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PRÁTICA N° 5: CATÁLISE ENZIMÁTICA VIA FOTOCOLORIMETRIA

Enzimas são proteínas que catalisam uma reação química específica e em sua maioria são
conjugadas, estando associadas a grupos não-protéicos. Sua atividade catalítica depende
da conservação da sua estrutura original e qualquer variação nessa estrutura altera
significativamente sua atividade.
Uma característica comum de todas as enzimas é a presença e uma fenda em sua
estrutura, formada principalmente por resíduos de aminoácidos hidrofóbicos dentro dos
quais se fixam o substrato. Certos resíduos de aminoácidos que são responsáveis pela
interação estérica com o substrato e, portanto, pela especificidade do sistema, estão
localizados nesta fenda, bem como os aminoácidos envolvidos no aspecto catalítico da
reação. Na maioria dos casos estes resíduos são do tipo iônico e mais reativo. Além disso,
a união dos íons precedentes da solução podem também cooperar na presença do
substrato na catálise da reação.
Nesta prática será verificada a cinética enzimática da amilase salivar – uma enzima capaz
de hidrolisar o amido em unidades de maltose e acrodextrinas, onde a determinação da
velocidade da reação está relacionada com fatores cinéticos como: temperatura, pH e
concentração de substrato e da enzima, presença de cofatores e inibidores, etc.

As enzimas são proteínas, normalmente, responsáveis por catalisar reações no organismo


em condições biológicas estáveis em pH neutro, temperaturas amenas e ambiente aquoso,
diferente de um catalisador químico normal que necessita de condições extremas para que
possa aumentar a velocidade de uma reação diminuindo a energia de ativação. Realizam
atividades como digestão de alimentos, envio de sinais nervosos ou contração muscular,
estas não seriam possíveis sem a atividade das enzimas.
Catálise é um processo cinético que ocorre sob efeito de um catalisador, processo que
ocorre com maior rapidez sem mudanças na natureza química.
Existem dois tipos de catálise, a homogênea, onde o catalisador e sistema reacional estão
no mesmo estado físico e a heterogênea, onde o catalisador está em um estado físico
diferente do meio reacional.
O exemplo biológico mais interessante são as enzimas, catalisadores específicos e baratos,
em relação aos catalisadores químicos.
Na catálise enzimática, uma enzima (proteína com sítio ativo) é responsável pela ligação do
substrato, transformando este em produto.
A estrutura do sítio ativo é específica para a reação que ele catalisa, e os grupos de
substratos interagem com os grupos do sítio ativo por meio de ligações de hidrogênio,
formando uma relação chave-fechadura (ATKINS, 2008).

1.2 Aspectos Cinéticos


Ao medir-se a velocidade inicial de uma reação de transformação de substrato \u2192
produto, quando catalisada por uma determinada concentração de enzima em condições
constantes de reação, pode-se observar que a velocidade inicial varia com a concentração
do substrato. O gráfico obtido da velocidade inicial vs concentração do substrato, é formado
por uma curva hiperbólica
.
O gráfico demonstra que em baixas concentrações de substrato a velocidade inicial é
diretamente proporcional e a altas concentrações de substrato, a velocidade atinge um
máximo, onde seu valor passa a ser independente da concentração do substrato.
Equação de Michaelis-Menten:
A equação de Michaelis\u2013Menten descreve como a velocidade de reação v depende
da posição
do equilíbrio ligado ao substrato e da constante de velocidade.
A constante de Michaelis, Km, é definida como a concentração para a qual a velocidade da
reação enzimática é metade de Vmax. Isto pode verificar-se ao substituir Km = [S] na
equação de Michaelis-Menten. Se o passo para determinação da velocidade for lento,
quando comparado com a dissociação do substrato, então a constante de Michaelis Km é
aproximadamente à constante de dissociação do complexo ES, embora tal situação seja
relativamente rara.

O gráfico de Lineweaver-Burk, ou representação de duplo recíproco, é a forma mais comum


e simples, de mostrar os dados cinéticos, apesar de não ser a mais viável. Para tal, tomam-
se os valores inversos de ambos os lados da equação de Michaelis-Menten.

Fazendo um gráfico de 1/VO versus 1/[S], obtém-se uma reta cujo coeficiente angular é
Km/Vmax. O coeficiente linear é 1/Vmax.

No ar a remoção do hidrogênio do catecol, formando água e quinona, que apresenta uma


forte absexperimento, usou-se a enzima polifenoloxidase (enzima pertencente ao grupo de
oxidação e redução), extraída da batata, e água oxigenada na reação de oxidação do
catecol.
A polifenoloxidase vai catalisorção no comprimento de onda de 430 nm.Fazendo um gráfico
de 1/VO versus 1/[S], obtém-se uma reta cujo coeficiente angular é Km/Vmax. O coeficiente
linear é 1/Vmax.

No experimento, usou-se a enzima polifenoloxidase (enzima pertencente ao grupo de


oxidação e redução), extraída da batata, e água oxigenada na reação de oxidação do
catecol.
A polifenoloxidase vai catalisar a remoção do hidrogênio do catecol, formando água e
quinona, que apresenta uma forte absorção no comprimento de onda de 430 nm.


● 4 .1 .3 De te rmine K m e V
● máx
● g raficame nte . Ve rifique as unidade s e discuta os re s ultados o btidos.
● Tendo os valores de V0
● e a c once ntraç ão das soluç ões , obteve -se o g ráfico 6 (1/V 0
● vs . 1/[s]).
● De acordo c om o mé to do de Line we aver -Burk, Temos q ue qua nd o x =0
(coef ic ie nte line a r), podem os
● obter o valor de 1/V máx , e extrapola ndo a reta , qua ndo y=0, temos o valor
de -1/Km
● .
● Deste modo pode mos obte r os va lores de se ja dos, se gue e quaç ã o:

● 4 .1 .4 Faça um g ráfico co m os dados o btidos na tabe la 2, abs o rbância vs.
co mprime nto de o nda e
● discuta o resultado.
● Com o g rá fico (7) obtid o, podemos o bservar que em torn o de 3 80n m é
o p ic o de a bs orbância ,
● vis t o que o e xperime nt o fo i re a lizado n o compr ime nto de onda de 430nm ,
o e rro ne ss a a nálise -medida
● foi re lat ivame nte a lto.

● 5 . Q UESTIONÁRIO

● 5 .1 Co mo po de m se r de finidas as e nzimas ? O que é s ubs trato?
● Enz ima s sã o prote ínas ca talisa dora s que aumentam a veloc ida de das
re aç ões se m sere m
● consumidas ou a ltera das durante e s te proces so. Substrato é o c omposto
que sofrerá , de a lg uma forma ,
● a ca talis aç ã o por uma e nzima e spec ífic a.

● 5 .2 Q uais fatores po de m e x plic ar a alta e fic ác ia das e nzimas c o mo c
atalis ado re s?
● Um dos princ ipa is mot ivos pa ra a a lta e f ic iê nc ia das e nzima s como c
a talisa dore s s e de ve à
● formaç ã o do c omplexo e nzima -substra to, o qua l a pre s enta uma
conformaç ã o bem próxima a o e stado
● de transiç ão da re aç ão, re duzin do desta forma a e nergia de a tiva çã o da
re aç ão.

● 5 .3 Q ual a de finiç ão e o s ignificado de K m e Vmax na re ação. Ve ja as
unidade s .
● Vmá x
● é a velocidade má x ima de ca tális e de uma enzima . É um valor te óric o
de velocidade de
● reação, onde toda a e nzima e stá ca talisa ndo u m s ubstrato.
● Km
● é a conc entraç ã o de substra to nec es sá ria para que a veloc ida de e nz
imátic a se ja meta de da
● ve loc idade tota l. O K m
● é uma forma de medir a a finidade da e nzima pelo subs trato, s endo ,
quanto
● me nor o Km, ma ior a a finida de da enzima pelo substra to.



● 5 .4 O que é um inibido r e nzimátic o e quais os princ ipais fato re s que
diminue m ativ idade de uma
● e nzima para atua r c o mo c atalis ado r?
● Um in ib idor e nzimá tico é qualquer substância que, de alguma forma ,
possa dim inu ir a
● ve loc idade de uma rea çã o ca talis a da por uma e nzima . Há a lguns fa
tore s que a ltera m a ve locida de de
● reação ca talis ada, logo, a ltera m a ativ idade enzimá t ic a: A c o nce ntraç ão
do s ubs trato (que te m e feito

● na V má x), a te mpe ratura (toda a re aç ã o e nzimá tica te m uma tempe
ra tura ótima , ma s é c omum que
● com a dim inu iç ã o da te mpe ra tura haja dec lín io da ve locida de de re
aç ão), pH (a s re aç õe s também
● possuem um pH ót imo , ma s uma va ria çã o pode ion iza r o sít io ativo ou de
snatura r a e nzima).

● 5 .5 O que aco nte ce s e v ocê mudar o pH o u a te mpe ratura do me
io re ac io nal e mantive r a
● co nce ntração de e nzima e s ubs trato co ns tante s? Ex plique.
● Cada e nzima pos sui u m pH e te mpera tura ideais para o funciona me nto.
● A varia çã o de pH e te mpera tura muda m le vemente a c onforma ç ão da
e nzima , de modo a
● expor ma is ou me nos o sít io a t ivo. O efe it o da m udança de pH e
tempera tura é únic o para c ada
● enzima , s endo as sim , qua nto ma is próxim o do s eu pH/tempe ra tura idea
is de func io namento, ma ior
● afin ida de a enzima te rá pelo subs trato. Quando o limite da muda nç a
de pH ou te mpera tura forem
● extrapoladas , a enzima perde sua c onforma çã o tridimens io nal, pe rdendo s
ua funcionalidade. Quando a
● enzima perde a func iona lida de, diz-se que e la de snaturou-s e por a ltera
re m a s ligaç õe s qu ím ica s que
● ma ntê m s ua estrutura.

● 5 .6 C ite do is e xemplos de e nzimas que atuam e m s is temas biológicos e
ex plique a s ua atuaç ão .
● Pe ps ina: Atua no e stômago, c o m o pH ót imo próx imo de 2. S ua
forma inat iva , o
● pe psin ogên io , t orna -se a tiva quand o entra e m c ontato c om o á cido c lor
ídr ic o do es tôma g o. A pe psina
● atua sobre a a s prote ína s quebrando-a s e m peptíde os me nores, aux
iliando na d igestão das mes ma s e
● no proce sso de quimif ic a ç ão.
● Trips ina: P roduz ida pe lo pâ nc re as , age tanto na s proteínas do estôma
go e do intes t ino
● de lgado. Chega ao d uodeno na s ua forma ina tiva , o tr ips ino gê n io , e
torna -s e ativa quando e ntra e m
● contato c om a e nte roquina se prese nte no s uc o intestinal.

● 5 .7 Q ue tipos de res íduos químicos fo ram ge rados ne s te e x pe rime
nto, e c o mo fo ram trat ado s?
● Ex plique .
● N este e xper ime nto, gero u- se res íd uo q uímico não tó xico, co m fa ixa d e
pH poss íve l d e
● descarte. Entre os co mpo ne nte s dos re s íd uos q uímicos es ta va m a q
uino na, a e nzima
● polife no lo xida se, cate co l e á gua o xige nada.


● 6 . C ONC LUSÃO
● Através do expe rime nto re a lizado, a na lisa mos as pe c tos cinéticos c a talisa
dos por e n zimas , a través
● de dife re nte s c once ntra ções de subs trato. Perce be u-s e uma boa e ficiê
ncia ca talít ic a da e nzima .
● A veloc ida de da reação e nzimá t ic a ta mbém e stá re lac ionada c om a
conc entraç ão do substra to,
● cujo c omp ortame nto c inét ic o é des crito atra vé s da e qua ç ã o de Mic
ha e lis -Menten para a gra nde
● ma ior ia das enzima s.
● Obse rva -se a inda, que a a bs orbânc ia va ria de a c ordo c om o tempo ,
se nd o q ue é d ire tame nte
● proporc iona l a té aprox ima da me nte 60 se gundos tende nd o a se ma nte r c
onstante c onforme o tempo de
● reação a ume nta .
● P ode -se conc lu ir que ness e expe rime nto obte ve -se um valor de Km
0,0 19m o l/L e de Vmá x
● 9,6 x10 ^- 3. A lg uma s d ife re nç as pode m ter ocorrid o dev id o a e rros
dura nte a re a liza çã o do
● expe rime nto. Conc lu iu-se també m que c onforme ma ior o vo lume de c
atec ol utiliza do, menor é a s ua
● ve loc idade inic ia l (Vo).



● Rea gentes : ½ de ba ta ta crua (no c as o de bata ta pe que na), s oluçã o
aquosa 0, 05 mo l/L de
● ca tec ol, á gua deion izada, pe ró x ido de h idro gê n io ~10% , c ubos de gelo.
● Vidraria : 5 cube tas de 3mL para e spec trofotôme tro, 1 béque r de 100mL ,
1 p ipeta de 1mL, 1
● pipeta de 5mL, 1 prove ta de 10mL.
● Equ ipamentos : Cronô me tro, termô me tro, e s pe c trofotôme tro U V -vis íve l,
ba lança .
● Outros: 1 ra la dor/amas sa dor de ba tata s, 1 fa ca pa ra le gume s, 1 re c ipie
nte pa ra banho de ge lo ,
● fras c o lavador pa ra á gua de ion izada.

● 3 .2 PRO CED IMENTO S:
● Inic io u-s e com a pre pa ra çã o do e xtrato de ba tata . Ra lou -se me ia ba
tata pe que na e espreme u-
● se rec olhendo o líquido e m u ma prove ta. Colocou-se a prove ta de ntro
de um béque r de 100mL e
● adic ion ou-s e gelo a o re d or, para re tarda r a oxida ç ão do e xtra to. Após
fora m pr e pa radas a s soluções
● na s c ubetas, contendo c atec ol 0,05mo l/ l e água destilada e 1 gota de
peróxid o de ox igê n io.
● Ligou-s e o e spec trofotôme tro e ac e rtou-se o ze ro (fe ito para cada
cubeta ) de a bs orbânc ia no
● compr ime nto de onda má x imo de a bsorçã o da quin ona (4 30nm).
● P re pa rou-se a s c ubetas c om a s me dida s de ac ordo c om a ta be la
1, de ixa ndo o e xtrato pa ra
● adic ionar em c ada cube ta no momento a ntes de ca da le itura , a pós a c
erta r o zero. Fora m feita s le itura s
● a ca da 20 se gundos, p or 3 minut os .

● 4 .1 .3 De te rmine K m e V
● máx
● g raficame nte . Ve rifique as unidade s e discuta os re s ultados o btidos.
● Tendo os valores de V0
● e a c once ntraç ão das soluç ões , obteve -se o g ráfico 6 (1/V 0
● vs . 1/[s]).
● De acordo c om o mé to do de Line we aver -Burk, Temos q ue qua nd o x =0
(coef ic ie nte line a r), podem os
● obter o valor de 1/V máx , e extrapola ndo a reta , qua ndo y=0, temos o valor
de -1/Km
● .
● Deste modo pode mos obte r os va lores de se ja dos, se gue e quaç ã o:


● 4 .1 .4 Faça um g ráfico co m os dados o btidos na tabe la 2, abs o rbância vs.
co mprime nto de o nda e
● discuta o resultado.
● Com o g rá fico (7) obtid o, podemos o bservar que em torn o de 3 80n m é
o p ic o de a bs orbância ,
● vis t o que o e xperime nt o fo i re a lizado n o compr ime nto de onda de 430nm ,
o e rro ne ss a a nálise -medida
● foi re lat ivame nte a lto.