ELISA

Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzimas

I) INTRODUCCIÓN:

Es una técnica de inmunoensayo, en la cual una enzima ligada a un complejo antígeno –

anticuerpo es capaz de generar un producto detectable con cambio de color. Aunque el
procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como
selección de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan
correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba; por lo tanto,
como prueba diagnóstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer:
En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa
necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado
enferma y que ya se ha recuperado, o que ha sido vacunado, puede seguir produciendo
anticuerpos. Esto originaría un falso positivo.
En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que
éstos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sería
el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren
en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o que estén
infectadas por una cepa extraña.
En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre
antígeno-anticuerpo. En estos casos, normalmente, se lleva a cabo un western blot donde
se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultáneamente, frente a la misma infección
en una muestra.
Las enzimas que componen el conjugado deben reunir condiciones como la temperatura de
catálisis semejante a la de la reacción antígeno-anticuerpo; dar productos colorados y
solubles al degradar el substrato; y no dar productos intermedios de catálisis. Las enzimas
más empleadas son la fosfatasa alcalina (con substrato p-nitrofenil fosfato o dietanolamina
en bufer carbonato pH 9,6) la peroxidasa (con substrato ortofenilendiamina) y la beta-
galactosidasa (son substrato o.nitrofenil-beta-galactosido)

II) Tipos de ensayos ELISA

Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la
cuantificación de un antígeno en solución (DIRECTO), la detección de un anticuerpo
(INDIRECTO) en una solución (por ejemplo en el clonaje de anticuerpos monoclonales) o la
determinación de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo (INDIRECTO).
A continuación se describen los más comunes.
1. ELISA directo Sandwich “DAS” (Double Antibody Sandwich).
Principio: Fijación al soporte de anticuerpos específicos del antígeno. Adición de la muestra
problema conteniendo el antígeno (Reacción Ag-Ac). Adición de anticuerpos monoclonales
específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo diferente de los anticuerpos con
los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con
los antígenos añadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los
anticuerpos (2da. Reacción Ag-Ac). Adición de un substrato para la enzima y luego una
sustancia reveladora de haber ocurrido la reacción enzimática. Se realiza la
lectura del color en forma visual (cualitativa) o usando lectores especiales
para cuantificar. En caso de negatividad, no aparecerá ningún color.

2. ELISA directo doble

Sándwich “HADAS”. Principio:
Fijación al soporte de anticuerpos específicos del antígeno. Adición de la
muestra problema conteniendo el antígeno (Reacción Ag-Ac). Adición de
anticuerpos monoclonales específicos del antígeno a detectar (deben tener
un epítopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el
soporte). (2da reacción Ag-Ac). Agregar anti-anticuerpos (contra el 2do. Ac)
conjugados con una enzima (3ra. Reacción Ag-Ac). Adición de un substrato
para la enzima y luego una sustancia reveladora de haber ocurrido la
reacción enzimática. Se realiza la lectura del color en forma visual
(cualitativa) o usando lectores especiales para cuantificar. En caso de
negatividad, no aparecerá ningún color.

3. ELISA Indirecto

Principio: En el soporte se encuentra fijado el antígeno, se agrega la

muestra que contiene el anticuerpo que capta al antígeno fijado (reacción
Ag-Ac). Se adiciona anti-anticuerpos conjugados con una enzima. Se agrega
el sustrato de la enzima usada y luego una sustancia reveladora de haber
ocurrido la reacción enzimática. Se realiza la lectura del color en forma visual
(cualitativa) o usando lectores especiales para cuantificar. En caso de
negatividad, no aparecerá ningún color.

4. ELISA Directo Competitivo

Principio: En el soporte se encuentran fijados los anticuerpos. Se agrega

en forma simultánea la muestra que contiene el antígeno problema y una
concentración conocida (comercial) del mismo Ag marcado con una enzima.
Se agrega el sustrato de la enzima usada y luego una sustancia reveladora
de haber ocurrido la reacción enzimática. Si la muestra es negativa la lectura
de color será mayor a que si la muestra contiene al antígeno, Estas lecturas
deberán ser confrontadas con la curva de calibración respectiva. Como puede
observarse, los dos antígenos agregados están compitiendo con el
anticuerpo fijado en el soporte. También puede utilizarse el ELISA
competitivo para detectar anticuerpos.

5. ELISA Directo de inhibición

Principio: En el soporte se encuentran fijados los antígenos. Se agrega en

forma simultánea la muestra que contiene el antígeno, más un anticuerpo
específico marcado con una enzima. En este paso se establece una reacción
de inhibición entre del Ag (muestra) con el Ac marcado, impidiendo que este
último se una al Ag del soporte. Con el lavado se eliminan el anticuerpo no
fijado al Ag del soporte y se determina la cantidad de anticuerpo marcado que
se ha inmovilizado. Se construye una curva de calibrado representando la
cantidad de anticuerpo marcado inmovilizado frente a la concentración de
antígeno soluble añadida. Puede emplearse también el inhibitorio indirecto.
Objetivo de la práctica:
Conocer las técnicas y el fundamento que se usan para los distintos ELISA.