Fisiología y fisiopatología de los anticoagulantes

naturales

Centro Emofilia e Trombosi «A. Bianchi Bonomi»,

Universita degli Studi di Milano e ERCCS Ospedale Maggiore Policlinico.
Via Pace, 9, 20122 Milán, Italia

1 Introducción
Como sucede con otros sistemas enzirnáticos, la respuesta procoagulante
está modulada por múltiples mecanismos reguladores. Así, mientras que
algunos de estos mecanismos se corresponden con los sistemas generales
de control de las reacciones enzimáticas (mecanismos de retroalimenta-
ción positiva y negativa, amplificación, disminución), se han investigado
y descrito mecanismos reguladores complejos y específicos, entre los que
se encuentran el sistema de la proteína C-proteína S, la antitrombina 111,
el co-factor heparínico 11, el inhibidor de la vía del factor tisular y otros
componentes de la vía fibrinolítica. Solamente se ha demostrado una
íntima asociación entre las trombosis espontáneas, que se desarrollan a
una edad temprana, y las alteraciones del sistema de la proteína C-
proteína S y antitrombina 111; sin embargo, se han descrito casos esporá-
dicos de deficiencia de los otros anticoagulantes indicados en enfermos
con diátesis trombótica. La deficiencia de proteína C,- proteína S y
antitrombina 111 no basta para desencadenar el fenómeno trombótico,
como lo demuestra el hecho de que algunos sujetos con estas deficiencias
se encuentran asintomáticos; sin embargo, representan un factor de riesgo
de trombosis, cuya manifestación es la consecuencia final de un proceso
multifactorial. En este capítulo se describe brevemente la fisiología del
sistema de la proteína C-proteína S y de la antitrombina 111, subrayando
de manera especial la relación entre estructura y función de los distintos
componentes de los dos sistemas.

2 Antitrombina 111

2.1 Características generales

La antitrombina 111 es el principal inhibidor plasmático de la trombina
humana (1). Posee actividad inhibitoria frente a los factores IXa, Xa y
XIa, además de la tripsina. Se trata de una glucoproteína de cadena única
con un peso molecular de 58,2 kd; la glucosilación afecta fundamental-
2 E. M. Faioni
mente a los 4 residuos Asn. La mayor parte se sintetiza en el hígado
(aunque también en el riñón); la proteína madura contiene 432 aminoá-
cidos. La concentración plasmática es de 2,3 pm (125 yglml). La AT 111
forma parte de una superfamilia de proteínas conocidas como «inhibido-
res de las proteasas de serina» o aserpinasn (2) entre las que se encuen-
tran la al-antitripsina, la ovoalbúmina, el angiotensinógeno, el inhibidor
del activador del plasminógeno-1 (PAI-1) y el inhibidor de la proteína C
activada (PAI-3). Posiblemente, estas proteínas tienen un origen evoluti-
vo común y se piensa que derivan de una molécula ancestral de hace
aproximadamente 300-600 millones de años. Los miembros de la familia
de las serpinas con actividad inhibitoria poseen un mecanismo similar de
inhibición en dos etapas. En la primera etapa se forma un complejo débil
entre el inhibidor (que actúa como «falso» sustrato y la proteasa).
Después, se establece un enlace covalente entre el sitio reactivo del
inhibidor y el residuo serínico del sitio activo de la proteasa. La especi-
ficidad de la serpina depende, en parte, de los residuos situado en los
lugares reactivos, que se denominan P, y P,'. Numerosas serinas contie-
nen Arg como residuo P,, incluida la AT 111, que contiene una Ser en
posición P,'. Cuando la AT 111 inhibe la trombina, se forma inicialmente
un complejo de baja afinidad con una estequiometría 1:1 y una semivida
prolongada de inhibición; la trombina escinde el enlace Arg-393 --Ser-
394 de la AT 111. Por consiguiente, se produce una modificación en la
conformación del inhibidor que atrapa la enzima, estableciéndose un
enlace covalente y estable (1).

SITIO
REACTIVO
Fig. 1. Esquema de la estructura de la antitrombina 111. Se muestran los residuos P, y P,'
en las posiciones 393 y 394, respectivamente, y las probables regiones de unión a la
heparina (modificado de: The Molecular Basis of Blood Diseases (1987). Eds. J.
Starnatoyannopoulos, A.W. Nienhuis, P. Leder, P.W.Majerus, pág. 534, W.B. SAUN-
DERS Co., Filadelfia).
 Fisiología y fisiopatología de los anticoagulantes naturales 3
Existe una notable analogía en la estructura cercana al sitio reactivo
de los diferentes miembros de las serpinas; se trata de una estructura
prominente y móvil en el plano tridimensional (1, 2). En cambio, en las
demás zonas de la molécula se aprecian diferencias considerables, que
guardan relación con la función específica de las diferentes serpinas. Así,
la AT 111 tiene una zona que actúa como lugar de unión a la heparina
(región de unión a la heparina). De acuerdo con estudios recientes,
basados en mutantes recombinantes, la región mínima esencial para la
unión a la heparina se sitúa entre los residuos 90 y 160 (en esta región
se encuentran residuos con carga positiva como Arg y Lys) mientras que
la zona situada hacia el extremo aminoterminal (residuos 41-49) posible-
mente modula la interacción, pero no puede, por sí misma, mantener el
enlace (2). Estas dos regiones de la conformación tridimensional de AT
111 se encuentran adyacentes y configuran la región de unión a la
heparina. En la figura 1 se muestra un esquema de AT 111, en donde se
representan las principales regiones de la proteína, el sitio reactivo y la
región de unión a la heparina.

2.2 Importancia de la heparina

La formación del complejo trombina-ATIII se multiplica, al menos, por
un factor de 1000 en presencia de la heparina, que reduce considerable-
mente la semivida de inhibición (1, 2). La heparina actúa de forma
catalítica y su efecto como co-factor se manifiesta también en la inhibi-
ción de los factores Xa y XIa, pero no por las proteasas del sistema de
contacto. Se ha comprobado que el fragmento de heparina más pequeño
con actividad de co-factor frente al factor Xa es un pentasacárido que
contiene determinados grupos sulfato (3-O-glucosaminasalfato)que inte-
raccionan con los residuos de lisina y arginina de la región de unión a la
heparina de AT 111 (3). Esta interacción provoca una alteración en la
conformación del sitio reactivo de la AT III que favorece la reacción
inhibitoria. El fragmento más pequeño de heparina con actividad anti-
trombínica es un octadecasacárido; la heparina debe unirse tanto a AT 111
como a la trombina (1). La actividad anti-Xa y antitrombínica de la
heparina depende de la concentración de calcio iónico y, entre otros
factores, de la longitud de la cadena heparínica.
Como la heparina no tiene una disponibilidad in vivo como tal
molécula, al principio se dudaba si su efecto como co-factor de la AT 111,
observado en condiciones in vitro, poseía realmente significado fisiológi-
co. Las investigaciones efectuadas por distintos laboratorios (4, 5 ) han
revelado que una sustancia parecida a la heparina, el sulfato de heparán,
es expresada por las células endoteliales y acelera la inhibición in vivo de
las proteasas de la coagulación mediada por AT 111. El sulfato de heparán
también contiene un residuo 3-O-glucosaminasulfato, característico del
pentasacárido heparínico responsable de la unión a AT III.
 E. M.Faioni
2.3 Biología molecular
A finales de los años 60 se observó una íntima asociación entre la
deficiencia congénita de AT 111 y la trombosis. Prácticamente el 2-5% de
los pacientes con trombosis juvenil mostraban una deficiencia de AT 111;
la prevalencia del déficit en la población general es de 1:2.000 a 1:5.000,
según los diferentes estudios, si bien en las investigaciones más recientes
se ha observado una prevalencia mayor (6, 7). Las deficiencias pueden
ser de tipo cualitativo o cuantitativo. Se han realizado numerosas tenta-
tivas de clasificación de estas deficiencias, de acuerdo con los datos
fenotípicos. La clonación del cDNA y la determinación de la estructura
génica y proteica de la AT 111, junto con los estudios sobre la disfunción
de AT 111 en los enfermos, ha permitido que se conozca mejor la relación
entre estructura y función de la proteína. Además, el conocimiento de la
bases moleculares de la deficiencia de AT 111 puede modificar, al menos
en parte, la clasificación, que debe basarse en los defectos genéticos
observados mediante la técnica de biología molecular, en lugar de las
características fenotípicas.
El gen de la AT 111 se encuentra en el cromosoma 1 (q) y contiene
7 exones y 6 intrones, distribuidos entre las 19 kilobases del DNA. Se
observa una cierta tendencia en el gen de la AT 111, como ocurre con
otros genes, a que los intrones se sitúen entre los confines de diversos
dominios estructurales de la proteína. Hasta la fecha, en los estudios de
la deficiencia de AT 111 se han hallado mutaciones en el sitio reactivo y
en el dominio de unión a la heparina (7, 8). Aplicando diferentes
metodologías, se han descrito detalladamente las mutaciones que condu-
cen a la sustitución de un solo arninoácido en el residuo P, del sitio
reactivo, como por ejemplo Arg-393 + Cys, His, Pro o bien del residuo
P,' como por ejemplo Ser-394 + Leu o incluso mutacionei puntiformes
de codones altamente conservados de otras regiones del gen (7, 8). Los
estudios relativos a las mutaciones del dominio de unión a la heparina que
se asocian a un déficit fenotípico con una baja prevalencia de trombosis en
la forma heterocigótica, son muy interesantes (7, 8). Se han descrito
mutaciones del residuo Arg-47 y Pro-41 que se asocian a una menor unión
a la heparina, lo que confirma la importancia de estos aminoácidos en la
formación del complejo con la heparina. Recientemente se han investiga-
do también otras dos mutaciones de residuos que se hallan en la región
de unión a la heparina (9). La base molecular de las deficiencias de AT
111 se comenta con más detalles en otro capítulo de esta obra.

3 Sistema de la proteína C-proteína S

El «sistema de la proteína C-proteína S», denominado así por razones de
comodidad en este capítulo, es un complejo de proteínas con actividad
enzimática o de co-factor que inhibe a los principales co-factores de la
 Fisiología y fisiopatología de los anticoagulantes naturales 5
vía procoagulante, VIIIa y Va, limitando la actividad coagulante del
complejo activador del factor X y del complejo activador del factor 11,
respectivamente. Este sistema está formado por un cimógeno, la proteína
C, un co-factor soluble, la proteína S y una proteína de membrana, la
trombomodulina, que posee un receptor endotelial para la trombina (10,
11). La proteína de unión a C4b, una proteína reguladora del complemen-
to, debe considerarse parte del sistema por su interacción con la proteína
S. La figura 2 ilustra de manera esquemática las interacciones entre los
distintos componentes, cuyas características bioquímicas y moleculares
se expondrán con mayor detalle en los siguientes párrafos.

Membrana celular

Fig. 2. Esquema del sistema de la proteína C-proteína S. La trombina (T) se une a la

trombomodulina (TM), con lo que se activa la proteína C (PC); durante la activación se
desprende un pequeño ptptido de la cadena pesada. La protelna C activada (APC) ejerce
su efecto anticoagulante formando un complejo con el co-factor proteína S (PS). C4b-BP,
representada como una estructura aracnoidea, se halla en equilibrio dinfímico con la
proteína S y regula su función como co-factor.
(La figura no pretende representar las proporciones ni las dimensiones reales de las
distintas proteínas).

3.1 Proteína C
La proteína C (PC) es una glucoproteína de 62 kd, con una concentración
plasmática de 50-80 nM (3-5 pglml). Se activa fisiológicamente tras la
6 E. M. Faioni
unión de la trombina a la trombomodulina (en la superficie endotelial), en
presencia de calcio. La trombina escinde el enlace Arg-169-Leu-170 de
la proteína C. Una vez activada, la APC determina una proteólisis de los
factores VIIIa y Va en la membrana biológica (12).
La figura 3 muestra un esquema de la estructura de la proteína C. La
PC se compone de 444 aminoácidos, de los cuales 42 componen la
secuencia denominada pre-proleader. Esta secuencia aminoterminal se
separa antes de que se segregue la molécula madura. De acuerdo con
algunos estudios recientes, el péptido pre-leader está formado por 18
aminoácidos y es sumamente hidrófobo. Su función se relaciona con la
secreción correcta de la PC madura. Este péptido se separa cuando se
recibe una «señal dipeptidasa» durante la síntesis del polipéptido (13). El
polipéptido compuesto por 24 aminoácidos contiene residuos sumamente
conservados en las distintas proteínas de la coagulación: los residuos
situados entre -12 y -17 son esenciales para la y-carboxilación de los
primeros 9 residuos de ácido glutámico de la PC (v. más arriba). Los
residuos -1 a -4 son, en cambio, muy importantes para la escisión de la
secuencia pro-leader por parte de una proteasa parecida a la tripsina. La
PC circula fundamentalmente como una proteína de cadena doble (la
cadena ligera tiene un peso molecular de 21 kd y la pesada de 41 kd,

PÉPTIDO DE AC

SECUENCIA
PRE-PROLEADER

Fig. 3. Estructura simplificada de la proteína C; se representa el dominio GLA de la

cadena ligera (línea oscura), la posición del beta-hidroxi-aspartato y los dominios EGF.
Se observan los tres residuos fundamentales de la tríada catalítica (sitio activo) en la
cadena pesada (línea sombreada) y la posición en donde la trombina escinde el péptido
de activación, activando así a la proteína C.
 Fisiología y fisiopatología de los anticoagulantes naturales 7
hallándose unidos por un puente disulfuro); durante la activación por la
trombina, se despega un péptido de activación de 12 aminoácidos del
extremo aminoterminal de la cadena pesada (1 1). La proteína C sufre una
serie de modificaciones dentro y fuera del ribosoma hepático: a) separa-
ción de la secuencia pre-proleader, tal como se ha indicado; b) hidroxi-
lación en posición B del ácido aspártico 71; c) carboxilación en posición
y de los primeros 9 residuos de ácido glutámico de la región aminoter-
mina1 de PC (dominio gla); d) separación proteolítica del dipkptido de
conexión de las cadenas pesada y ligera; e) N-glucosilación en diferentes
posiciones de la molécula (secuencia Thre/Ser y Asn). La base molecular
de estas modificaciones, como las de otras proteínas de la coagulación,
sólo se conoce en parte. La hidroxilación del ácido aspártico de PC y de
otros factores de la coagulación se ha relacionado con una unión al calcio
de alta afinidad, independiente del dominio gla, que es fundamental para
la conformación correcta de la molécula durante su activación y efecto
catalítico (14). En cambio, se conocen mejor las bases moleculares de la
carboxilación en posición y de los residuos del ácido glutámico: se trata
de una modificación ribosómica que afecta también a otras proteínas de
la coagulación (factores 11, VII, IX, X, proteína C, proteína S) y de la
matriz osteoide, antes de su secreción (13, 15). Desde el punto de vista
funcional, estas alteraciones otorgan a la proteína la capacidad de unión
al calcio iónico y, a su vez, a las membranas biológicas con carga
negativa. Cuando la célula (plaqueta, endotelio, monocito) se activa,
emerge en su superficie la fosfatidilserina, un fosfolípido de carga
negativa. De esta manera, la reacción de la coagulación se concentra en
un área limitada y en una zona catalíticamente más eficiente, por la
presencia de los co-factores de la membrana en lugar de la fase fluida.
Las regiones arninoterminales que contienen los residuos y-carboxilados
de denominan dominios gla. La y-carboxilación ocurre en el retículo
endoplásmico del hepatocito a través de una proteína de la membrana, la
carboxilasa, que requiere como co-factor la vitamina K; la reacción
ocurre en presencia del oxígeno molecular y del anhídrido carbónico.
Durante la carboxilación se oxida la vitamina K y una de las enzimas que
la transforman en su forma reducida y sensible ai anticoagulante oral
warfarina. Las bases moleculares de la y-carboxilación se han investigado
profundamente utilizando mutantes con direcciones conocidas (15). Las
regiones proteicas de la molécula que reconocen parte de la carboxilasa
hepática se encuentran en el propéptido y, en concreto, en algunos
residuos altamente conservados de las diferentes proteínas. Las caracte-
rísticas de estas regiones de reconocimiento se indican en la tabla 1.
El gen de la PC contiene 9 exones, mide 11 kb y está situado en el
cromosoma 2 (q13-q14) (16). La proteína tiene una estructura modular
con unos dominios funcionales circunscritos y codificados por un hexón.
De acuerdo con algunas teorías, este tipo de organización, común a otras
proteínas de la coagulación, tiene un origen evolutivo antiguo: las
proteasas de la coagulación se originaron en una molécula común, una
 E. M. Faioni
Tabla 1. Características del sitio de reconocimiento para la gamma-carboxilación del propép-
tido de las proteínas dependientes de la vitamina K. (Modificado de la referencia 15).
- --

Se encuentra adyacente a los residuos Glu que son los sutratos de la carboxilación
Probablemente se une directamente a las carboxilasas dependientes de la vitamina K
Los residuos -18, -17, -16, -15 y -10 del propéptido forman parte del sitio
Antes de la secreción, se escinde el propéptido de la proteína carboxilada
Este sitio es necesario para la garnma-carboxilación pero no se sabe si resulta suficiente
Se halla contenido totalmente dentro del propéptido y no posee componentes del dominio
gla.

proteasa elemental parecida a la tripsina, compuesta por un péptido

indicador de la secreción, un péptido de activación y una región proteá-
sica verdadera y propia (17). A lo largo de la evolución, las inserciones
aieatorias, las duplicaciones génicas y los entrecruzamientos se asociaron
a la inserción de módulos discretos (auténticas «miniproteínas» funciona-
les) en los genes de las proteasas. Estos «módulos» constituyen, por
ejemplo, el dominio gla, el dominio análogo al precursor de los factores
de crecimiento epidérmico (de tipo EGF), los dominios kringle y finger
(estos últimos se hallan presentes en la protrombina y factores de la
fibrinólisis). Este tipo de cambios ocurrieron aparentemente antes de la
separación evolutiva de los mamíferos y de las aves, posiblemente al
mismo tiempo en que aparecieron los primeros vertebrados. Se ha llegado
incluso a proponer, de acuerdo con investigaciones genéticas, que estos
«módulos» han sido vehiculados a través de virus.
La deficiencia congénita de la proteína C ocurre en un 5-8% de los
enfermos con trombosis juvenil y en 1:16.000 de la población general (6).
Se han examinado las bases moleculares de la deficiencia de proteína C.
Además de conocer mejor la relación estructura-función de la proteína C
y del gen correspondiente, los estudios moleculares realizados en este
caso tenían por finalidad dirimir un tema espinoso: aunque en muchos
casos, se aprecia una clara asociación entre el déficit de proteína C y la
trombosis, existe por lo menos un estudio (18) que revela una alta
prevalencia de heterocigosis para la deficiencia de proteína C entre la
población normal asintomática y con antecedentes familiares negativos
(prevalencia 1:200-1:300). El estudio molecular permitiría en este caso
verificar si la deficiencia es real o se relaciona con un problema de
laboratorio o del análisis de los datos; asimismo, se podría establecer una
relación entre los diferentes tipos de alteración molecular y la prevalencia
mayor o menor de la trombosis. En la actualidad, se conocen muchos datos
de esta deficiencia, tanto de tipo cuantitativo como cualitativo (16). Se han
descrito mutaciones puntiformes sin sentido y de sentido erróneo así como
deleciones e inserciones. Como las técnicas de biología molecular se han
sofisticado considerablemente en el último tiempo, cabe prever que se
caractericen muchos más defectos y que se pueda efectuar una clasificación
genotípica más que fenotípica, de la deficiencia de proteína C.
 Fisiología y fisiopatología de los anticoagulantes naturales 9
3.2 Trombomodulina
La trombomodulina (TM) es una proteína de la membrana sintetizada por
las células endoteliales (19). Recientemente, se ha detectado también en
los megacariocitos y plaquetas, glía y leucocitos polimorfonucleares
aunque su significado funcional en estas células no está muy claro (20,
21). La TM muestra una analogía estructural con los receptores de LDL
(22). La proteína se compone de 575 aminoácidos y tiene un peso
molecular de 60,3 kd. En la región aminoterminal se observa una región
hidrófoba, que supuestamente interacciona con la membrana, aunque
todavía no se ha demostrado. A continuación aparecen seis módulos de
tipo EGF, una región rica en residuos Thr y Ser, donde probablemente
ocurre la O-glucosilación, una porción transmembranaria sumamente
hidrófoba y una cola citoplásmica de 38 aminoácidos (19) (fig. 4).

DOMINIOS
EGF

DOMINIO TRANS-
MEMBRANARIO
REGIONES

Fig. 4. Estructura de la trombomodulina: la figura muestra las regiones más importantes

desde el punto de vista funcional, incluida la región mínima necesaria para activar la
proteína C (IV-VI dominio EGF).
10 E. M. Faioni
La unión de la trombina a la TM en la superficie endotelial muestra
una elevada afinidad (K,<lnM) y aumenta la eficiencia catalítica de
activación de la PC en un factor de 20.000 con respecto a la trombina
sola. La unión no depende del calcio, pero la posibilidad de que el
complejo active la PC y de que esta se una al complejo trombina-TM
sobre los fosfolípidos depende de la conformación que asuma la PC en
presencia del calcio (19). Además, la unión de la trombina a la TM
modifica la especificidad de aquella por los sustratos macromoleculares,
es decir, la trombina no determina la proteólisis del fibrinógeno, ni activa
las plaquetas ni los factores VIII, V y XIII ni tampoco inactiva la PS. No
obstante, aún puede unirse a la AT 111: el complejo AT 111-trombina, una
vez formado, pierde la afinidad por la TM y se desprende, quedando libre
la molCcula de TM para recibir a una nueva molécula de trombina (19).
El gen de la TM, situado en el cromosoma 20, mide aproximadamen-
te 3,7 kb y ha sido caracterizado recientemente: tiene la particularidad de
carecer de intrones, característica común a los genes de otras proteínas
como los receptores B-adrenérgicos murinos, los interferones a y B
humanos y algunas proteínas mitocondriales (23). Se ha propuesto que
esta característica revela la necesidad del gen de su rápida traducción (en
ausencia de empalme o «splicing») aunque no se ha demostrado de una
manera convincente.
La región de unión a la trombina se ha atribuido al 5% 06"dominio
de tipo EGF, mientras que la capacidad de activación de PC requiere la
presencia adicional del 4Vominio EGF (24, 25). Estos datos provienen
de estudios de mutagenia y fragmentación de la TM. La TM es escindida
por diversas proteasas, entre ellas la elastasa y la tripsina. Se ha compro-
bado in vivo que las formas de TM circulantes tienen un peso molecular
reducido, por la ausencia de la cola citoplásmica y del dominio trans-
membranario. Se piensa que estas formas dependen de l a proteólisis
causada por la elastasa de origen leucocitario durante la reacción inflama-
toria que ocurre en el endotelio. Se ha observado un aumento de estas
formas circulantes en numerosos estados patológicos donde ocurre un
daño endotelial como la coagulación intravascular diseminada, el síndro-
me de distrés respiratorio del adulto y el embolismo pulmonar (26). Con
respecto a la deficiencia de TM, su estudio es difícil por la imposibilidad
de acceder al endotelio vivo de una forma no invasiva. Por este motivo,
aunque se ha propuesto una deficiencia cualitativa o cuantitativa de TM
en la patología trombótica, no se ha podido identificar con los métodos
bioquímicos tradicionales. Una técnica prometedora, aunque hasta ahora
no ha tenido ningún éxito (27), consiste en estudiar directamente el gen
de la TM en los enfermos con diátesis trombótica para separar las
alteraciones que se asocian a la trombosis. Existe también la posibilidad
de medir la concentración de TM en los leucocitos y plaquetas, células
fácilmente accesibles, en el momento en que se aclarara su importancia
funcional y su significado fisiológico.
En definitiva, las observaciones realizadas por distintos grupos indi-
 Fisiología y fisiopatología de los anticoagulantes naturales 11
can que la TM también regula la fibrinólisis; de hecho, la TM actúa como
co-factor en la proteólisis de un activador del plasminógeno (scu-PA)
inducida por la trombina (28). Considerando las alteraciones tisulares y
la invasión metastásica atribuidas a scu-PA y la fibrinólisis en general,
este efecto indica que la TM también interviene en los mecanismos
extracoagulantes.

3.3 Proteína S
La proteína S (PS) es una glucoproteína de cadena única compuesta por
635 aminoácidos, con un peso molecular de 69 kd (29). Esta proteína es
sintetizada en las células endoteliales, hepatocitos, megacariocitos y
células de Leydig del testículo. Posee algunos elementos nodulares en
común con la proteína C y con otros factores de la coagulación, pero se
diferencia porque la zona proteásica carboxi-terminal es sustituida por
una región análoga a la globulina humana que fija las hormonas sexuales.
Por consiguiente, la PS no es un cimógeno ni posee actividad proteolíti-
ca; únicamente actúa como co-factor unida a la APC. De hecho, se ha
comprobado que la PS, que muestra la mayor afinidad por los fosfolípi-
dos de carga negativa (Kd = mol/L) entre las proteínas dependientes
de la vitamina K, aumenta la actividad proteolítica de APC, fomentando
su unión a la membrana biológica. En la figura 5 se muestra la estructura
proteica de la PS. Comenzando por la región aminoterminal, después del
dominio gla, se observa un péptido de conexión (aa 37-46), una región
sensible a la trombina, 4 módulos análogos a EGF y la SHGB. En la
región sensible a la trombina se encuentran dos enlaces que pueden ser
escindidos por la trombina. Después de la proteólisis, la afinidad de la PS
por el calcio disminuye; cuando la concentración de calcio es menor de 2
mmol/l, la afinidad por las membranas de carga negativa también se reduce
y desaparece la capacidad anticoagulante (de co-factor) (29). El residuo
arginínico del anillo de la región sensible a la trombina es esencial para el
correcto repliegue de la zona del dominio gla. Entre las modificaciones
post-ribosómicas, la PS muestra un residuo de ácido aspártico hidroxilado
en posición B (Hya) en el primer dominio EGF y tres residuos de
asparagina hidroxilados en posición B (Hyn) en los tres sucesivos dominios
EGF. Los módulos EGF que contienen Hyn muestran una afinidad por el
calcio 1.000 veces superior a los dominios EGF de las otras proteínas. A
diferencia de la PS, las demás proteínas contienen módulos EGF con Hyn,
incluida la trombomodulina y los receptores de LDL. Los estudios realiza-
dos con anticuerpos monoclonales, con una especificidad diferente para la
PS, han revelado que la región sensible a la trombina y el primer dominio
EGF, representan la región de unión a la APC (30). El lugar de unión
para C4b-BP se sitúa, en cambio, en dos regiones: los residuos 420-434
y los residuos 605-614 del anillo de la región SHBG que tiene una
significación estructural y no intervienen directamente en la unión.
12 E. M. Faioni

REGIÓN DE LA HORMONA
FIJADORA DE LAS
HORMONAS ESTEROIDEAS

DOMINIOS EGF

REGIÓN SENSIBLE
A LA TROMBINA R E G I ~ NDE
UNIÓN A APC

1 DOMINIO GLA

Fig. 5. Estructura de la proteína S: se muestran las regiones conocidas, incluido el lugar

de proteólisis en el que actúa la trombina, el dominio gla, la presunta región de unión a
la proteína C activada (APC), los 4 dominios EGF y la zona carboxiterminal análoga a
la proteína fijadora de las hormonas esteroideas.

El gen de la PS (gen a) se encuentra en el cromosoma 5 junto a un

pseudogen (gen B), que no es traducido. Posee 15 exones y 14 intrones
y mide en total 80 kb. La estructura de los dominios de la PS se
corresponde con la organización hexónicaJintrónica del gen y respalda la
hipótesis de que el gen de PS es un producto del «ensamblaje» evolutivo,
en donde los módulos que codifican las unidades funcionales/estructura-
les, que se encuentran también en otras proteínas de la coagulación, se
intercalan sobre un gen ancestral de una proteína fijadora de las hormo-
nas esteroideas. Los primeros 8 exones codifican la región análoga a las
otras proteínas dependientes de la vitamina K, mientras que los exones
IX a XV codifican la porción SHBG (31, 32).
- Los déficit congénitos de la proteína S se asocian a trombosis
prematuras a munudo recidivantes y familiares, que representan un 5% de
todas las trombosis juveniles (6). La clasificación fenotípica de la defi-
ciencia ha provocado numerosos problemas por la complejidad de la
regulación y de la unión de la proteína S que impiden una determinación
 Fisiología y fisiopatología de los anticoagulantes naturales 13
precisa de la misma ya sea por medios inmunológicos o determinando su
actividad como co-factor unido a la APC. Las técnicas moleculares son
también complejas, sobre todo por la presencia del pseudogen. En
consecuencia, queda todavía mucho tiempo para poder proceder a la
clasificación genotípica de los dCficit de la AT 111 o de la PC. En
cualquier caso, se han descrito mutaciones puntiformes y deleciones
parciales en 5 de 9 familias con deficiencia heterocigótica de proteína S
y en una familia con deficiencia homocigótica de proteína S (33). Las
otras mutaciones descritas del gen a o B no se han asociado a trombosis.

3.4 Proteína de unión a C4b

La proteína de unión a C4b (C4b-BP) tiene una estructura aracnoidea con
7 brazos largos, cada uno con 70 kd de peso molecular y un octavo brazo
corto de 45 kd de peso molecular, al que se une la proteína S (29). Los
brazos largos están formados por la cadena a y el corto por la cadena B
(figura 6). La estructura primaria de la cadena a de la C4b-BP humana

SCR

Fig. 6. Proteína de unión a C4b: el brazo corto del inhibidor se une a la proteína S,
mientras que los otros brazos lo hacen a C4b. Se muestra también SAP (v. texto), cuya
zona de unión se desconoce. SCR = short consensus repeats. (Figura modificada de la ref.
29).
14 E. M. Faioni
se ha reconocido, tanto por su secuencia de aminoácidos como tras la
clonación del cDNA (29). Se compone de 549 aminoácidos y contiene 8
secuencias repetidas de 69 aminoácidos, cada una, denominadas SCR
(short consensus repeat). Cada cadena a contiene un lugar de unión para
la forma activada de la proteína del complemento C4, es decir, C4b.
Otras proteínas, entre ellas el factor XIII y las tres seletinas GMP-140,
ELAM-1 y MEL-14 contienen una o varias secuencias SCR. La función
de las secuencias SCR en estas proteínas se desconoce, pero se cree que
constituye una región de unión a C4b en la molécula C4b-BP. El gen de
C4b-BP se encuentra en el brazo largo del cromosoma 1, próximo a los
genes de otras proteínas reguladoras del complemento en una región que
representa un «cluster» génico denominado RCA (regulador de la activa-
ción del complemento).
La cadena B se une a través de un puente disulfuro a la región central
de C4b-BP. Su estructura primaria también se conoce a través de estudios
de secuencia y clonación de cDNA. La cadena contiene 235 aminoácidos
y tres zonas SCR en el extremo aminoterminal. El gen también se
encuentra en el cluster RCA, íntimamente asociado al de la cadena a, que
se piensa que es una duplicación evolutiva del anterior. La cadena B está
glicosilada en varios puntos y contiene hidratos de carbono complejos.
Durante la biosíntesis de C4b-BP se ensamblan 7 cadenas alfa y una
cadena B para formar una molécula de C4b-BP. Los mecanismos que
regulan este proceso se desconocen al igual que los factores que regulan
la proporción de las cadenas a y 13. Aproximadamente el 30% de la C4b-
BP plasmática tiene un peso molecular ligeramente menor (C4b-BP low)
que la molécula predominante (C4b-BP high). Las dos muestran la
misma capacidad de unión que C4b. C4b-BP se compone de dos fraccio-
nes moleculares: aproximadamente el 50% contiene la cadena B, que se
une a la proteína S y probablemente está formada por 6 y no por 7
cadenas a. El resto de C4b-BP low no contiene la cadena 13 ni se une a
la proteína S. Esta fracción molecular probablemente contiene 7 cadenas
a. Estos resultados sugieren que la cadena B es necesaria para la unión
a la proteína S pero no para la polimerización de la cadena a durante el
ensamblaje de la molécula (29).
El complejo temario C4b-BP, proteína S y C4b del plasma es, en
realidad, un complejo cuatemario, ya que se añade un cuarto componen-
te, la sustancia mieloide P (SAP). Se trata de una proteína multimérica
compuesta por 5 subunidades idénticas de 25 kd que se une a través de
enlaces Iio covalentes (34). Es análoga a la proteína C reactiva, pero la
concentración plasmática de SAP no aumenta durante las reacciones de
la fase aguda. La SAP se une, en presencia del calcio, a C4b-BP con una
relación estequiométrica de 1:1 con una gran afinidad. El sitio de unión
a la proteína S y a SAP de C4b-BP es totalmente independiente, así como
el de SAP y C4b. El complejo cuaternario se une a la membrana en
presencia del calcio; el dominio gla de la proteína S es fundamental para
esta interacción. Es posible que la proteína S sirva para que C4b-BP se
 Fisiología y fisiopatología de los anticoagulantes naturales 15
una a los mismos tipos de fosfolípidos que emergen a la superficie en las
reacciones de la coagulación. La activación del complemento conlleva
diversas reacciones inflamatorias locales, que en parte obedecen a la
liberación de anafilotoxinas y a la quimiotaxis leucocitaria. Según algu-
nos autores, la inhibición del complemento en las superficies, en donde
ocurre la coagulación, puede resultar beneficiosa ya que la presencia de
reacción inflamatoria en el mismo lugar de la coagulación puede provo-
car una pérdida del control de ésta (29).
Los mecanismos que regulan el equilibrio in vivo entre la proteína S
y C4b-BP se ignoran. De acuerdo con la constante de afinidad calculada
en presencia del calcio, prácticamente toda la proteína S del plasma
forma complejo con C4b-BP (35). Por consiguiente, es necesario que
exista otro factor regulador que, en presencia de concentraciones norma-
les de C4b-BP y de la proteína S, desplace el equilibrio de modo tal que
aproximadamente un 40% de la proteína S circule en el plasma sin formar
complejo y pueda actuar como co-factor de APC. Evidentemente, según
indica la ley de acción de masas, cuando varía la concentración de PS o
de C4b-BP, el equilibrio se restablece de modo inverso, como en el caso
de la reacción inflamatoria aguda, en donde los niveles de C4b-BP se
elevan con la consiguiente disminución de la proteína S libre.

4 Conclusiones

Los breves conceptos de fisiología ilustrados en este capítulo permiten

extraer algunas conclusiones inmediatas sobre la patogenia como por
ejemplo el hecho de que la mayor parte de los anticoagulantes naturales
descritos son sintetizados y procesados en el hígado. Por consiguiente, en
las hepatopatias primarias o secundarias se producen alteraciones patológi-
cas de la antitrombina 111, proteína C y proteína S. Asimismo, el daño
endotelial (entendido en el sentido moderno de «perturbación») altera la
expresión de los co-factores de las principales vías anticoagulantes como
la trombomodulina y la proteína S. Conviene señalar también otros aspec-
tos. Por ejemplo, la biología molecular ha adquirido en el momento actual
una enorme importancia y se han efectuado grandes adelantos en el estudio
de los genes y de las relaciones estructura-función de los anticoagulantes
naturales. Estas técnicas conllevan una doble ventaja: por un lado, permiten
conocer mejor la fisiología de estas moléculas y su interacción y, por otro,
permitirán desarrollar en el futuro moléculas recombinantes can un objeti-
vo terapéutico preciso que puede adivinarse ya con el uso de los concen-
trados purificados de antitrombina III y proteína C.
Los datos recientes sobre la interacción íntima entre los mecanismos
hemostáticos y la inflamación son muy interesantes. En este contexto, los
anticoagulantes naturales desempeñan un papel de gran relieve. Se ha
comprobado que las proteínas, integradas clásicamente en el sistema de
complemento, modulan la vía anticoagulante y que las proteasas y citocinas
16 E. M. Faioni
leucocitarias regulan la expresión de co-factores como la trombomodulina.
Estas interacciones se han demostrado no sólo durante ensayos in vitro,
sino también in vivo en animales o ex vivo en la especie humana y
constituyen la base de algunas hipótesis patogénicas acerca de los fenóme-
nos trombóticos (o microtrombóticos) que se observan en patologías
complejas como, por ejemplo, el shock séptico por bacterias gram-negati-
vas o el síndrome venoclusivo hepático secundario al trasplante de médula.
Estos últimos hechos, entre los que se incluye también el estudio de
las interacciones entre los anticoagulantes naturales y los componentes
celulares vasculares y hemáticos, se hallan en pleno desarrollo y permi-
tirán conocer mejor la respuesta hemostática integral con las consiguien-
tes ventajas terapéuticas.

Bibliografía
1. Lane DA, Caso R (1989) Antithrombin: structure, genomic organization, func-
tion and inherited deficiency. In: E.G.D. Tuddenham (Guest Editor), The mo-
lecular biology of coagulation, Baillikre's Clinical Haematology, vol. 2 (4), Bail-
likre Tindall, London
2. Huber R , Carrell RW (1989) Implications of the three-dimensional structure of
a,-antitrypsin for the structure and function of serpins. Biochemistry 28:8951-54
3. Lindahl U, Backstrom G , Thunberg L, Leder IG (1980) Evidence for a 3-0-sul-
fated D-glucosamine residue in the antithrombin-binding sequence of heparin.
Proc Natl Acad Sci USA 77:6551-55
4. Marcum JA, McKenney JB, Rosenberg RD (1984) Acceleration of thrombin-
antithrombin complex formation in rat hind-quarters via heparin-like molecules
bound to the endothelium. J Clin Invest 74:341-350
5. Marcum JA, Atha DH, Fritze LMS. Nawroth P, Stern D , Rosenberg R D (1986)
Cloned bovine aortic endothelial cells synthesize anticoagulantly active heparan
sulphate proteoglycans. J Biol Chem 261:7507-17
6. Mannucci PM, Tripodi A (1987) Laboratory screening of inherited thrombotic
syndromes. Thromb Haemost 57:247-51
7. Blajchman MA, Austin RC, Fernández-Rachubinski F, Sheffield WP (1992)
Molecular basis of inherited human antithrombin deficiency. Blood 80:2159-71
8. Lane DA, Ireland H , Olds RJ, Thein SL, Perry DJ, Aiach M (1991) Antithrom-
bin 111: A database of mutations. Thromb Haemost 66:657-61
9. Gandrille S, Aiach M, Lane DA, Vidaud D , Molho-Sabatier P, Caso R, de Moer-
loose P, Fiessinger J-N, Clauser E (1990) Important role of arginine 129 in hepa-
rin-binding site of antithrombin 111. J Biol Chem 265:18997-19901
10. Esmon CT (1992) The protein C anticoagulant pathway. Art Thromb 12:135-145
11. Walker FJ, Fay PJ (1992) Regulation of blood coagulation by the protein C
system. FASEB J 6:2561-67
12. Fulcher CA, Gardiner JE, Griffin JH, Zimmerman TS (1984) Proteolytic inacti-
vation of human factor VI11 procoagulant protein by activated protein C and its
analogy with factor V. Blood 63:486-89
13. Foster DC, Rudinski MS, Schach BG, Berkner KL, Kumar AA, Hagen FS,
Sprecher CA, Insley MY, Davie EW (1987) Propeptide of human protein C is
necessary for y-carboxylation. Biochemistry 26:7003-11
14. Ohlin A-K, Landes G , Bourdon P, Oppenheimer C, Wydro R , Stenflo J (1988)
P-Hydroxyaspartic acid in the first epidermal growth factor-like domain of pro-
tein C. J Biol Chem 263:19240-48
15. Furie B, Furie BC (1990) Molecular basis of vitamin K-dependent y-carboxyla-
tion. Blood 75:1753-62
 Fisiología y fisiopatología de los anticoagulantes naturales 17
16. Reitsma PH, Poort SR, Bernardi F, Gandrille S, Long GL, Sala N, Cooper DN
(1993) Protein C deficiency: a database of mutations. Thromb Haemost 6937-84
17. Patthy L (1985) Evolution of the proteascs of blood coagulation and fibrinolysis
by assembly from modules. Cell41:657-63
18. Miletich J , Sherman L, Broze G Jr (1987) Absence of thrombosis in subjects with
heterozygous protein C deficiency. N Engl J Med 317:991-96
19. Esmon NL (1987) Thrombomodulin. Semin Thromb Hemost 13:454-63
20. Suzuki K, Nishioka J, Hayashi T, Kosaka Y (1988) Functionally active thrombo-
modulin is present in human platelets. J Biochem 104:628-32
21. Conway EM, Nowakowski B, Steiner-Mosonyi M (1992) Human neutrophils
synthetize thrombomodulin that does not promote thrombin-dependent protein
C activation. Blood 80:1254-63
22. Jackman RW, Beeler DL, VanDeWater L, Rosenberg R D (1986) Characteriza-
tion of a thrombomodulin cDNA reveals structural similarity to the low density
lipoprotein receptor. Proc Natl Acad Sci USA 83:8834-38
23. Jackman RW, Beeler DL, Fritze L. Soff G, Rosenberg RD (1987) Human throm-
bomodulin gene is intron depleted: Nucleic acid sequences of the cDNA and
gene predict structure and suggest sites of regulatory control. Proc Natl Acad Sci
USA 84:6425-29
24. Stearns DJ, Kurosawa S, Esmon CT (1989)
. . Microthrombomodulin. J Biol Chem
264:3352-56
25. Suzuki K, Hayashi T, Nishioka J, Kosaka Y, Zushi M, Honda G, Yamamoto S
(1989) A domain composed of epidermal growth factor-like structures of human
thrombomodulin is essential for thrombin binding and for protein C activation.
J Biol Chem 264:4872-76
26. Takano S, Kimura S, Ohdama S, Aoki N (1990) Plasma thrombomodulin in
health and diseases. Blood 76:2024-29
27. van der Velden PA, Krommenhoek-Van Es T, Allaart CF, Bertina RM, Reitsma
PH (1991) A frequent thrombomodulin amino acid dimorphism is not associated
with thrombophilia. Thromb Haemost 65511-13
28. Molinari A, Giorgetti C, Lansen J, Vaghi F, Orsini G, Faioni EM, Mannucci PM
(1992) Thrombomodulin is a cofactor for thrombin degradation of recombinant
single-chain urokinase plasminogen activator «in vitro» and in a perfused rabbit
heart model. Thromb Haemost 67: 226-232
29. Dahlback B (1991) Protein S and C4b-Binding Protein: Components involved in
the regulation of the protein C anticoagulant system. Thromb Haemost 66:49-61
30. Dahlback B, Hildebrand B, Malm J (1990) Characterization of functionally
important domains in human vitamin K-dependent protein S using monoclonal
antibodies. J Biol Chem 265:8127-35
31. Ploos van Amstel HK, Reitsma PH, van der Logt CPE, Bertona RM (1990) Intron-
exon organization of the active human protein S gene PSa and its pseudogene PSP:
duplication and silencing during primate evolution. Biochemistry 29:7853-61
32. Edenbrandt C-M, Lundwall A, Wydro R, Stenflo J (1990) Molecular analysis of
the gene for vitamin K dependent protein S and its pseudogene. Cloning and par-
tia1 gene organization. Biochemistry 29:7861-68
33. Schmidel DK, Nelson RM, Broxson EH, Comp PC, Marlar RA, Long GL
(1991) A 5.3-kb deletion including exon XIII of the protein S a gene occurs in
two protein S-deficient families. Blood 77:551-59
34. Schwalbe RA, Dahlback, Nelsestuen GL (1990) Independent association of
serum'amyloid P component, protein S, and complement C4b with complement
C4b-binding protein and subsequent association of the complex with mem-
branes. J Biol Chem 265:21749-57
35. Dahlback B, Frohm B, Nelsestuen G: (1990) High affinity interaction between
C4b-binding protein and vitamin K-dependent protein S in the presence of cal-
cium. J Biol Chem 265:16082-87