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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA

CENTRO DE CIÊNCIAS NATUARAIS E EXATAS


PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – BIOQUÍMICA TOXICOLÓGICA
LABORATÓRIO DE BIOGENÔMICA

ESTUDO TRANSLACIONAL DO EFEITO


PROTETOR DO GUARANÁ (Paullinia cupana)
NA EXPOSIÇÃO AO METILMERCÚRIO
Thaís Doeler Algarve
Orientadora: Ivana Beatrice Mânica Da Cruz
Co-orientador: Toshiro Aigaki
INTRODUÇÃO

o O desenvolvimento biológico é sensível às variáveis ambientais


o Nutrição
o Estresse
o Drogas
o Poluentes ambientais

Mercury

(CLARKSON, 1997; RICE & BARONE, 2000) 2


INTRODUÇÃO

o 5 fases de desenvolvimento
o Embrionária
o Fetal
o Infância
o Fase reprodutiva
o Senescência

(WHO, 2017; GRANDJEAN & LANDRIGAN, 2006) 3


INTRODUÇÃO
o Complexidade no desenvolvimento do
cérebro humano
o Muito susceptível a interferências ambientais comparado ao
cérebro maduro ou qualquer outro órgão.

o Placenta à não é eficiente contra


poluentes ambientais
o A concentração de Hg no cordão umbilical pode ser
substancialmente maior que a do sangue da mãe

o Formação da barreira
hematoencefálica
o Até os 6 meses de idade
(GRANDJEAN & LANDRIGAN, 2006) 4
INTRODUÇÃO

oDentre os 10 produtos químicos de maior


risco à saúde humana, a OMS destaca os
elementos As, Cd, Pb e Hg.

o Sabe-se que as crianças à muito mais suscetíveis a


poluentes ambientais,

o Enzimas de desintoxicação são menos competentes

• Alterações na estrutura da cromatina ou do DNA


• MODIFICAÇÕES EPIGENÉTICAS
• MUTAÇÕES

(WHO, 2010, 2011; BITTO et al., 2014) 5


INTRODUÇÃO
o Em idosos
o Pb – doença renal, acidente vascular cerebral e uso de psicofármacos
o Cd – Aterosclerose
o Hg – uso de psicofármacos

o Conflitos éticos em avaliar efeitos epigenéticos em populações


o Uso de modelos animais

(RAMBOUSKOVÁ et al., 2014) 6


INTRODUÇÃO

o Metais “pesados” como o mercúrio (Hg) são conhecidos por sua


ação tóxica no organismo
o Metálico, Inorgânico e Orgânico
o MeHg é o mais neurotóxico
o Cérebro é o órgão mais suscetível

Oxidação Metilação

Hg0 Hg+1 ou Hg+2 HgCH3


Redução Desmetilação

oMeHg durante a gestação e o início da infância


o Desordens, disfunções sistêmicas e neurais.

(CLARKSON, 1997; RICE & BARONE, 2000) 7


INTRODUÇÃO

o Fontes
o Naturais
o Vulcões
o Solos ricos
o Incêndios
o Antropogênicas
o Termoelétricas
o Queimadas
o Aterros sanitários
o Uso e descarte irregulares (garimpo)

o Embora naturalmente presente no


meio-ambiente, a queima de carvão
(termoelétricas, queimadas) elevaram
muito sua presença no ecossistema.

(PSU ECOMERGE, 2015; FARELLA et al., 2006; WHO, 2007; ROULET et al., 1998, 1999, 2000a, 2000b) 8
INTRODUÇÃO

oEm 1953 a 1968, em Minamata – Japão


o Doença de Minamata

o 50.000 pessoas expostas


o 2.000 casos confirmados

• lesão cerebral, paralisia,


fala incompreensível e
delírios

• PARESTESIA DISTAL
ATÉ 30 ANOS APÓS
O FIM DA EXPOSIÇÃO

(EKINO et al., 2007; TAKIZAWA, 2009) 9


INTRODUÇÃO
o Japão

o Iraque
Graves sintomas, muitas vezes fatais
o Guatemala

o Paquistão
Surtos de contaminação via dejetos
industriais e grãos contaminados por
fungicidas Grão cobertos
com fungicida a
Farinha contaminada (pão) base de Hg

o Ilhas Faroé
Déficit cognitivo, entre outros
Alimentação à base de peixe o Nova Zelândia

Crianças sem sinais


o Republica das Seicheles
de intoxicação com níveis
elevados de exposição o Amazônia - Brasil

(EKINO et al., 2007; RUSTAM; HAMDI, 1974; ORDÓÑEZ et al., 1966; SKERFVING; COPPLESTONE, 1976; GRANDJEAN et al., 2010; AXELRAD et al., 2007) 10
INTRODUÇÃO

o tipo de mercúrio envolvido;

a dose;

Efeitos
a idade ou estágio de desenvolvimento da pessoa exposta (o feto é mais
variam suscetível);
com
a duração da exposição;

a via de exposição (inalação, ingestão ou contato dérmico).

(WHO, 2017) 11
INTRODUÇÃO

Estresso oxidativo

Interação com macromoléculas

Inflamação

Genotóxicos e epigenéticos

(SPILLER, 2018; GROTTO et al., 2011; OULHOTE et al., 2017; ALGARVE et al., 2013; KHAN et al., 2017) 12
INTRODUÇÃO

o Hipótese da “pandemia de toxicidade no


desenvolvimento”
o Poluentes amplamente disseminados no ambiente

o Fase de desenvolvimento neurológico é muito sensível

o Manifestações neurofisiológicas e neurocomportamentais em crianças


o QI reduzido, déficits de memória, de atenção, na linguagem e nas
habilidades motora fina e visual-espacial

o Importância em estudar formas de proteger o


neurodesenvolvimento infantil

(GRANDJEAN & LANDRIGAN, 2014; EPA, 2018 ) 13


INTRODUÇÃO

O que pode estar protegendo essas crianças?

(NATIONAL INSTITUTE FOR MINAMATA DISEASE, 1986; BOISCHIO; BARBOSA, 1993) 14


INTRODUÇÃO

o Paradoxo da dieta amazônica

o Altos consumidores de frutas (> 10 frutas/semana)


o laranjas (Citrus sp.), jambo (Eugenia sp.) e bananas (Musa paradisiaca)
• Menores concentrações de Hg no sangue e cabelo

o Açaí (Euterpe oleracea)


o Proteger a retina em ratos expostos ao MeHg
• Efeito antioxidante

o Óleo de peixe
o Protege o cérebro, rim, fígado e coração
• Efeito antiinflamatório

(HACON et al., 2008; BOISCHIO; BARBOSA, 1993; PASSOS et al., 2007; BRASIL et al., 2017; GROTTO et al., 2011) 15
INTRODUÇÃO

o Idoso da Amazônica e exposição ao MeHg


o Há poucas pesquisas com idosos amazônicos e intoxicação
pelo Hg, apesar de cronicamente expostos

o Em uma população com idade entre 40-87 anos


• Se reduz chances de catarata induzida por altos níveis de Hg

o Em uma população com idade entre 15-87 anos


• Se à melhor desempenho locomotor em altas concentrações de Hg

o No município de Maués, AM
o Alto consumo de peixe (1-2x ao dia)
o Alto nível de longevidade
o Boa aptidão funcional, equilíbrio e motora
o Baixa incidência de DCNT associado ao guaraná

(LEMIRE et al., 2010, 2011; COSTA KREWER et al., 2011; ANTONINI et al. 2016; RIBEIRO et al., 2013; MAIA-RIBEIRO et al., 2013) 16
INTRODUÇÃO

MANÁUS Maués

AM PA

MT
(BARBIERI & GARDON,
17
2009)
INTRODUÇÃO

Maués

(SANTOS, 2002) 18
INTRODUÇÃO

o Guaraná tem cerca de 2 to 7,5% de cafeína


o 4x mais cafeína que o café

o Cafeínaà efeito protetor contra o MeHg


o Ratos
o Drosophila melanogaster
o Neurônios (SH-SY5Y)

o Elevação de enzimas detoxicantes (CYP) e aumenta a produção de GSH


o Redução da excitotoxicidade
o Antioxidante

(BJÖRKLUND et al., 2007; ENGIN et al., 2017; RAND et al., 2012; SMITH & ATROCH, 2007) 19
INTRODUÇÃO
o Guaraná é habitualmente consumido pelos ribeirinhos
o Antioxidante;
o Antitumor;
o Antissenescência;
o Hipolipemiante;
o Anti-inflamatório;
o Antifadiga;
o Melhora da performance cognitiva.

o Protege contra os efeitos tóxicos


o Cd à ratos
o Paraquat à cultura de células
o Hg à em C. elegans

(BITTENCOURT et al. 2013; CADONÁ et al. 2016, 2017; MACHADO et al. 2015; SULEIMAN et al. 2016; KREWER et al. 2014; de OLIVEIRA et al. 20
2011; LEITE et al. 2011, 2013; BONADIMAN et al. 2017; ARANTES et al. 2016)
INTRODUÇÃO

o Linhagem celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y

o Muito utilizada para testar a


neurotoxicidade de metais pesados in
vitro

o Comparáveis aos neurônios com


relação às suas propriedades
morfológicas, neuroquímicas e
eletrofisiológicas

(FENG et al., 2016; ISHIHARA et al., 2016; JEBBETT et al., 2013; OHKUBO; MIYAMOTO; SHIRAISHI, 2016; TOIMELA; TÄHTI, 2004; UNOKI et al., 2016; ATCC, 2018) 21
INTRODUÇÃO

GENES DO DESENVOLVIMENTO HUMANO

Genes de segmentação e homeóticos são evolutivamente


conservados entre Drosophila e mamíferos

(PANDEY; NICHOLS, 2011) 22


INTRODUÇÃO
Período imaginal

Período Pré-imaginal

Metamorfose ao
corpo adulto

desenvolve-se a
Estágio
partir de células-
tronco
(Discos Imaginais)

2º Estágio
3º Estágio
(MORATA, 1993; REGULSKI et al., 1987; ALBERTS et al, 2002) 23
INTRODUÇÃO

o Drosophila melanogaster Núcleo Ovo fertilizado


Mosca Adulta (corte transversal)
o Modelo sensíveis e rápido

Clivagem
o Utilizado para avaliar Metamorfose Tempo após a
Blastoderma
fertilização*
neurotoxicidade e parâmetros 9
0 sincicial
60 Gema
comportamentais e funcionais, como o Pupa Núcleo
120 Estágios
Minutos*
sono e a locomoção 3-4
Dias*
180 Gastrulação
o Processos celulares fundamentais e Horas*
10 Embrião
mecanismo de desenvolvimento
Larva
conservados 24
Estágio 13
3º estágio
• Aproximadamente 75% dos genes Eclosão
humanos relacionados a doenças têm
homologia funcional com a mosca 2º estágio
1º estágio
* Incubando à 25°C

(RAND, 2010; PANDEY; NICHOLS, 2011) 24


OBJETIVOS

o Objetivos Gerais
o Realizar ou estudo translacional determinando o efeito da exposição ao
MeHg no ritmo circadiano da mosca-das-frutas D. melanogaster e o efeito
neuroprotetor do guaraná tanto nas alterações comportamentais e
neurotóxicas induzidas pela exposição ao MeHg nas moscas-das-frutas e em
células de neurais SH-SY5Y. Ainda, realizar um estudo transversal para avaliar
se o consumo de guaraná estaria protegendo uma população idosa
ribeirinha amazônica.

25
OBJETIVOS

o Objetivos Específicos
o Avaliar o efeito da exposição preimaginal de D. melanogaster ao MeHg
através da ocorrência de distúrbios neuromusculares e no sono-vigília
presentes na progênie de D. melanogaster obtida pela exposição parental
ou preimaginal ao MeHg;

o Analisar o efeito protetor do guaraná na neuro-oxi-inflamação de células


neurais SH-SY5Y e na toxicidade neurogênica (distúrbios neuromusculares e
no padrão sono-vigília) de D. melanogaster;

o Analisar o potencial efeito protetor do guaraná contra o Hg e a relação


com o Se na sobrevivência, neurotoxicidade motora e parâmetros gerais de
saúde em idosos ribeirinhos amazonenses com e sem consumo habitual de
guaraná.

26
RESULTADOS

DRUG AND CHEMICAL TOXICOLOGY


https://doi.org/10.1080/01480545.2018.1485689

RESEARCH ARTICLE

Parental and preimaginal exposure to methylmercury disrupts locomotor activity


and circadian rhythm of adult Drosophila melanogaster
Tha!ıs Doeler Algarvea,b,c , Charles Elias Assmanna,b , Toshiro Aigakic and
Ivana Beatrice M^anica da Cruza,b
a
Graduate Program in Biological Sciences: Toxicological Biochemistry, Federal University of Santa Maria, Santa Maria, Brazil; bDepartment of
Morphology, Laboratory of Biogenomics, Federal University of Santa Maria, Santa Maria, Brazil; cDepartment of Biological Sciences, Cellular
Genetics Laboratory, Tokyo Metropolitan University, Tokyo, Japan

ABSTRACT ARTICLE HISTORY


Methylmercury (MeHg) is a well-known toxic pollutant. However, little is known about the effects of Received 28 February 2018
this toxic agent in an adult as a consequence of a parental or preimaginal exposure. This study Revised 17 May 2018
used Drosophila melanogaster to investigate whether a parental or a preimaginal (eggs–larvae–pu- Accepted 30 May 2018
pae stages) exposure could impact parameters as viability, locomotor activity, and sleep patterns of 27
KEYWORDS
ARTIGO 1
Exposição Parental

Moscas adultas coletadas


Moscas
e transferidas para um
10 10 descartadas
novo meio saudável

10 10

Figure 1. General scheme


Moscas adultas expostas 24h Ovos (até moscas eclodirem)
of the parental and
Moscas transferidas para um Meio saudável
em meio com MeHg meio saudável (sem tratamento) em meio saudável preimaginal treatment
[0, 3, 6, 9 e 12µM] para ovipositar protocol. All treatments
received 0.09% DMSO
Exposição Preimaginal and used a corn-meal
medium. MeHg treatment
Moscas adultas coletadas range from 0-12 µM.
Moscas e transferidas para um
10
descartadas novo meio saudável
Drosophila melanogaster
was used here as an
10
experimental model.

Moscas adultas ovipositando Ovos (até moscas eclodirem) Meio saudável


por 24h em meio com em meio com MeHg
MeHg [0, 3, 6, 9 e 12µM] [0, 3, 6, 9 e 12µM]

Parental and preimaginal exposure to methylmercury disrupts locomotor activity and circadian rhythm of adult Drosophila melanogaster. Algarve et al., 2018. 28
RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 1
Figure 2. Egg-adult viability and egg
production in parental and preimaginal
exposure to MeHg. (A) Egg-adult
viability in 24 h of parental exposure
model. MeHg significantly decreased
the viability of flies from 9µM onward
when parents were previously exposed
to this toxicant during 24 h before
laying eggs. (B) Egg-viability in MeHg
preimaginal exposure. MeHg has a
significant impact on viability from 6 µM
onward. (C) Total egg production in
A B parental MeHg exposure and (D) Total
egg production in preimaginal
exposure. Results showed that no
difference was found compared to the
control group in each treatment.
Different letters indicate significant
differences (p ≤ 0.05) by one-way
analysis of variance followed by Tukey’s
post hoc test. Data are presented as
mean ± SEM.

C D
29
RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 1
M e H g P a re n ta l E x p o s u re Figure 3. Climbing ability assay of flies from
100 parental and preimaginal exposure. (A) Climbing
5 scheme. Flies were placed into a vertical vial (70 x

C lim b i n g p e r c e n t il e d is t r ib u t io n
80
25
50
10 mm), 5 flies per well, 40 per treatment and
75
95
repetition. Flies were simultaneously dropped and, 5 s
60
after this, a picture was taken. (B) Climbing percentile
distribution in parental exposure showed a dose-
40
response decrease in the 75th percentile. (C) Climbing
percentile distribution in preimaginal exposure
20
showed a dose-response decrease in the 50th
percentile (median value). (D) Parental and
0
0 3 6 9 12 preimaginal climbing ability response. Parental
A B exposed flies are represented as the 75th percentile
M e H g (µ M )

M e H g P a re n ta l E x p o s u re
(flies that were able to climb ≥ 6 cm) while
100
M e H g P r e im a g in a l e x p o s u r e P a re n ta l E x p o s u re P r e im a g in a l E x p o s u r e
preimaginal exposed flies are shown as the 50th
80 5
( > 6 cm ) ( > 5 cm ) percentile (flies that were able to climb ≥ 5cm, the
C lim b i n g p e r c e n t il e d is t r ib u t io n

80
25
median value). MeHg was able to significantly
50 40
C lim b i n g p e r c e n t il e d is t r ib u t io n

a
75 C lim b in g d is t r ib u t io n ( % ) a
decrease the climbing performance when flies were
60 95
60 b parentally-exposed and, also, significantly reduced
30
c c b b the locomotor activity of flies exposed in the
40
40
d
preimaginal period. Different letters indicate
20

c
significant differences (p ≤ 0.05) by Kruskal Wallis
2 02 0 analysis followed by Qui-square test and percentile
10
d distribution. Data are presented as median values or
0
0 0 3 6 9 12
percentiles.
0
0 3 6 9 12
0 3 6 9 12 0 3 6 9 12

C D
M e H g (µ M )
M e H g (µ M )
M e H g (µ M ) M e H g (µ M )

30
RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 1
Control 3 µM Control 9 µM
30 30
Sleep (min / 30min)

Sleep (min / 30min)


25 25

20 20

15 15

10 10

5 5

0 0
A 0 12 24 36 48 60 72 C 0 12 24 36 48 60 72

Time (hr) Time (hr)

Control 6 µM Control 12 µM
30 30

Sleep (min / 30min)


Sleep (min / 30min)

25 25

20 20

15 15

10 10

5 5

0 0

B 0 12 24 36 48 60 72 D 0 12 24 36 48 60 72

Time (hr) Time (hr)

Figure 4. Circadian rhythm in preimaginal exposed flies to MeHg. Sleep pattern during 72h has statistically changed by MeHg exposure. (A) 3 µM
(B) 6 µM (C) 9 µM and (D) 12 µM. White and black bars above the horizontal axis indicate light and dark cycles, respectively. Considering the whole
72h data analysis, at 6 and 9 µM was observed a significant increase in sleep time compared to the control group (p < 0.0001). When divided into
day periods, the nighttime period (black bars) from 6 µM onward (p < 0.0001) was shown a significant increase in sleep time compared to the
control. Statistical analysis was performed by Friedman test followed by Dunn’s post hoc test. Data are presented as mean ± SEM. 31
Average of 3 days
35
RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 1
30

25
Sleep (min/30 min)

20

15

10

0
B C
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
Time (h)

Control 3 µM 6 µM 9 µM 12 µM
A
Figure 5. Daily circadian rhythm, 3 days average analysis from flies
exposed to MeHg in the preimaginal period. (A) Sleep behavior 3 days
average. Boxes represented areas with a clear difference between
treatments and control group. (B) Sleep mean time from 2 to 7h showed a
significant decrease in sleep time compared to the control group. (C) Sleep
mean time from 18.5 to 24h showed a significant increase in sleep time
compared to control group. Asterisks indicate significant differences (p ≤
0.05) compared to the control group by two-way analysis of variance
followed by Tukey’s post hoc test. Data are presented as mean ± SEM. *p
B
≤ 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. C
32
Both results deserve to be discussed more in depth.
RESULTADOS E DISCUSSÃO –and 2 mg/kg
ARTIGO 1
effects (WHO
Table 1. Comparison of nighttime sleep time/30 minutes of Drosophila reared that exposur
in the preimaginal period at different MeHg concentrations.
present in fo
MeHg (mM)
et al. 2001,
Statistics Control 3 6 9 12 Therefore, hu
Nighttime 22! above
Mean ± SE 17.70 ± 0.68 18.49 ± 0.77 20.13 ± 0.76 20.94 ± 0.59 19.97 ± 0.62
Median 18.11a 19.75a 20.95b 20.89b 19.70b 0.7 –0.927 mg.
Minimum 6.000 5.500 5.969 12.22 6.125 (nothing else
Maximum 27.31 27.69 29.69 29.78 28.72
Lower 95% CI 16.34 16.94 18.61 19.77 18.74
larly exposed
Upper 95% CI 19.06 20.03 21.64 22.12 21.20 ingestion of
25% Percentile 13.02 12.69 13.79 16.70 16.45 Castro et al.
75% Percentile 23.20 24.64 25.55 25.45 24.00
mentioned a
SE: standard error; CI: confidence interval.
Different letters indicate significant differences (p # 0.05) by Friedman test toxic concen
followed by Dunn's post hoc test. cies, some c

33
RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 1

A B

Figure 6. Uninterrupted activity for 30 minutes (UA30) and uninterrupted sleep for 30 minutes (US30) of flies
exposed in the preimaginal period to MeHg. (A) UA30 in preimaginal exposure to MeHg significantly
decreased compared to MeHg and the impact of MeHg was more intense during the nighttime. (B) US30
decreased in the daytime and increased in the nighttime period from 6 to 12 µM. Different letters indicate
significant differences (p ≤ 0.05) by one-way analysis of variance followed by Tukey’s post hoc test. Data are
presented as mean ± SEM.
34
RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 1
0 12 0 12 0 ZT (h) 0 12 0 12 0 ZT (h)
Actogramas do 30 60 Actogramas da

Control
Control
20 40

Sono 10
0
20
0
Atividade
30 60
20
10
40
20
Supplemental material 1.
0 0
Actograms of 72h sleep
A 0 12 0 12 0 ZT (h) F 0 12 0 12 0 ZT (h) and activity data from 32
30
20
60
40
flies developed with or
without MeHg medium (0-

3 µM
3 µM
10 20
0 0
30 60
12 µM), showing the sleep
20
10
40
20
disruption along the days
and the decrease of
B G
0 0

activity caused by MeHg


0 12 0 12 0 ZT (h) 0 12 0 12 0 ZT (h)
30 60
exposure (A-E) Sleep
20 40 actograms and (F-J)

6 µM
6 µM

10 20
0 0 activity actograms. (A and
30
20
60
40
F) Control; (B and G) 3
10 20 µM; (C and H) 6 µM; (D
C 0
H 0
and I) 9 µM and (E and J)
0 12 0 12 0 ZT (h) 0 12 0 12 0 ZT (h) 12 µM. White and black
30 60
20 40 bars above the horizontal
9 µM

9 µM
10 20
0 0 axis indicate light and
30
20
60
40
dark cycles, respectively.
10 20 Sleep data are
D 0
I 0
represented as time
0 12 0 12 0 ZT (h) 0 12 0 12 0 ZT (h) (min/30 min), and activity
30 60 data are represented as
12 µM

12 µM
20 40
10 20 activity counts/30 min.
0
30
0
60
Data are presented as
20 40 mean values.
10 20
0 0

E J 35
ARTIGO 2

Thaís Doeler Algarve, Charles Elias Assmann, Francine Carla Cadoná, Alencar Kolinski Machado, Maria
Fernanda Manica-Cattani, Yukiko Sato-Miyata, Tsunaki Asano, Marta Maria Medeiros Frescura Duarte,
Euler Esteves Ribeiro, Toshiro Aigaki, Ivana Beatrice Mânica da Cruz

36
ARTIGO 2

10 ♂

10 ♀ 10 10 Moscas Troca de meio em


descartadas até 24h após eclosão

10 10

Moscas adultas expostas 24h Moscas ovipositando 8h em novo Ovos até o nascimento Moscas adultas para as
em meio padrão com 9µM MeHg meio com 9µM MeHg e Guaraná avaliações, mantidas em meio
e Guaraná (0, 1, 5, 10 e 20mg/mL)* (0, 1, 5, 10 e 20mg/mL)* padrão, sem tratamento

*Todos os tratamentos com 0,09% de DMSO, inclusive o controle. Avaliação da viabilidade,


atividade locomotora e circadiana

37
ARTIGO 2
Meio DMEM/F12
10% soro fetal bovino Células SH-SY5Y
1% penicilina/estreptomicina

37 ºC
MeHg e/ou
Umedecida Expostas 72h
Guaraná
5 % CO2 e 95% de O2

Avaliações de viabilidade,
formação de colônias,
citocinas inflamatórias, ...

38
RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 2

a b
Fig. 1 Egg-adult viability of Drosophila melanogaster treated with different guarana concentrations and
MeHg. (a) Viability of flies developed in cultures supplemented with guarana at different concentrations (0-
20 mg/mL); (b) Viability of flies developed in cultures supplemented with guarana at different concentrations
(1-20 mg/mL) plus 9 µM MeHg. Different letters indicated significant differences (p ≤ 0.05) by one-way
analysis of variance followed by Tukey’s post hoc test. Data are presented as mean ± SEM.

39
RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 2

c
Fig. 2 Climbing assay of flies developed in medium with MeHg
(9 µM) plus guarana concentrations (1-20 mg/mL). (a) Female
percentile distribution of climbing height values. (b) Male
percentile distribution of climbing height values. (c) Frequency
b (%) comparison of fruit flies that climbed > 50 mm among
different treatments. Different letters indicated significant
differences (p ≤ 0.05) by Chi-square statistical analysis.

40
RESULTADOS
Control 9µM MeHg
30 Control 9µM MeHg
30
25
25

Sleep (min / 30min)

Sleep (min / 30min)


Fig. 3 Circadian rhythm of flies developed in 9 µM MeHg, 20 guarana (1-20 20

mg/mL) and 9 µM MeHg plus guarana, under 12h light/dark 15 cycles. White 15

Boxes - light cycle; Grey boxes – dark cycle; Control group10 in black and 10 9 µM de MeHg
treatments in red lines. Statistical analysis was performed by Friedman test
5
5

followed by Dunn’s post hoc test. Data are presented as mean0 ±0 SEM. 12 24 36
0
48 60 72
0 12 24 36 48 60 72
Time (h)
Time (h)
Control Gua1 Control HgGua1
30 30 Control Gua1 Control HgGua1
30 30

25 25
25

Sleep (min / 30min)


25
Sleep (min / 30min)

Sleep (min / 30min)


Sleep (min / 30min)
20 20
20
Gua 1 mg/mL 9 µM de MeHg
20
15 15
15 15

10
10
10
10 + Gua 1 mg/mL
5 5
5 5

0 0
0 0
0 12 24 36 48 60 72 0 12 24 36 48 60 72
0 12 24 36 48 60 72 0 12 24 36 48 60 72

Time (h) Control Gua10 Time (h)


30 Control Gua10 Control HgGua10 Time (h)
Time (h)30 Control HgGua10
30 30
25 25
25
Sleep (min / 30min)

25

Sleep (min / 30min)


Sleep (min / 30min)

Sleep (min / 30min)


20
20 20
20 9 µM de MeHg
Gua 10 mg/mL 15 15

10
15

10 10
15
+ Gua 10 mg/mL
10
5 5
5 5
0 0
0 0
0 12 24 36 48 60 72 0 12 24 36 48 60 72
0 12 24 36 48 60 72 0 12 24 36 48 60 72
Time (h) Control Gua20 Time (h)
30 Time (h) 30 Control Gua20 Control HgGua20 Time (h)
30 Control HgGua20
30
25
25 25
Sleep (min / 30min)

9 µM de MeHg
25
Sleep (min / 30min)

Sleep (min / 30min)

Sleep (min / 30min)


20
20 20
20

Gua 20 mg/mL 15
15 15
15 + Gua 20 mg/mL
10
10 10
10
5
5 5
5
0
0 0
0 12 24 36 48 60 72 0
0 12 24 36 0 48 12 60 24 72 36 48 60 72
Time (h)
0 12 24 36 48 60
4172
Time (h) Time (h)
Time (h)
RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 2

a c b e d

b e d f
Fig. 4 Sleep behavior analysis of flies reared in guarana (1-20 mg/mL) and MeHg (9 µM) associated with guarana. US30 (a and b), UA30 (c
and d) and total sleep time (e and f) show a guarana impact on sleep behavior and its effect on MeHg sleep disruption pattern. US30
(uninterrupted sleep for 30 min), UA30 (uninterrupted activity for 30 min). Different letters indicated significant differences (p ≤ 0.05) by
one-way analysis of variance followed by Tukey’s post hoc test. Data are presented as mean ± SEM. 42
RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 2

a b
Fig. 5 Guarana cytoprotective effects on SH-SY5Y
human neural cells culture exposed to MeHg and
guarana for 72 h. (a) Effect of MeHg exposure at
different concentrations (0.03-9 µM); (b) Effect of
guarana exposure at different concentrations (50-1000
µg/mL); (c) Effect of MeHg (6 µM) exposure plus
guarana (100 µg/mL); MTT: mitochondrial metabolic
activity/cell viability. PG: cellular damage/mortality.
Different letters indicate significant differences (p ≤
0.05) by one-way or two-way analysis of variance
followed by Tukey’s post hoc test. Data are presented as
c mean ± SEM.

43
RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 2
Control MeHg
Fig. 6 Clonogenic assay performed in SHSY-5Y
neural cells exposed to 3 µM MeHg, 100 µg/mL
guarana and 3 µM MeHg plus 100 µg/mL guarana
for 7 days. Different letters indicate significant
differences (p ≤ 0.05) by one-way or two-way
analysis of variance followed by Tukey’s post hoc test.
Data are presented as mean ± SEM.

MeHg+Guarana Guarana

Fig. 7 Cytokines levels of SHSY-5Y neural cells


treated with 3 µM MeHg, 100 µg/mL guarana and 3
µM MeHg plus 100 µg/mL guarana for 72h.
Interleukin-1 beta (IL-1β); interleukin-6 (IL-6); tumor
necrosis factor alpha (TNFα); interferon gamma
(IFNγ); interleukin-10 (IL10). Different letters indicate
significant differences (p ≤ 0.05) by one-way or two-
way analysis of variance followed by Tukey’s post hoc
test. Data are presented as mean ± SEM.
44
RESULTADOS – ARTIGO 3
Plasmatic mercury levels of Amazonian Riparian Subjects and their potential association with health
factors and survival in 8 -years follow-up
Thaís Doeler Algarve, Charles Elias Assmann, Euler Esteves Ribeiro, Ednea Aguiar Maia-Ribeiro, Rafael Noal Moresco,
Verônica Farina Azzolin, Suziani da Cruz, Fábio Andrei Duarte, Paula Dalla Vechia, Toshiro Aigaki, Ivana Beatrice
Mânica da Cruz

o Coleta de sangue

Maués

o Entrevista estruturada
o Indicadores de saúde

Frequência Percentual
homem 248 45,9
mulher 292 54,1
PA Total 540 100
AM

Média SD
Idade 72,30 7,866

Idade Média SD
MT Homem 72,90 7,442
Mulher 71,79 8,184

45
RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 3
Table 2. Logistic regression to determine the influence of
biological and health indicator factors in the association
between higher levels of Hg, Se and 8-year riverine elderly
Table 1. Descriptive statistic of Hg, Se and Se/Hg ratio mortality.
Desvio Percentis Wald Risco 95% I.C. do Risco p
Média Padrão Mínimo Máximo 25º 50º (Mediana) 75º Relacionado
Hg (µg/g) 0.011 0.002 0.006 0.015 0.010 0.011 0.012 ao Hg
Idade 78.896 211.321 64.851-688.610 < 0.0001
Se (µg/g) 0.150 0.014 0.128 0.194 0.141 0.147 0.159
Sexo 29.053 0.037 0.011-0.123 < 0.0001
Se/Hg 14627 3045 8.80 22.67 12250 13846 17111 TBARS 0.844 1.020 0.977-1.065 0.358
AOPP 0.144 0.997 0.980-1.014 0.705
NOx 3.999 0.980 0.960-0.999 0.045
HAS 4.081 0.467 0.223-0.977 0.043
DCV 0.019 1.098 0.292-4.136 0.890
Colesterol 2.590 1.006 0.999-1.013 0.107
Constante 6.696 0.084 0.010
Relacionado
ao Se
Idade 0.233 1.131 0.686-1.867 0.629
Sexo 52.725 0.165 0.102-0.269 < 0.0001
TBARS 7.124 0.967 0.942-0.991 0.008
AOPP 2.698 1.008 0.998-1.018 0.100
NOx 5.907 0.987 0.977-0.997 0.015
HAS 7.053 1.862 1.177-2.945 0.008
DCV 0.859 0.647 0.257-1.625 0.354
Colesterol 0.016 1.0003 0.996-1.005 0.899
Constante 3.865 3.167 0.049

TBARS (lipídeos oxidados); AOPP (proteínas oxidadas); NOx (óxido


nítrico); HAS (hipertensão arterial sistêmica); DCV (doença
cardiovascular).

46
RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 3
Healthy Elderlies

Elderlies with some diagnosed diseases

Figure 2. General model to understand the effects of Hg and Se in health maintenance and they level in elderly
with a diagnosed disease. Data are presented as mean +/- SD. Significant differences (p < 0.05) by two-way
Anova followed by Bonferoni post hoc test. 47
RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 3
Disease prevalence

Figure 3. General model to understand the effects of Hg, Se and Se/Hg ratio in the prevalence of metabolic diseases. Healthy
individuals were considered as control. Metabolic Syndrome (MS); Systemic Arterial Hypertension (SAH); Type 2 Diabetes mellitus
(T2DM); Cardiovascular Disease (CVD). Data are presented as percentages. Significant differences (p < 0.05) by Kruskal-Wallis
analysis followed by chi-square test. 48
RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 3

A B

Figure 4. Mortality percentage among elderly riverine and the consumption of guarana. (A) Hg (0.011 µg/g); (B) Se (0.147
µg/g); (C) Se/Hg ratio. Data are presented as percentage. Significant differences (p < 0.05) by Kruskal-Wallis analysis
followed by chi-square test. 49
RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 3
Figure 5. Kaplan-Meier survival
curves for mortality in riparian
elderly by the influence of each
marker at their 50th percentile. (A)
Hg (0.011 µg.g-1), (B) Se (0.147
µg.g-1) and (C) Se/Hg (13.84 µg.g-
1).Dotted line: higher level, Full line:

lower level. Significant differences


(p < 0.05) by Kaplan-Meier survival
analysis.
p = 0,004 p = 0,363

A B

p = 0,020

C
50
RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 3
p = 0.004
Figure 6. Kaplan-Meier survival curves for mortality in
riparian elderly by the influence of different levels of Hg,
Se and Se/Hg ratio, all at 50th percentile, and with and
Control Guarana
without the combination of the effect of guarana. (A an B)
Hg (0.011 µg.g-1), (C and D) Se (0.147 µg.g-1) and (E
A B
and F) Se/Hg (13.84 µg.g-1). Control: no guarana intake;
Guarana: habitual intake (5 or more days/week). Dotted
line: higher level, Full line: lower level. Significant
p = 0.359
differences (p < 0.05) by Kaplan-Meier survival analysis.

Control Guarana

C D

p = 0.019

Control Guarana
51
E F
RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 3
p = 0.852 Figure 7. Kaplan-Meier survival curves for mortality in riparian
elderly by the influence of different levels of Se/Hg with and
without the combination of the effect of guarana. (A) 25th
percentile (12.25 µg.g-1), (B) 50th percentile (13.84 µg.g-1) and
Control Guarana (C) 75th percentile (17.11 µg.g-1) and combined with the
effect of guarana. Dotted line: higher level, Full line: lower
A level. Significant differences (p < 0.05) by Kaplan-Meier
B survival analysis.

p = 0.019

Control Guarana

C D

p =0.002

Control Guarana

E F 52
RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 3

Table 3. Results of Spearman correlation between Hg, Se and


Se/Hg biomarkers and motor tests outcomes. Hg (µg/L) Se (µg/L) Se/Hg ratio
Spearman's rho
Hg (µg/L) Se (µg/L) Se/Hg ratio (µg/L)
Spearman's rho Coef. de p Coef. de p Coef. de p
(µg/L)
Coef. de p Coef. de p Coef. de p Correl. Correl. Correl.
Correl. Correl. Correl. posição sentada -0.085 0.052 -0.042 0.338 0.063 0.151
Guaraná -0.070 0.105 0.214** 0.000 0.034 0.426 p/de pé
razão Se/Hg (µg/L) -0.836** 0.000 0.081 0.063 1.000 . posiconar 0.097* 0.029 0.003 0.943 -0.086 0.051
sexo 0.181** 0.000 0.401** 0.000 -0.007 0.866 alternadamente no
idade -0.571** 0.000 -0.373** 0.000 0.355** 0.000 degrau
Grupo etário idoso -0.716** 0.000 -0.415** 0.000 0.459** 0.000 permanecer em pé 0.026 0.547 0.044 0.312 0.022 0.618
Hg (µg/L) 1.000 . 0.345** 0.000 -0.836** 0.000 com um pé na frente
Se (µg/L) 0.345** 0.000 1.000 . 0.081 0.063 permanecer em pé 0.053 0.228 0.080 0.070 -0.049 0.263
equilibrio unipodal -0.022 0.661 0.059 0.234 0.060 0.225 sobre um pé
direito Circunf. braço reto -0.084 0.053 -0.007 0.875 0.086* 0.048
equilibrio unipodal 0.001 0.994 0.010 0.932 -0.049 0.692 Circunf. braço -0.092* 0.033 -0.018 0.673 0.099* 0.023
esquerdo contraído
agilidade e equilibrio 0.086* 0.050 -0.007 0.882 -0.091* 0.039 Circunferência -0.106* 0.014 -0.037 0.395 0.100* 0.021
dinamico (TUG) cintura
TUG 2 0.088 0.228 0.125 0.085 -0.004 0.957 Circunferência -0.080 0.066 0.015 0.737 0.080 0.065
forca dos membros 0.001 0.986 0.032 0.472 0.016 0.718 quadril
inferiores Rel. cintura/quadril -0.068 0.115 -0.064 0.139 0.064 0.137
capacidade -0.020 0.665 -0.014 0.760 0.004 0.934 Gordura subcutanea -0.045 0.304 -0.039 0.370 0.033 0.448
aerobica (marcha (escapular/triceps)
estacionaria) Circunferência coxa -0.096* 0.027 0.014 0.739 0.116** 0.007
forca dos membros -0.037 0.416 0.065 0.155 0.068 0.134 Circunferência -0.103* 0.017 -0.020 0.642 0.112** 0.010
inferiores panturrilha

(Continua ao lado) ** Correlação é significativa no nível 0,01 (bicaudal); * Correlação é


significativa no nível 0,05 (bicaudal). 0.000 = < 0.0001 53
DISCUSSÃO

o Consumo de atum ou outro peixe cozido ou assado

o Inversamente proporcional com a incidência de acidente vascular cerebral esquêmico

Atum é um peixe carnívoro,


frequentemente associado a
altos níveis de Hg do atum...
Mas neste estudo,
aparentemente não
houve prejuízo à
saúde...

(MOZAFFARIAN et al., 2005) 54


CONCLUSÕES

o O MeHg afetou o desempenho locomotor na exposição parental e preimaginal


e o ritmo circadiano na exposição preimaginal de Drosophila, além de ambos
os protocolos afetarem a viabilidade. Estes resultados corroboram a hipótese da
ocorrência de uma pandemia causada pela exposição ao MeHg associada a
distúrbios do sono em seres humanos;

o O guaraná foi capaz de proteger do dano do MeHg no desempenho


locomotor, o ritmo circadiano e a viabilidade quando Drosophila foram
expostas durante todo o desenvolvimento (desde o período parental até o fim
do preimaginal). Estes resultados corroboram a hipótese de que os efeitos
tóxicos causados pela exposição ao MeHg poderiam ser atenuados pela dieta
amazônica;

55
CONCLUSÕES

o Em cultura de células neurais SH-SH5Y, o guaraná foi capaz de atenuar os


efeitos do MeHg na citotoxicidade e resposta inflamatória (aumento da IL-1b, IL-
6, TNFa, IFNg e redução da IL-10). O conjunto destes resultados sugerem que o
mecanismo causal relacionado ao efeito protetor do guaraná a exposição ao
MeHg envolve ação antioxidante e anti-inflamatória nas células neurais.
Aumento da chance de risco em idosos relacionado com hipertensão e os
níveis de Hg;

o Em idosos ribeirinhos, o risco associado a níveis elevados de Hg plasmático é


reduzido em mulheres e em idosos que consomem guaraná, mas elevado com
a idade e com a presença de alguma doença associada (voluntário não
saudável);

56
CONCLUSÕES

o Risco de ter Hg plasmático elevado é maior em homens que não consomem


guaraná, independente da idade e doença associada (voluntário não
saudável). Ainda, quanto maiores os níveis de Se, maiores as chances de risco
quando o Hg está baixo;

o O guaraná reduziu o risco do Hg independentemente da idade e de ter


alguma doença associada, levando em consideração o sexo, níveis de óxido
nítrico e AOPP.

57
REFERÊNCIAS
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AGRADECIMENTOS

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Obrigada pela atenção!

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