AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE CIANOBACTERIAS, BACTERIAS

PÚRPURAS, BACTERIAS VERDES: PREPARACIÓN DE LA COLUMNA DE

WINOGRADSKY

I. INTRODUCCION

El estudio de las comunidades microbianas en condiciones de laboratorio puede

realizarse mediante una columna de Winogradsky, que es un instrumento útil para
estudiar y demostrar las relaciones entre diferentes tipos de microrganismos en
comunidades mixtas, y constituye una forma de observar como los microespacios
altamente específicos, de acuerdo con sus tolerancias medio ambientales y sus
necesidades vitales, como los requerimientos de carbono, energía y oxígeno, así como
la interdependencia, de forma tal que la actividad metabólica de un microorganismo
posibilita el crecimiento de otros y viceversa.

La columna de Winogradsky se preparan con muestras de lodo residual, las cuales son
enriquecidas con compuestos orgánicos e inorgánicos y finalmente es expuesta a una
fuente de luz en todo el proceso. Transcurrido tres o cuatro semanas se empieza a
observar cambios en la columna, es decir aumenta la cantidad de los distintos tipos de
microorganismos, mismos que de acuerdo con sus características fisiológicas se
establecen en las diferentes zonas a lo largo de la columna, lo que se conoce como
sucesión. De esta forma, el resultado es una columna estratificada (zonas de diferente
color) tanto en el suelo como en el agua, donde cada estrato se relaciona con un proceso
químico-biológico. En la zona inferior de lodos se desarrollan organismos fermentadores
que producen alcohol y ácidos grasos como subproductos de su metabolismo. Estos
productos constituyen el sustrato para el desarrollo de bacterias reductoras de sulfato,
las cuales como resultado de su metabolismo liberan sulfuros que difunden a la zona
superior oxigenada creando un gradiente en el que se desarrollan bacterias
fotosintéticas que utilizan el azufre. Por encima de esta zona pueden desarrollarse las
bacterias púrpuras que no utilizan el azufre y que obtienen su energía de reacciones
luminosas, pero que emplean ácidos orgánicos como fuente de carbono para su síntesis
celular.
Finalmente, en la zona aerobia crecen las Cianobacterias y algas las cuales como
producto de su metabolismo liberan oxígeno. También pueden crecer bacterias que
oxidan compuestos del azufre y del nitrógeno hasta sulfatos y nitratos respectivamente.
Todos estos grupos sintetizan su materia orgánica a partir del CO2.
 II. OBJETIVOS

 Demostrar mediante la columna de Winogradsky como los microorganismos

ocupan microespacios específicos de acuerdo a sus necesidades ambientales
y vitales
 Comparar y relacionar la diversidad microbiana presente en microambientes de
la columna de Winogradsky.

III. MARCO TEÓRICO

Una vez establecida la columna, se pueden diferenciar tres zonas características en

base a su concentración relativa de oxígeno: 1) zona aeróbica, es la más superficial,
dispone de una alta concentración de oxígeno; 2) zona microaerófila, inmediatamente
debajo de la anterior, con una menor concentración de oxígeno; 3) zona anaeróbica,
que constituye el lecho de lodo.

a) Zona aerobia (rica en Oxígeno)

La parte superior de la columna de agua puede contener abundantes poblaciones de

bacterias de diferentes tipos. Son organismos aerobios que se encuentran
habitualmente en los hábitats acuáticos ricos en materia orgánica (estanques poco
profundos, arroyos contaminados, etc.). Suelen ser flagelados, lo que les permite
moverse y establecerse en nuevas áreas. Puede desarrollarse también
microorganismos fotosintéticos: algas (diatomeas) y cianobacterias filamentosas. El
oxígeno que producen estos productores primarios difunde desde la superficie, creando
condiciones similares a las que existen en un lago con sedimentos ricos en nutrientes.

b) Zona anaerobia (sin Oxígeno)

Hay dos tipos de organismos que pueden crecer en condiciones anaerobias: los que
fermentan la materia orgánica o los que realizan la respiración anaerobia. La
fermentación es un proceso en el que los compuestos orgánicos son degradados de
forma incompleta (por ejemplo, las levaduras fermentan los azúcares a alcohol). La
respiración anaeróbica es un proceso en el que los sustratos orgánicos son
completamente degradados a CO2, pero usando una substancia distinta del oxígeno
como aceptor terminal de electrones (Algunas bacterias, por ejemplo, utilizan nitratos o
iones sulfato en vez del oxígeno). En el nivel más bajo de la columna, en un ambiente
con alta concentración de H2S, aparecen varios grupos diferentes de bacterias:
En el fondo de la columna, dependiendo del tipo de barro utilizado, puede aparecer una
capa de color rosado formada por bacterias púrpura del azufre portadoras de vesículas
de gas. Una especie característica es Amoebobacter.

En esta misma zona, en condiciones estrictamente anaerobias al cabo de unas

semanas, y utilizando la carga de celulosa aportada por los restos de papel
incorporados en el sedimento como fuente primaria para su metabolismo, aparecen las
bacterias del género Clostridium. Estas bacterias degradan la celulosa a glucosa y, a
continuación, fermenta la glucosa para obtener la energía que necesitan, produciendo
una serie de compuestos orgánicos simples (etanol, ácido acético, ácido succínico, etc.)
como productos finales de esa fermentación.

Un poco por encima, las bacterias reductoras del azufre, que se visualizan como una
profunda capa negra y están representadas por la bacteria Desulfovibrio, pueden
utilizar estos subproductos de la fermentación para su respiración anaerobia, usando
sulfato, u otras formas parcialmente oxidadas de azufre como el tiosulfato, generando
grandes cantidades de H2S en el proceso. Este SH2 reaccionará con cualquier hierro
presente en el sedimento, produciendo sulfuro ferroso, que da color negro. Es por esto
que los sedimentos acuáticos son frecuentemente negros. Sin embargo, no todo el
H2S es utilizado. Como veremos un poco más adelante, ciertas cantidades difunde
hacia arriba a lo largo de la columna de agua y son utilizados por otros organismos que
crecen en las zonas superiores.

Este crecimiento se visualiza bajo la forma de dos bandas estrechas, brillantemente

coloreadas, inmediatamente por encima del sedimento: en una primera franja, las
bacterias verdes del azufre (como Chlorobium) procesan los sulfatos a azufre y
aparecen en una franja verdosa. En otras zonas cercanas, bacterias
como Gallionella procesan el Hierro formando una capa negra que se forma
justamente por debajo de la anterior. Un poco más arriba, algo más alejadas por tanto
de las altas concentraciones de sulfídrico se desarrolla una zona de bacterias púrpuras
del azufre, como Chromatium, caracterizada por su color rojo-púrpura.

Estas bacterias del azufre, verdes y púrpuras, obtienen energía de las reacciones
luminosas y producen sus materiales celulares a partir de CO2. En gran medida, de
manera muy similar a cómo lo hacen las plantas aunque, sin embargo, hay una
diferencia esencial: no producen oxígeno durante la fotosíntesis porque no utilizan H2O
como elemento reductor sino SH2. Las ecuaciones simplificadas que siguen muestran
el paralelismo de ambos procesos:
 6CO2 + 6H20 C6H12O6 + 6O2 (fotosíntesis de las plantas)
6CO2 + 6SH2 C6H12O6 + 6S (fotosíntesis de las bacterias anaerobias)

Un poco por encima de esta zona nos encontramos una franja de bacterias púrpuras no
del azufre, como Rhodospirillum y Rhodopseudomonas, que adquiere un color rojo-
anaranjado. Su mayor o menor abundancia dependerá de la cantidad de sulfhídrico que
se haya producido y de la cantidad que, no utilizada por otros organismos, difunda hacia
arriba, ya que su presencia inhibe a estas bacterias. Son anaerobios fotoorganotrofos
que sólo pueden realizar la fotosíntesis en presencia de una fuente de carbono orgánico.

Esquema de una columna de Winogradsky típica.

 IV. MATERIALES

Material biológico Material de laboratorio

Papel mojado Mortero y pilón

Hojas secas Papel aluminio
Aserrín fino Probeta de 20 mL
Yema de huevo Vaselina
Alas de insectos viales estériles
Lodo residual Láminas porta objeto y cubre objeto
Batería Gram
Reactivos
Microscopio
CaSO4 Mechero
CaCO3 Guantes
Extracto de carne

V. PROCEDIMIENTO
a) Preparación de la columna de Winogradsky

En un mortero triturar las hojas secas, las alas de insectos, papel remojado,
aserrín y yema de huevo.

Luego agregar el lodo residual se está muy espeso agregar agua residual,
mezclar hasta que se haya formado una masa fluida.
Adicionar los reactivos: CaSO4, CaCO3, extracto de carne para
enriquecimiento.

Colocar aproximadamente el 1/3 del tubo con lodo enriquecido.

Luego Colocar lodo no enriquecido en proporción de 2 a 3 cm. Evitando en todo

momento la formación de burbujas.
 Colocar el agua residual hasta completar los 2/3 del tubo.

Tapar con una capa de vaselina liquida por lo menos dos centímetros y
posteriormente cubrir con papel aluminio y amarrar la boca del tubo con hilo pabilo.

Incubar en ambiente luminoso y controlar diariamente en un tiempo de dos a cuatro

semanas, para observar el crecimiento de las bacterias.

b) Identificación de las bacterias presentes en la columna de Winogradsky.

 Observar si ha habido variación del color en la columna esto indicara la presencia de

bacterias.
 Utilizando una pipeta larga de vidrio, tomar muestras a distintos niveles de la columna
entre 1-3 mL y depositarlos en viales estériles.
 Realizar de cada muestra una preparación en lámina en fresco y otra fijada.
- Preparaciones húmedas: Colocar una gota de muestra en un portaobjetos y
colocar un cubreobjetos. Observar al microscopio.
- Preparaciones fijas y teñidas: Tomar una gota de muestra y realizarle una
tinción Gram. Observar al microscopio.
VI. RESULTADOS

Cianobacterias

Bacterias Púrpuras

Bacterias verdes

Bacterias anaerobias
estrictas

Columna de Winogradsky
 Observaciones Microscópicas de la columna de Winogradsky

a) CIANOBACTERIAS Y ALGAS

Oedogonium sp

Internet Encontrado

Chlamydomonas sp
sp.

Internet
Encontrado

Pinnularia sp.

Internet
Encontrado
 Pinnularia viridis

Internet Encontrado

Nostoc sp.

Encontrado
Internet

Scenedesmus sp.

Internet Encontrado
 Coelastrum sp.

Internet Encontrado

Chroococus sp.

Internet Encontrado

b) BACTERIAS VERDES

Prosthecochloris sp
sp.

Internet Encontrado
 Pelodictyon sp.

Internet Encontrado

c) BACTERIAS PÚRPURAS

Dechlorospirillum sp.

Internet Encontrado

Rhodopseudomonas
sp.

Encontrado
Internet
 d) BACTERIAS ANAEROBIAS ESTRICTAS
- Bacterias reductoras de sulfato

Desulfovibrio sp.

Internet Encontrado

- Bacterias fermentadoras de celulosa

-
Clostridium sp.

Internet Encontrado
VII. CONCLUSIONES

 Mediante la columna de Winogradsky se logró observar los distintos niveles que

macroscópicamente se pueden observar en la columna (variación de color) que
vendrían hacer los microespacios que ocupan microorganismos específicos
categorizados funcionalmente.
 Los microorganismos observados crecen a lo largo de la columna en diferentes
lugares y tiempos, debido a las necesidades vitales y ambientales. Todos los
microorganismos cumplen un papel fundamental a lo largo de todo el proceso, es
decir por ejemplo los microorganismos aerobios degradan compuestos y los
convierten en metabolitos que sirven como fuente de alimentación de los
microorganismos anaerobios.
 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Madigan, M.T., J.M. Martinko y J. Parker. 1997. La Herencia de Winogradsky.

En “Brock: Biología de los microorganismos”. 8ª edición. Prentice Hall. p. 493.
Duró, A y J. Urmeneta. 2007. Manchas cromáticas o diversidad de
microorganismos. Investigación y Ciencia. nº 366. Marzo.
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioBiodiversidad.html