina este localizată pe braţul scurt
al cromozomului X (Xp21.2). Este formată 2.6 Mb . Conţine 79 de exoni şi 8 promotori(4 situaţi în zona
reglatoare şi 4 situaţi în zona centrală a genei). Pentru transcrierea a preARNm este nevoie de 16 ore; ARNm are
96 de exoni şi 14 kb. Are 2 site-uri de poliadenilare şi 18 transcripţi alternativi [47], [1].
Funcţiile genei DMD:
La nivel molecular: asigură sinteza proteinei distrofina; localizată pe suprafaţa internă a sarcolemei fibrei
musculare.
La nivel celular: produsul transcrierii genei DMD este distrofina - o proteina structurală legată de sarcolemă ce
interacţionează cu diferite complexe proteice asigurând integritatea membranei celulare musculare.
La nivel de organism: participă la homeostazia ţesutului muscular striat scheletal şi cardiac [1].
Heterogenitatea genică a DMD: gena este activată de factori trans-reglatori, specifici de ţesut; are cel puţin 8
promotori, 4 dintre ei sunt situaţi în regiunea reglatoare. Alţi 4 promotori sunt interni- în structura zonei centrale a
genei[15]
1.1.4 Proteina Distrofina
Proteina structurală, în forma de nuia, cu mărimea de cca 150 nm, alcatuită din 3685 aminoacizi, care este
legată de membrane celulară musculară, asigurîndu-i integritatea. Proteina Distrofina este localizată în muşchii de
tip scheletic (sub sarcolemă, asociată cu complexul proteic), cardiac (asociată cu tubulii T), neted (de-a lungul
membranei, alternând cu vinculina) şi în unele celule neurale. Ea este constituită din 4 domenii:
 Actin-binding domain (aminoacizii 14-240)
 Central rod domain (aminoacizii 253-3040)
 Cysteine-rich domain (aminoacizii 3080-3360)
 Carboxy-terminal domain (aminoacizii 3361-3685).
Ca forma funcţională, distrofina apare asociată cu un complex proteic, cunoscut sub denumirea de
costamer sau DAPC (dystrophin associated protein complex) . Complexul proteic include sarcoglicani,
distroglicani, distrobrevină, sintrofine, sacospan, laminina-2, caveolin-2 [63].
Funcţiile distrofinei: Mecanice: Stabilizarea membranei în timpul ciclurilor contracţie-relaxare. Parte a
legăturii dintre citoscheletul intra-celular şi matricea extracelulară. Funcţionale: Joacă un rol în abilitatea fibrelor
musculare de a se diferenţia în tipul glicolitic rapid. Poate juca un rol în organizarea membranelor postsinaptice.

Proteina Distrofina are diferite localizări cum ar fi: în regiunea sub sarcolemală a muşchiului cardiac, are
o organizare periodică în costameri, o concentraţie crescută se întîlneşte la joncţiunile miotendinoase şi
neuromusculare, în muşchiul cardiac (asociat cu tubuli T), în muşchii netezi (discontinuă de-a lungul membranei,
alternând cu vinculina) [66].
1.1.5 Forme de distrofie musculară progresivă
Distrofiile musculare au fost definite ca un grup de tulburări genetice care evoluează cu atrofie şi slăbirea
progresivă a muşchilor acolo unde boala prinde îndeosebi muşchii, la nivelul cărora sunt prezente modificări
microscopice caracteristice
 1.1.6 Distrofia musculară Duchenne
Distrofia musculară Duchenne este o boală transmisă recesiv legată de cromozomul X, cu o incidenţă de
circa 1: 3300 nou-născuţi de sex masculin. Gena a cărei mutaţii determină distrofia musculară Duchenne a fost
identificată în 1986 fiind una dintre primele descoperiri majore care au evidenţiat potenţialul pe care îl are
medicina moleculară.
Primele simptome ale distrofiei apar, în general, la vîrste cuprinse între 3 şi 5 ani.Unul dintre cele mai
caracteristice simptoame este hipertrofia diferitor grupuri de muşchi: gastrocnemieni, deltoizi, fesieri. În special,
tipice sunt pseudohipertrofiile muşchilor gastrocnemieni (“pulpa gnomului”). Pseudohipertrofia fiind (conform
DEX) creşterea în volum a unei formaţiuni anatomice, fara hipertrofiere tisulară propriu-zisă, de ex. în cazul
muşchilor (p. musculară), prin infiltrarea adipoasă a acestora.
Pseudohipertrofiile muşchilor gastrocnemieni se dezvoltă precoce şi pe măsura progresării, au tendinţa spre
micşorare. Pseudohipertrofiile produc o impresie falsă de sănătate fizică [67].

Iniţial, atrofiile musculare se localizează în muşchii centurii pelviene, în sectoarele proximale ale membrelor
posterioare, iar ulterior se observă expansiunea lor în direcţie ascendentă spre centura scapulară, muşchii spinali,
zonele proximale ale membrelor superioare [67], [81].
Ridicarea din poziţia orizontală sau de pe scaun provoacă mari dificultăţi. Ridicându-se, bolnavii folosesc
metode ajutătoare (“căţărarea pe sine însuşi”, ”căţărarea în scară”). W.Gowers (1879) a descris o metodă deosebită,
utilizată de bolnavii cu DMP Duchenne în timpul ridicării, denumită ulterior “metoda lui Gowers” [12]. La
examinarea neurologică, chiar din faza timpurie a maladiei, se depistează diminuarea sau lipsa reflexelor rotuliene,
iar mai târziu şi a celor biceptale şi triceptale. Reflexele ahiliene, însă, se păstrează pentru o perioadă îndelungată
[9].
În stadiile timpurii ale maladiei, la bolnavii cu forma de îmbolnăvire DMP Duchenne, cele mai tipice
dereglări osteoarticulare sunt: scolioza, lordoza lombară, aplatizarea şi deformările cutiei toracice(“torace în
carenă”, “torace plat”). Pe măsură ce procesul miodistrofic progresează, se dezvoltă deformarea ecvinică a tălpilor
şi a contracturii în articulaţiile mari [12]. Investigaţiile din ultimii ani denotă că una din problemele serioase ce
apar la bolnavii cu DMP Duchenne este afectarea inimii. Prin cercetările efectuate de D.Adzija şi colab. în 1994,
s-a stabilit că în procesul patologic al DMP Duchenne, sistemul cardiovascular e implicat frecvent şi de timpuriu
[42].
Circa 73% bolnavi manifestă diverse patologii cardiace. Cauza patologiei vasculare constă în insuficienţa,
genetic determinată, a distrofinei în cardiomiocite [66]. La vârsta de 12 ani, cei mai mulţi pacienţi sunt imobilizaţi
în scaun cu rotile. Contracturile musculare devin fixe şi se dezvoltă adesea o scolioză progresivă, care poate fi
asociată cu un disconfort considerabil. Disformitatea toracică asociată cu scolioză perturbă funcţia pulmonară deja
diminuată de debilitatea musculară. În jurul vârstei de 16-18 ani, pacienţii sunt predispuşi la infecţii pulmonare
serioase, uneori fatale. Alte cauze de deces includ aspiraţia de alimente şi dilataţia gastrică acută [63].
Afectarea intelectului în distrofia Duchenne este frecventă; coeficientul de inteligenţă este cu aproximativ o
deviaţie standard sub medie. Deteriorarea funcţiilor intelectuale pare a fi neprogresivă şi afectează mai mult
capacitatea verbală decât performanţa intelectuală. Coeficientul de inteligenţă al pacienţilor cu boală Duchenne
este mai scăzut decât al copiilor cu boli cronice şi invalidante comparabile, indicând că intelectul subliminar în
distrofia Duchenne nu este numai reflectarea limitării fizice [70]. Nu s-a stabilit încă ce stă la baza acestei
perturbări a intelectului în distrofia Duchenne [42].
Pentru diagnosticare şi consultaţia medico-genetică, o mare importanţă o are depistarea precoce a maladiei.
Metoda cea mai optimă pentru investigaţiile screening este determinarea creatininfosfochinazei în serul sangvin. În
majoritatea publicaţiilor se indică faptul că, deja în primele 2-5 zile de viaţă a bolnavilor, activitatea acesteia în
sânge e ridicată de 50-100 ori faţă de normă [13].
Pe măsura progresării procesului miodistrofic, există tendinţa spre micşorarea activităţii
creatininfosfochinazei. După datele lui Y.Arai şi coaut. (1995), tomografia computerizată a muşchilor scheletici
indică zonele cu densitate scăzută în muşchii scheletici, semnele de atrofie musculară, micşorarea densităţii şi a
volumului ţesutului muscular pe măsura progresării procesului miodistrofic [26].
1.1.7 Metoda SALT-OUT modificată de extragere a ADN-ului.

1. Din eprubeta cu EDTA în care a fost colectat, sîngele este transferat în eprubetă sterilă de 15 ml (eprubetă de
lucru) [79].
2. Se adaugă soluţie tampon Erylysis (Erylysis-Buffer) până la 15 ml, se agită uşor.
3. Probele se lasă în stativ şi periodic se agită uşor până se observă o schimbare a culorii (culoare roşie metalică)
4. Se centrifughează timp de 10 minute la 4500r/min
5. Se aruncă supernatantul, dar se păstrează „granula” (acestea sunt celulele albe din sînge)
6. Se adaugă din nou pînă la 15 ml soluţie tampon Erylysis şi se resuspendează ’’granula’’ de pe fundul eprubetei.
7. Probele se lasă în stativ 10 minute, aproximativ la fiecare 2 min se agită uşor
8. Se centrifughează timp de 10 min la 4500r/min
9. Se varsă supernatantul dar se păstreză „granula”
10. Se adaugă din nou soluţie tampon Erylysis pînă la volumul de 15 ml şi uşor se resuspendă „granula” de pe
fundul eprubetei.
11. Probele se lasă timp de 10 minute în stativ, la fiecare 2 min se agită uşor.
12. Se centrifughează timp de 10 min la 4500 r/min
13. Se varsă supernatantul şi se păstreză „granula”
14. Se adaugă: 1 ml proteinaza K buffer, se dezbate „granula” , 50 μl SDS (20%), 5 μl proteinaza K (25mg/ml)
15. Se vortexează 15-20sec.
16. Probele se incubează la 37oC peste noapte
17. Se adaugă 300 μl NaCl 5M, se agită vortexează 15 sec.
18. Se centrifughează 10 min la 4500 r/min.
19. Se transferă supernatantul într-un tub nou de 15 ml.
20. Se adaugă 4 ml de etanol 96%, se agită uşor imediat prin răsturnarea uşoară a eprubetei.
21. ADN-ul alb ”se pescuieşte” cu pipeta şi se transferă într-un tub de 2 ml. În timpul acestei etape se
transferă cît mai puţin etanol.
22. În tubul cu ADN se adaugă 1ml etanol 70%, se centrifughează la 14.000 r/min, se decantează cît mai
mult etanol posibil. ADN-ul se usucă aproximativ 15 min.
23. Se dizolvă ADN-ul în 200 μl soluţie tampon TE (TE-Buffer), se dizolvă peste noapte, iar apoi se lasă
în frigider la 4oC cîteva zile. Apoi ADN-ul este depozitat în cutii special destinate pentru păstrarea ADN [75].
Compoziţia bufferilor utilizaţi în extragerea ADN
Denumirea Buferului: Reactivul Utilizat Concentraţia Cantitatea

1. Erylysis Buffer pH 7.4

NH4Cl 155 mM 41.45g
KHCO3 10mM 5g
EDTA 0.5M 0.1ml
H2O 500ml
2. Proteinase K Buffer
TrisHCl 1M 5ml
NaCl 5M 3ml
EDTA 0.5M 1ml
H2O 1000ml
3. TE Buffer pH 8.0
Tris 10mM 1.21 g
EDTA 1mM 0.37 g
1.1.8 Protocol de extragere a ADN-ului după set de extragere (extraction kit, QIAamp DNA Mini).
QIAamp DNA Mini prezintă o metodă simplă şi rapidă de extragere şi purificare a ADN-ului pentru un
PCR sigur. AND-ul total (genomic, viral, mitocondrial) poate fi purificat din sânge, plasma, ser, straturi
îmbogăţite cu leucocite (buffy coat), limfocite şi fluide ale organismului folosind o microcentrifugă.
Procedura QIAamp este potrivită pentru lucrul cu sânge integral proaspăt sau congelat și sânge care a fost
tratat cu citrat, heparină sau EDTA. Separarea prealabilă a leucocitelor nu este necesară. Purificarea nu necesită
nici o precipitare cu fenol/cloroform sau alcool și implică foarte puțină manipulare ( se foloseşte o
microcentrifugă).
Punct important înnainte de a începe:
 Toate etapele de centrifugare se realizează la temperatura camerei (15-25 oC).
Ce trebuie de făcut înnainte de a începe:
1. Aducem probele la temperatura camerei;
2. Punem la încălzit o baie de aburi sau un termostat la temperatura de 56 oC;
3. Echilibrăm Buffer AE sau apă distilată la temperatura camerei;
4. Ne asigurăm că Buffer AW1, Buffer AW2, şi Proteaza QIAGEN sunt deja preparate conform
instrucţiilor;
5. Dacă în Bufferul AL s-a format precipitat atunci el se va dizolva prin incubare la temperatura 56 oC;
Procedura:
1. Pipetăm 20 µl proteinază QIAGEN(sau K-proteinază) în eprubetă pentru microcentrifugă de 1.5 ml.
2. Adăugăm 200 µl de mostră în aceeiaşi eprubetă. Este de dorit să se colecteze mai mult de 200 µl din
sânge, plasma, ser, straturi îmbogăţite cu leucocite (buffy coat), limfocite şi fluide ale organismului. Dacă volumul
probei e mai mică de 200 µl, se adaugă un volum corespunzător de soluţie tampon.
3. La probă se adaugă 200 µl Buffer AL. Se amestecă prin vortexare timp de 15 s.
 4. Proba obţinută se incubează la 56 oC timp de 10 min.
5. După incubare eprubeta de 1.5 ml se centrifughează pentru ca să nu rămână picături pe capacul acesteia.
6. Se adaugă 200 µl etanol (96-100%) la probă şi se amestecă din nou prin vortexare timp de 15 s. După
vortexare se centrifughează puţin timp pentru a colecta şi picăturile de pe capac.
7. Mixul obţinut în etapa precedentă se adaugă atent la coloane de centrifugare (spin column QIAamp
Mini) în tuburi colective de 2ml fără a atinge marginea. Se închide capacul, şi se centrifughează la 8000 rpm timp
de 1 min. Apoi coloana se plasează în tuburi de colectare curate, special prevăzute, iar tubul utilizat anterior, cu
filtrat, se aruncă.
8. Atent se deschide coloana de centrifugare (spin column QIAamp Mini) şi se adaugă 500 µl de Buffer
AW1 fără a atinge marginile. Se închide capacul şi se centrifughează la 8000 rpm timp de 1 min. Apoi coloana se
plasează în tuburi de colectare curate de 2 ml, special prevăzute, iar tubul utilizat anterior, cu filtrat, se aruncă.
9. Atent se deschide coloana de centrifugare (spin column QIAamp Mini) şi se adaugă 500 µl de Buffer
AW2 fără a atinge marginile. Se închide capacul şi se centrifughează la 14000 rpm timp de 3 min.
10. Se recomandă: Se plasează coloana de centrifugare (spin column QIAamp Mini) într-un tub de colectare
curat de 2 ml (care nu este prevăzut în kit) şi se aruncă tubul cu filtrat precedent folosit. Se centrifughează
deasemenea la 14000 rpm timp de 1 min. Această etapă ajută la eliminarea Buffer-ului AW2 posibil rămas în
coloană.
11. Se plasează coloana de centrifugare (spin column QIAamp Mini) într-o eprubetă de 1,5 ml (care nu este
prevăzut în kit) şi se aruncă tubul utilizat anterior, cu filtrat. Atent se deschide coloana de centrifugare şi se
adaugă 200 µl Buffer AE sau apă distilată. Se lasă la incubat la temperatura camerei (15-25 oC) timp de 5-10 min
iar apoi se centrifughează la 8000 rpm timp de 1 min.
12. Apoi ADN-ul este depozitat în cutii special destinate pentru păstrarea ADN. Se păstrează la -20 oC.
1.2 Tehnica PCR
Reacţia PCR (Polymerase Chain Reaction = Reacţie de Polimerizare în Lanţ) este o metodă
de amplificare enzimatică in vitro a unei anumite secvenţe de ADN. În prezent a fost dezvoltată o adevarată
tehnologie PCR care este folosită într-o varietate foarte mare de domenii: biologie moleculară, ştiinţele mediului,
criminalistică, ştiinţe medicale, biotehnologie, microbiologie, industria alimentară, epidemiologie etc.
Din punct de vedere chimic, reacţia PCR este constituită din cicluri succesive de replicare a ADN în vitro,
folosind 2 primeri oligonucleotidici ce hibridizează cu cele 2 catene ale secvenţei originale (folosită ca matriţă în
replicare). Diferenţa esenţială între o asemenea reacţie de replicare şi un proces de replicare ADN in vivo, îl
reprezintă faptul că în reacţia PCR etapa de desfacere a dublului helix matriţă şi, respectiv, cea de ataşare a
primerilor, nu sunt realizate enzimatic, ci prin parcurgerea unor trepte de temperatură, iar singura enzimă folosită
în reacţie este o ADN polimerază ADN-dependentă (cu funcţie de replicază).
Principalele componente ale reacţiei sunt : ADN matriţă, o ADN polimerază termostabilă,
primeri oligonucleotidici, deoxinucleotidtrifosfati (dNTP), tamponul de reacţie, ioni de Mg++. O reacţie PCR este
formată din n cicluri (între 25 şi 40), în fiecare ciclu fiind parcurse 3 etape principale:
1. denaturarea termică a matriţei (deci, desfacerea dublului helix ADN);
2. ataşarea primerilor;
3. polimerizarea propriu-zisă.

Figura 2.2. Tehnica PCR.

La terminarea unui ciclu de replicare in vitro (de amplificare), cantitatea de ADN rezultată este dublă faţă
de matriţă. Mai mult, produsele rezultate într-un ciclu sunt folosite ca matriţă în ciclul urmator, astfel încât
numărul final de copii ADN este de 2n*y, unde y = numărul iniţial de copii, iar n = numărul de cicluri de
replicare. Este de subliniat faptul că moleculele acumulate exponenţial reprezintă copii ale matriţei care la capete
au încorporaţi primerii [39].
Prima raportare în literatura de specialitate a unui experiment de amplificare in vitro a unei secvenţe ADN
prin PCR a fost realizată de Kary Mullis în 1985. Ulterior, metoda a fost aplicată de către un grup de cercetători
de la Departamentul de Genetică Umană de la Cetus Corporation (SUA) pentru amplificarea secvenţei de ADN ce
codifică -globina umană şi pentru diagnosticul prenatal al anemiei falciforme. Initial, reacţia PCR folosea ca
replicază fragmentul mare (Klenow) al ADN polimerazei I de la Escherichia coli [55]. Această enzimă era însa
inactivată de temperaturile ridicate necesare etapei de denaturare a matritei. Ca urmare, la fiecare ciclu de
replicare trebuia adaugată enzimă “proaspătă”. Ulterior, a fost descoperită şi introdusă în reacţia PCR o ADN
polimerază
primeri termostabilă izolata iniţial dintr-o tulpină de Thermus aquaticus (bacterie termofilă izolată din
izvoarele termale Yellow Spring din SUA).
Un alt pas important în dezvoltarea tehnologiei PCR a fost procesul de automatizare care a condus la producerea
în prezent a unor aparate ce desfaşoară “singure” întreg procesul de PCR, parcurgând toate treptele de temperatură
în n cicluri.
1.2.1 Componentele reacţiei
a) Matriţa ADN. De cele mai multe ori, într-o reacţie PCR se introduc molecule de ADN linear/circular ce
include secvenţa de amplificat. Puritatea ADN introdus ca matriţă reprezintă un parametru important pentru
succesul unei reacţii PCR. De exemplu, cantităţi mari de ARN dintr-un extract ADN pot chelata ionii de Mg++,
determinând astfel o activitate scăzută a ADN polimerazei. Pe de altă parte, o serie de contaminanţi din extractul
ADN pot inhiba acţiunea ADN polimerazei.
Cantitatea de matriţă ADN introdusă într-o reacţie PCR influenţează puternic performanţa reacţiei.
Cantităţile recomandate pentru o reacţie PCR standard sunt: maximum 500 ng pentru ADN genomic uman, 1-10
ng ADN bacterian, 0.1-1 ng ADN plasmidial. Cantitatea ADN trebuie însă corelată cu numărul de copii de
secvenţă matriţă, aceasta depinzând de complexitatea moleculelor de ADN. Astfel, pentru un plasmid de 4 kbp din
care trebuie amplificată o secvenţă de 1 kbp, secvenţa matriţă reprezinta 25% din ADN introdus în reacţie. In timp
ce, o secvenţă tot de 1 kbp, dar dintr-un ADN genomic uman (specia umană având un genom de aproximativ
3.3*109bp), reprezintă doar 0.00003% din ADN introdus în reacţie. Ca urmare, pentru a avea acelaşi număr de
secvenţe matriţă, trebuie introdusă o cantitate de aproximativ 1 milion de ori mai mare în cazul ADN genomic
uman. Ca recomandare generală, se porneşte cu un minimum de 104 copii de secvenţă matriţă pentru a obtine un
semnal într-o reacţie PCR de 25-30 cicluri, având însă grijă ca, concentraţia finală de ADN în amestecul de reacţie
să fie mai mică sau egală cu 10 ng/μl.
b) ADN polimeraza termostabilă
În prezent în toate reacţiile de tip PCR se introduc ADN polimeraze termostabile. Variantele naturale ale
unor asemnea enzime au fost izolate din microorganisme termofile, care posedă echipamente enzimatice cu
temperaturi optime ridicate (mai mari de 700C) şi care sunt capabile să desfăşoare activităţile specifice şi după
treceri peste temperaturi extreme (în jur de 1000C). În marea majoritate a cazurilor, pornind de la asemenea
variante naturale, ADN polimeraze termostabile au fost manipulate genetic (cu obţinerea unor variante
ameliorate) şi clonate în tulpini de E.coli (microorganism ce este mult mai uşor de crescut şi manipulat decât
bacteriile termofile). În majoritatea experimentelor, cantitatea optimă de ADN polimerază termostabilă (sau de
amestec de ADN polimeraze) este cuprină între 0.5 şi 0.25 U/50 μl volum de reacţie.
c) dNTP (deoxinucleotidtrifosfaţi = dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Deoxinucleotidtrifosfaţii introduşi în
reacţie sunt folosiţi de către ADN polimerază în reacţia de polimerizare. În amestecul de reacţie se introduc
cantităţi echimolare din cele 4 tipuri de molecule; în caz contrar scade fidelitatea ADN polimerazei. Concentraţia
optimă a dNTP variază între 50 şi 500 μM (pentru fiecare dNTP), valoarea cea mai uzuală fiind 200 μM. Această
concentraţie trebuie corelată cu concentraţia Mg++. În cazul în care se doreşte obţinerea unor produşi de reacţie
PCR marcaţi (radiactiv sau neradioactiv), se introduc dNTP marcate.
d) Tamponul de reacţie (contine Tris-hidroxi-aminometan-ca substanţă amfoter - , şi MgCl2, necesar
funcţionării optime a ADN polimerazei termostabile). Există şi variante în care tamponul de reacţie nu conţine
Mg++, iar acesta este livrat separat, permiţând optimizarea concentraţiei ionilor de Mg++. Ionii Mg++ formează
complexe solubile cu moleculele dNTP pentru a produce substratul propiu-zis recunoscut de ADN polimerază.
Concentraţia ionilor de Mg++ este un factor crucial ce afectează performanţa oricărei ADN polimeraze. Astfel, o
serie de componente ale reacţiei de PCR (matriţa ADN, agenţi chelatori prezenţi în proba de ADN – cum sunt de
exemplu EDTA sau citraţii - sau diverse tipuri de proteine) pot scădea cantitatea ionilor liberi de Mg++, ceea ce
conduce la o activitate slabă sau chiar inactivitate a Taq polimerazei. Pe de altă parte, excesul ionilor de Mg++
reduce fidelitatea enzimei şi poate conduce la creşterea amplificărilor nespecifice. Concentraţia optimă de MgCl2
variază între 1 şi 5 mM, valoarea cea mai frecvent folosită fiind 1.5 mM (cu dNTP la concentraţia de 200 μM
fiecare). Mg++ influenţează activitatea enzimei şi creşte valoarea Tm a ADN. Excesul ionilor de Mg++ într-o
reacţie PCR poate creşte ataşările nespecifice ale primerilor. Din aceste motive este necesar a determina
concentraţia optimă de MgCl2 pentru fiecare reacţie PCR. Acest lucru poate fi realizat prin prepararea unei serii
de reacţii ce conţin diverse concentraţii de Mg++, între 1.5 şi 3.0 mM Mg++ (cu incremente de 0.5 mM), prin
adăugarea a 3, 4, 5 şi, respectiv, 6 μl dintr-o soluţie stoc de 25 mM MgCl2 la amestecuri de reacţie de 50 μl. Este
important de reţinut că în acest caz trebuie folosit un tampon de reacţie ce nu conţine MgCl2.
e) Primerii oligonucleotidici. In general, dimensiunea primerilor folosiţi în reacţiile PCR este cuprinsă între
15 şi 30 bp şi, de obicei, sunt complementari cu capetele 5’ şi, respectiv, 3’ ale regiunii ce urmează a fi
amplificată. Se recomandă ca primerii să aibă un procent molar de guanină + citozină (% mol GC) cuprins între
40 – 60% şi să aibă o distribuţie echilibrată a domeniilor bogate în A/T şi G/C. Este recomandabil ca cei 2 primeri
să aibă valori Tm care să permită temperaturi de ataşare între 55 şi 65 0C (pentru specificitate maximă se folosesc
temperaturi de 62-650C). Pe de altă parte, este ideal ca cei 2 primeri să aibă valori Tm identice sau foarte
apropiate şi să nu prezinte secvenţe cu complementaritate intracatenară (şi care, deci, să determine structuri
secundare interne). Totodată, pentru a se evita dimerizarea primerilor, este necesar ca primerii să nu fie
complementari unul cu celalalt. In general, concentraţiile optime ale primerilor într-o reacţie PCR sunt cuprinse
între 0.1 şi 0.6 μM.
Într-o reacţie PCR, un parametru important îl repezintă temperatura de ataşare a primerilor la matriţa ADN
(“primer annealing temperature”). Astfel, în cazul primerilor cu valori ridicate de Tm poate fi crescută
temperatura de ataşare a primerilor. Acest lucru conduce la minimizarea ataşărilor nespecifice, la reducerea
cantităţii de dimeri de primeri, precum şi la creşterea cantităţii de produs PCR corect. Pentru a determina valorile
Tm ale acizilor nucleici există numeroase formule. Pentru determinarea corectă a valorilor Tm ale primerilor, se
recomandă efectuarea reacţiei PCR la diverse temperaturi de ataşare, pornind de la o temperatură cu 5 0C mai mică
decât valoarea Tm calculată. În cercetare, sunt utilizate secvenţe de oligonucleotidelor. Utilizând programa on-
line „PrimerBlast”, ele au fost testate pentru a se controla alinirea corectă în regiunea căutată de pe ADN matriţă
şi pentru a se determina mărimea şi secvenţa produsului amplificării.
PCR-ul se efectuează în 25 µl soluţie de reacţie cu compoziţia: 0.2mM de fiecare dNTP (dATP, dTTP,
dCTP, dGTP), 0.6-0.7 U DreamTaq DNA Polymerase, 0.5-1 μg de ADN matriţă, 1mM de fiecare
oligonucleotid (forward primer şi reverse primer), 2.5μl de 10X DreamTaq™ Green Buffer ( KCl, (NH 4)2SO4,
20mM MgCl2) şi H20 nucleaze-free pentru volumul amestecului de reacţie de 25μl.
Secvenţele oligonucleotidelor (Fermentas) pentru diagnosticul SMA sunt reprezentate în tabelul 2.2.
Utilizând programa on-line „Primer Blast”, ele au fost testate pentru a se controla alinirea corectă în regiunea
căutată de pe ADN matriţă şi pentru a se determina mărimea şi secvenţa produsului amplificării. În cazul
diagnosticului molecular genetic al distrofiei musculare se utilizează secvenţe de nucleotide ale primerilor
pentru 79 exoni conform Ashton
Mini-review Diagnosticul Distrofiei musculare Duchenne: o privire în ansamblu Cucuruz Ioana , Florea Iulia
Alexandra Abstract Distrofia musculară Duchenne (DMD) este una dintre cele mai frecvente boli
degenerative, având o incidență de 1:3500-6000 de nou-născuți băieți . DMD este o boală genetică X-linkată
recesivă, astfel sunt afectați în principal băieții, dar au fost descrise în literatura de specialitate și cazuri mai
blânde de DMD la fete. Din punct de vedere fiziopatologic, DMD este cauzată de anomalii fie calitative, fie
cantitative ale distrofinei. Distrofina este o proteină care joacă un rol important în ceea ce privește
stabilitatea sarcolemei în timpul contracției musculare, fiind codificată de gena DMD. Această genă poate fi
afectată de mai multe tipuri de mutații: deleții, duplicații sau mutații punctiforme care au drept consecință nu
doar distrofia musculară Duchenne, ci și alte tipuri de distrofinopatii. Având în vedere că DMD are o cauză
genetică, aspectele clinice, imagistice și biochimice ale bolii sunt instrumente care pot să orienteze
clinicianul către un diagnostic, dar nu îi pot oferi certitudinea acestuia. Pentru a confirma suspiciunea de
DMD este absolut necesar să folosim metode de diagnostic genetic precum tehnica multiplex PCR (
Polymerase Chain Reaction ), tehnica MLPA ( Multiple Ligation Probe Amplification ) și tehnica aCGH
(Array Comparative Genomic Hybridisation ). Tehnica multiplex PCR este cea mai simplă metodă aflată
încă în uz, dar având în vedere faptul că nu detectează duplicații și nu poate fi utilizată pentru a detecta
femeile purtătoare, tehnici mai noi de analiză cantitativă a tuturor exonilor sunt de preferat. Printre aceste
metode se numără tehnica MLPA, o variantă a multiplex PCR mult mai frecvent utilizată datorită preciziei
sale, care oferă posibilitatea stabilirii unei strategii terapeutice specifică mutației identificate. În același timp,
această tehnică poate fi utilizată și ca metodă de screening prenatal sau pentru mamele purtătoare, permițând
inițierea precoce a unui tratament și ducând astfel la îmbunătățirea calității vieții pacienților care suferă de
DMD. Cuvinte cheie : distrofie, Duchenne, mutaţie, muscular, diagnostic, MLPA Introducere
Distrofinopatiile sunt cele mai întâlnite forme de distrofie musculară, cu debut in copilărie.1 Cauza acestor
patologii este reprezenată de existenţa unor mutaţii la nivelul genei DMD (cea mai mare genă umană
cunoscută) 2 . Această genă codifică o proteină numită distrofină, o proteină cheie în ceea ce priveşte
stabilitatea sacrolemei în timpul contracţiei musculare. - 2 - Distrofina este o proteină în formă de bastonaş
localizată la nivelul citoplasmei. Ea reprezintă o parte esenţială a complexului proteic care face legătura între
matricea extracelulară şi citoscheletul fibrelor musculare, complex adesea întâlnit sub numele de costamer şi
localizat la nivel sub sarcolemal. Costamerul are un rol extraordinar de important în transmiterea forţelor de
la nivelul sarcomerului către sarcoplasmă şi ulterior către matricea extracelulară, acesta fiind principiul pe
care se bazează menţinerea integrităţii sarcolemale, dar şi semnalizarea mecanică de la nivel celular. Alte
roluri pe care le îndeplineşte acest complex proteic sunt: modelarea creşterii miofibrilare şi a contracţiei.3
Între distrofii pot fi diferenţiate două mari fenotipuri : distrofia musculară Duchenne, o formă severă cu o
incidenţă de 1:3500-6000 de nou-născuţi băieţi 4 şi distrofia musculară Becker, o formă mai blândă cu o
incidenţă mai mică, 1:18.000 de nou născuţi băieţi 5 .DMD este o boală degenerativă cu transmitere recesivă
X-linkată.Există însă și mutații de novo( aproximativ o treime dintre mutațiile diagnosticate)6 .Totodată,
mutaţiile la nivelul genei DMD mai pot cauza distrofia musculară intermediară, dar si cardiomiopatia
dilatativă X-linkată 7 . Femeile, datorită celor doi cromozomi X, sunt protejate de acest tip de patologie fiind
doar purtătoare. Există însă şi cazuri în care femeile purtătoare ajung să prezinte afectări ale funcţiilor
cardiacă şi cognitivă ( acest fenomen se înâlneşte la 10% dintre femeile purtătoare)8-9. În general,
manifestările în cazul fetelor sunt mai blânde, dar au fost descrise în literatura de specialitate şi câteva cazuri
cu o severitate comparabilă cu cea existentă în cazul băieţilor.10 Mutaţiile identificate în cazul pacienţilor cu
DMD, BMD sau IMD sunt (în ordinea frecvenţei): 1. Deleţii exonice (65%); 2. Duplicaţii exonice (6-10%);
3. Mutaţii punctiforme: nonsense, frameshift, splice-site, pseudoexon, missense (fiecare tip de mutație
punctiformă intr-un procent mai mic de 4 %); 4. Rearanjamente complexe (aproximativ 2%).11-12 Aceste
mutaţii pot determina fie absenţa, fie modificări funcţionale ale distrofinei responsabile de intensitatea
manifestărilor clinice. Conţinut Pentru stabilirea diagnosticului de distrofie musculară Duchenne trebuie să
parcurgem mai multe etape. Iniţial, avem o suspiciune ridicată de existenţa unui istoric familial sau a unor
simptome specifice. Aceasta, odată confirmată, presupune efectuarea unor teste de screening ( de exemplu
măsurarea concentraţiei de creatinkinază serică)
Figura.3 este una orientativă, descriind în linii mari procedeul de diagnostic. Pentru o mai mare acurateţe
sunt necesare şi alte teste. De exemplu pentru pacienţii diagnosticaţi prin biopsie musculară este necesară şi
testarea genetică, în timp ce pentru pacienţii diagnosticaţi prin testare genetică, biopsia musculară este
opţională şi are rolul doar de a distinge între DMD şi o formă mai uşoară. Negativ Pozitiv Pozitiv Pozitiv
Negativ Negativ Negativ Concentraţii ale creatinkinazei serice mult crescute? DA Testul genetic pentru
mutaţii ale distrofinei DMD diagnosticată Biopsie musculară: distrofină absentă/scăzută NU Nu este DMD
Secvenţiere genetică: Mutaţie identificată Figura 3 5 Datorită complexităţii acestei boli şi datorită faptului că
această nu afectează doar bolnavul în sine, ci îi afecteză şi pe aparţinătorii acestuia, sunt importante de
menţionat următoarele aspecte demne de luat în considerare postdiagnostic: îngrijirea pacientului suferind de
DMD se face întrun cadru multidisciplinar, atât pacientul cât şi aparţinătorii pot beneficia de suport fie din
partea unui psiholog, fie din partea a diverse organizații non-profit. Diagnosticul DMD de certitudine se
bazează pe metode genetice, însă aspectele clinice şi datele de laborator nu sunt de neglijat, având un rol
important în orientarea clinicianului. 1. Diagnostic clinic În ultimii ani s-a încercat standardizarea evaluării
aspectelor clinice în vederea obținerii unui diagnostic cât mai aproape de adevăr, dar și pentru a putea evalua
cât mai precis prognosticul bolii. În majoritatea studiilor clinice se folosesc teste precum: 6 MWT(six
minutes walk test), NSAA( North Star Ambulatory Assessment)și altele.Aceste teste sunt utile, însă nu sunt
suficiente15 . Diagnosticul clinic porneşte de la evaluarea antecedentelor heredocolaterale care sunt deosebit
de importante, având în vedere modul de transmitere al DMD. Următorul punct care trebuie evaluat în
vederea obţinerii unui diagnostic clinic se referă la monitorizarea funcţiilor musculare. Printre semnele
clinice demne de luat în considerare se numără: slăbiciunea musculară progresivă simetrică observabilă între
1 şi 6 ani, momentul întârziat al debutului mersului (băieţii cu DMD încep să meargă mai târziu ), creşterea
în volum a muşchilor gambei (pseudohipertrofie), fenomen care duce la probleme în momentul în care
bolnavul aleargă, sare sau urcă scările. Alte semne clinice includ: slăbiciunea muşchilor şoldurilor şi
coapselor ( această slăbiciune duce la o modalitate de ridicare în picioare specifică celor cu DMD numită
manevra Gowers: copilul se va folosi de braţe şi de mâini pentru a se împinge şi a se ridica în picioare) şi
absenţa reflexelor osteotendinoase la nivelul musculaturii proximale. Din punct de vedere al durerii şi al
senzaţiilor, deteriorarea musculară caracteristică DMD nu este dureroasă, cu excepţia unor crampe tranzitorii
care se pot trata cu analgezice şi nu afectează nervii direct, astfel că se păstrează intact controlul asupra
musculaturii netede4 . Nu numai funcţia motorie este afectată de această boală, ci şi funcţia cardiacă şi
funcţia respiratorie. Astfel, lipsa sau calitatea scăzută a distrofinei pot duce la slăbirea muşchiului cardiac, cu
apariţia cardiomiopatiei care se agravează în timp, ajungând să fie chiar ameninţătoare de viaţă. În ceea ce
priveşte funcţia respiratorie, în jurul vârstei de 10 ani, muşchii respiratori încep să slăbească, fenomen urmat
de deteriorarea capacităţii respiratorii16. Secundar sunt afectate şi alte sisteme care includ organe precum:
vezica urinară 17, intestinele şi stomacul18 . Anormalităţile distrofinei caracteristice DMD se manifestă şi la
nivel cerebral, boala având astfel efecte şi asupra funcţiei cognitive. Este posibilă prezenţa semnelor de
întârziere în vorbire, prezenţa unui grad de incapacitate de a învăţa, ajungându-se până la retard mental
accentuat (în jur de o treime din cazuri)19. Principalele probleme se concretizează în dificultăţi în ceea ce
priveşte concentrarea, memoratul, atenţia, dar şi interacţiunea emoţională. 6 2. Diagnostic de laborator
Creatinkinaza este o enzimă care se găseşte în concentraţii crescute în muşchiul scheletic, în miocard şi în
concentraţii mult mai mici la nivel cerebral. Creatinkinaza are o structură dimerică şi apare sub patru tipuri:
izoenzimă mitocondrială şi trei tipuri de izoenzime citosolice : creatinkinaza MM-se găseşte în principal la
nivelul musculaturii scheletice, creatinkinaza MBspecifică muşchiului cardiac si creatinkinaza BB-
identificabilă la nivel cerebral20. La indivizii sănătoşi izoenzima citosolică MM este cea care dă nivelul
creatinkinazei totale. Aşadar, orice afectare musculară se va concretiza în modificări ale valorilor
creatinkinazei MM de diferite grade. Dezavantajul acestei analize este acela că modificarea nivelelor de
cretinkinază MM în sensul creşterii lor nu este suficientă pentru a confirma diagnosticul de DMD, dar poate
fi un punct de plecare în ceea ce priveşte viitoarea conduită a personalului medical. În evoluţie nivelul
creatinkinazei musculare scade odată cu progresia bolii. Comparând în timp analizele mai multor pacienţi cu
DMD, s-a observat că nivelul creatinkinazei musculare scade în fiecare an cu 8,7 % până la 18%, cu variaţii
interindividuale foarte mari21. Astfel acest parametru nu este unul absolut ci pentru a aprecia cât mai
aproape de realitate gradul de necroză, dar şi integritatea sarcolemei este necesară compararea cu valorile
anterioare ale pacientului în cauză. Creatinkinaza nu este singura enzimă care poate orienta diagnosticul.
Nivele crescute ale enzimelor hepatice (AST, ALT ) care nu sunt cauzate de alte organe suferinde pot fi de
asemenea un indiciu4 . (Într-un asemenea caz este de evitat biopsia hepatică în cazul unui băiat până la
excluderea diagnosticului de DMD). Biopsia musculară este indicată în cazul în care diagnosticul diferenţial
include DMD şi alte tipuri de distrofii musculare. Acest test presupune prelevarea unui fragment de muşchi
supus ulterior unor teste de imunohistochimie şi/sau de imunoblotting care vor evidenţia eventuala absenţă a
distrofinei. Evoluţia testelor genetice a dus la scăderea indicaţiilor biopsiei musculare. Electromiografia şi
studiile de conducere nervoasă nu sunt considerate astăzi necesare pentru o evaluare specifică a unui pacient
cu DMD, în schimb, în trecut, ele făceau parte obligatoriu din evaluarea copilului suspect de o boală
neuromusculară 4 . Din punct de vedere al analizelor de laborator, s-a identificat o afectare a trombocitelor.
Aceasta nu are ecou în viaţa de zi cu zi a pacientului cu DMD şi nu ridică probleme majore în ceea ce
priveşte intervenţiile minore, în schimb, în cazul unei intervenţii chirurgicale de mare anvergură nu trebuie
neglijate următoarele aspecte caracteristice pacienţilor cu DMD: creşterea uşoară a timpului de sângerare,
scăderea aderării plachetare, scăderea agregării induse de ristocetină şi scăderea expresiei glicoproteinelor
specifice trombocitelor (GPIIIb, GPIV), fenom 7 În studiile clinice în care se folosesc oligonucleotide
antisens simpla determinare a distrofinei nu poate fi considerată un parametru suficient pentru evaluarea
răspunsului la tratament, astfel încât este nevoie de o serie de alţi parametri care să indice evoluţia sub
tratament a pacientului, dar şi caracteristicile tratamentului25. Din punct de vedere imagistic pot fi uitilizate
tehnici de rezonanţă magnetică (RMI)26 sau tomografia cu emisie de pozitroni (PET)25. Absenţa sau
anormalitatea distrofinei, caracteristice pacienţilor cu DMD duc la alterarea complexului format în mod
normal de distrofină şi de glicoproteinele receptoare, fiind afectată legarea acestuia la matricea extracelulară.
Această legare defectuoasă conduce la o fragilitate crescută a membranei celulei musculare si creşte
susceptibilitatea celulei la leziuni induse de contracţie. Astfel de leziuni repetate se concretizează în
degenerarea şi necroza celulei care va fi în cele din unrmă înlocuită cu ţesut adipos şi ţesut conjunctiv.
Aceste modificări pot fi evidenţiate cu tehnici speciale de RMI. Se folosesc tehnici de imagistică cantitativă
pentru evaluarea progresiei bolii, dar si pentru evaluarea eficienţei tratamentului. Există studii conform
cărora RMI-ul cu Gandolinium poate fi uitilizat pentru vizualizarea mai exactă a fibrelor musculare cu
membrană defectuoasă 27-29 . Biomarkerii moleculari includ ADN, ARN, proteine, lipide, zaharuri, şi
metaboliţi, în timp ce din punct de vedere farmacocinetic putem aminti concentraţia de oligonucleotide
antisens în plasmă sau în muşchi. Pentru evaluarea farmacodinamică cel mai bun biomarker este distrofina.
Biomarkerii de boală includ profilul miRNA, parametrii de inflamaţie şi friboză, metalopeptidaza 930, iar cei
farmacogenetici se referă la SNPs(single nucleotide polymorphism). Biomarkerii de siguranţă sunt ALT,
trombocitele şi metaboliţii urinari25 . 3. Diagnostic genetic Folosirea metodelor genetice pentru descoperirea
mutaţiei DMD într-o probă de sânge reprezintă singura modalitate de punere a unui diagnostic de certitudine.
Testele genetice cel mai des uitilizate pentru identificarea mutaţiilor la nivelul genei distrofinei sunt: a.
Multiplex PCR31; b. Multiplex ligation dependent probe amplification (MLPA)32; c. Single condition
amplification- internal primer33-34; d. Multiplex amplifiable probe hybridization34; e. Array CGH
(comparative genomic hybridization)35; f. Full sequence analysis36 . Cauza principală a lipsei de distrofină
(în cazul DMD) sau a incapacităţii distrofinei de a-şi exercita rolul (în cazul DMB) este de ordin genetic şi se
referă la mutaţii de mai multe tipuri: deleţii a mai multor exoni în peste 65% din cazurile de DMD şi peste
85% din cazurile de DMB, duplicaţii ale unuia sau ale mai multor exoni în 6-10% din cazuri pentru ambele
tipuri de distrofie. Într-un procent mult mai mic (2% din cazuri) sunt întâlnite rearanjări complexe sau
mutaţii la nivelul intronilor, iar restul cazurilor sunt puse pe seama mutaţiilor punctiforme (mici inserţii sau
deleţii)11-12 . 8 Tetul multiplex PCR poate fi considerat o metodă de screening pentru deleţiile exonilor.
Acesta reprezintă metoda care a apărut şi s-a dezvoltat încă de la începuturile acestei maladii şi implică
folosirea ţintită a metodei pentru exonii despre care se ştie că suferă deleţii cel mai frecvent. Metoda a apărut
pentru prima dată în anul 1988, dar de atunci până în zilele noastre a fost constant îmbunătăţită şi astfel s-a
ajuns ca 98% din deleţii să fie identificate prin două seturi de PCR multiplex care identifică două puncte
sensibile ale mutaţiei37. Avantajul principal al acestei metode constă în simplitatea ei, în timp ce printre
dezavantaje se numără faptul că folosind această metodă nu se pot identifica deleţiile şi totodată nu pot fi
identificate femeile purtătoare38 . Testul MLPA este o variantă a PCR multiplex care permite ca mai multe
ţinte să fie amplificate cu o singură pereche de primeri. Acesta reprezintă o metodă de analiză cantitativă a
tuturor exonilor care alcătuiesc gena în cauză. Spre deosebire de tesul Multiplex PCR, această metodă
prezintă o mai mare sensibilitate în identificare mutaţiilor, detectează atât deleţii, cât şi duplicaţii şi poate fi
folosită şi pentru a diagnostica femeile purtătoare39 . Principiul tehnicii MPLA poate fi împărţit în scop
didactic în cinci paşi consecutivi descrişi în Figura 440 . Testul Array-CGH Array-CGH(comparative
genomic hybridization) este o metodă cantitativă care studiază gena DMD in toată complexitatea ei,
permițând evidențierea variațiior numerice apărute în interiorul genei prin diverse tipuri de mutații. Aceste
variații numerice sunt reprezentate de segmente de ADN de o kilobază sau mai mult care sunt prezente într-
un număr variabil la un individ în comparație cu un genom de referință41. Ele pot sau nu să fie evidente din
punct de vedere fenotipic. Inițial, metoda a fost utilizată pentru analiză citogenetică, însă, în prezent, datorită
dezvoltării tehnicii, ea poate fi folosită pentru diagnosticul molecular al DMD, dar și al altor patologii35 (
tumori solide42, întârzierea dezvoltării, retard mintal, anomalii congenitale multiple 43). Această metodă
permite obținerea unei hărți complete a variațiilor numerice în gena DMD. Particular este faptul că
analizează și regiunile intronice 3' și 5' care flanchează exonul studiat cu tehnica MLPA. Astfel, aCGH
permite detectarea rearanjamentelor complexe și a alterațiilor intronice. Totodată, evidențiază zonele
cromozomiale care delimitează defectele genetice (break points)44-45. Avantajul folosirii aCGH constă în
reducerea numărului de rezultate fals pozitive care pot fi date de polimorfismele unei singure nucleotide
(Single nucleotide polymorphism)35 . 1. Denaturarea ADN-ului şi hibridizarea probelor • fiecare prob din
ADN• se consider şi un primer universal care permite desf • la acestea se adaug timpul electroforezei între
probe 2. Reacţia de ataşare a kit-ului de ADN-ul de cercetat • cele două jum adiacente numai în prezen 3.
Amplificarea PCR • se realizeaz marcat fluorescent; • doar probele care s 4. Separarea ampliconilor prin
electroforeză • ampliconii au dimensiuni variabile în func de ADN-ul de cercetat, având astfel greut permit
separarea prin electroforez 5. Analizarea datelor • aria zonelor cu fluorescen fiecare probă este alcătuită
dintr-o secvenţă complementară -ul de cercetat; se consideră că fiecare probă are, de fapt, două jumătăţi de
prob i un primer universal care permite desfăşurarea Multiplex PCR la acestea se adaugă o secvenţă stuffer
care permite diferen timpul electroforezei între probe şi ADN-ul de cercetat cele două jumătăţi de probă sunt
capabile să recunoască secven adiacente numai în prezenţa unui ADN integru, fără nicio muta se realizează
folosind o singură pereche de primeri, dintre care unul este marcat fluorescent; doar probele care s-au legat
de secvenţa ţintă vor fi amplificate ampliconii au dimensiuni variabile în funcţie de numărul de probe legate
ul de cercetat, având astfel greutăţi moleculare diferite care permit separarea prin electroforeză capilară; aria
zonelor cu fluorescenţă detectabilă este comparată cu probe control Figura 4 9 complementară unui segment
ăţi de probă (5′ şi 3′) urarea Multiplex PCR-ului; stuffer care permite diferenţierea în ă secvenţe ţintă nicio
mutaţie; pereche de primeri, dintre care unul este vor fi amplificate; ărul de probe legate i moleculare diferite
care ă cu probe control. 10 4. Teste de screening Vârsta medie de diagnosticare actuală este de aproximativ 5
ani și încă nu este implementat niciun program de screening prenatal sau al nou-născuților la nivel național,
deși DMD este cea mai frecventă patologie degenerativă neuromusculară. Un astfel de program de screening
ar avea ca principale scopuri: să reducă perioada de așteptare a diagnosticului, să ajute la întocmirea unui
plan de îngrijire precoce din care să rezulte îmbunătățirea calității vieții pacientului, sau să permită mamei să
aleagă dacă păstrează sau nu fătul.În multe cazuri întârzierea unui diagnostic de certitudine ajunge la
aproximativ 2 ani,timp în care anxietatea si distressul părinților sunt crescute46 . La nivel mondial s-au
realizat programe de screening care au testat nivelul de creatinkinză din probe de sânge ale nou-
născuților.Spre exemplu într-un studiu amplu din Țara Galilor, la 5 zile după naștere se recoltează o probă
care dacă prezintă un nivel al CK>200 U/L se repetă și dacă și în duplicat este mai mare de 200 U/L se
realizează un triplicat. Dacă în cazul triplicatului CK>250 U/L se urmărește valoarea CK timp de 6-8
săptamâni de la naștere și dacă în continuare valoarea este crescută se suspicionează DMD46 . Tratamentele
cu glucocorticoizi sunt cel mai frecvent utilizate pentru ameliorarea simptomelor caracteristice DMD, fiind
utile în ceea ce privește încetinirea pierderii funcției musculare 47 . Acestea sunt cu atât mai eficiente cu cât
sunt începute mai devreme, de aceea este nevoie de elaborarea unor teste de screening de o specificitate și
sensibilitate mai mare pentru determinarea valorii CK, teste care să permită eliminarea în principal a
rezultatelor fals negative. Concluzii Distrofia musculară Duchenne este o patologie degenerativă care
necesită o diagnosticare certă și cât mai rapidă pentru a se putea asigura o îngrijire eficientă și o calitate a
vieții crescută. Având în vedere paleta largă de afectări ale diferitelor sisteme și organe putem concluziona
faptul că este nevoie de o intervenție multidisciplinară, atât în vederea stabilirii unui diagnostic, cât și pentru
tratament. Diagnosticul clinic și cel de laborator au strict valoare orientativă și necesită confirmare prin
stabilirea diagnosticului genetic. Prin utilizaraea analizelor de laborator se urmărește realizarea unui test de
screening sensibil și specific care să crească șansele detectării maladiei într-un stadiu precoce, oferind astfel
posibilitatea de a stabili un plan de tratament complex: ortopedic, cardiac, pulmonar, psihosocial, de nutriție,
de medicație. Diagnosticul genetic are rolul de a confirma boala și de a distinge între diferitele tipuri de
distrofinopatii. Acest aspect este important deoarece fiecare tip de patologie (DMD, DMB, etc.) are un plan
specific de trateament. Un test genetic negativ nu exclude complet diagnosticul de DMD dacă este asociat
unui context clinic relevant. În acest caz se recurge la secvențierea genomică ca ultimă etapă de confirmare a
diagnosticului. 11 Metodologie Pentru realizarea articolului de tip review intitulat „Diagnosticul Distrofiei
musculare Duchenne: o privire în ansamblu” am studiat un număr de 47 de articole scrise în perioada 1984-
2015. Cele 47 de articole au fost publicate în reviste de specialitate din diverse domenii medicale:
neurologie, pediatrie, genetică, medicină veterinară, gastroenterologie, biochimie, biologie celulară şi altele.
În acelaşi timp, pentru realizarea acestei lucrări am studiat articole atât de tip studiu de caz, cât şi review, dqr
şi studiu clinic. Prin aceast demers am încercat să obţinem o privire de ansamblu asupra a ceea ce înseamnă
stabilirea unui diagnostic de distrofie Musculară Duchenne atât pentru pacientu în sine, cât şi pentru
aparţinători. Pentru selecţionarea articolelor am recurs la paginile de internet http://www.ncbi.nlm.nih.gov/,
www.nature.com, www.elsevier.com, http://biblioteca.umf.ro şi www.uptodate.com. Am folosit mediul on-
line, datorită faptului că prin intermediul Bibliotecii UMF Carol Davila, am avut acces la toate aceste articole