UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO”

FACULTAD DE INGENIERIA PESQUERA Y DE ALIMENTOS

ESCUELA PROFESIONAL INGENIERIA DE ALIMENTOS

M I C R O B I O LO G Í A D E
ALIMENTOS

PRACTICAN03

“MEDIOS DE CULTIVO”
PROFESOR: Ing. Barzola

INTEGRANTES:
 ALOMÍA PASTOR, Ketty Gianella.

 ANICAMA DELGADO, Carolina Ysabel.

 DÍAZ DÍAZ, Isela.

 DORREGARAY NORIEGA, Guillemo Cesar.

2018
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1. INTRODUCCIÓN
La curva del crecimiento bacteriano resulta de la representación gráfica de la
determinación periódica del número de células viables que existen en un
medio de cultivo, nutritivo, EMB y Mccorkey, Agar nutritivo y caldo nutritivo.
Con la cuantificación de microorganismos a través del tiempo es posible el
representar gráficamente el crecimiento microbiano.
Se contaron las colonias visibles originadas de la inoculación de caldo
nutritivo y agar nutritivo, estas resultantes de 24 horas de incubación. Se
anotó su morfología y nuevamente se realizó el mismo procedimiento para
observar si hubo crecimiento o las colonias presentes llegaron a la fase
estacionaria o de muerte.
Existen varias fases: Latencia, exponencial, estacionaria y de muerte. Esta
práctica tuvo el fin de representar el crecimiento de las colonias presentes en
un total de 6 cajas Petri con medio de cultivo a su vez se identificó la
morfología de determinadas colonias.

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2. OBJETIVOS
Establecer la curva de crecimiento de un cultivo bacteriano.
Capacitar al estudiante en el manejo del espectrofotómetro y sus
aplicaciones en el trabajo del laboratorio.
Proporcionar a los estudios los conceptos físicos y químicos que
permiten a la espectrofotometría ser una herramienta de análisis en el
laboratorio.

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3. DESARROLLO DEL TEMA

3.1 CRECIMIENTO MICROBIANO.

3.1.1 Definición.
Entendemos por crecimiento microbiano el aumento del número de
microorganismos a lo largo del tiempo. Por tanto, no nos referimos al
crecimiento de un único microorganismo (ciclo celular), sino al demográfico.
El crecimiento de una población es el aumento del número de células como
consecuencia de un crecimiento individual y posterior división.
3.1.2 Ciclo Celular.
Las células aisladas cultivadas en un volumen finito de medio de cultivo
apropiado van utilizando los nutrientes que tienen disponibles, sintetizando
sus propios componentes celulares y dividiéndose en cuanto duplican su
masa y su material genético. El tiempo que tarda una célula en cumplir ese
proceso se denomina tiempo de generación (τ) y puede variar desde unos 20
minutos en condiciones óptimas hasta varios meses en condiciones
ambientales. Cada vez que transcurre un tiempo de generación, el número
de células se duplica, siguiendo, por tanto, un incremento exponencial.

3.2 ETAPAS DE LA CURVA DE CRECIMIENTO:

 FASE DE LATENCIA:
Las células bacterianas se aclimatan al nuevo ambiente y las
características de estas. En estas fases condiciones apropiadas para
ello.se da inicialmente un crecimiento en masa celular y luego
comienzan a formarse nuevas células.

 FASE DE CRECIMIENTO EXPONENCIAL:

La población bacteriana se incrementa exponencialmente (el mismo
número de células por la misma unida de tiempo). Las células se han
adaptado al ambiente.

 FASE ESTACIONARIA:

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La tasa de crecimiento disminuye por la acumulación de desechos

metabólicos y el agotamiento de los nutrientes, La tasa de crecimiento
iguala la tasa de mortalidad.

 FASE DE MUERTE:
La población bacteriana disminuye por el agotamiento total de
nutrientes, los efectos tóxicos de los desechos metabólicos y las
modificaciones sustanciales en el ambiente.

3.3 CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE UN CULTIVO DISCONTINUO.

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PARÁMETROS
En este apartado vamos a revisar el estudio de la cinética del crecimiento de
microorganismos que crecen aislados que no forman ningún tipo de
estructura. Esta es la forma de crecimiento de las levaduras (hongo
unicelular) y bacterias.
Es importante conocer la cinética de crecimiento de los cultivos microbianos
para predecir cómo va a evolucionar un cultivo, cómo va a ir consumiéndose
el substrato y cómo se van a ir acumulando los productos del cultivo.
Conociendo estos factores es posible iniciar el cultivo a mayores escalas.
RENDIMIENTO (Ys) DE LOS CULTIVOS.
El gráfico siguiente representa la variación de la biomasa (o número de
células, etc.) de un cultivo a lo largo del tiempo. En este cultivo, se va
consumiendo un substrato cuya concentración decrece de forma
proporcional al crecimiento de la biomasa.
A la tasa específica de consumo de substrato (qs) la podemos considerar la
“velocidad” con la que el organismo consume el substrato. Evidentemente,
cuanto mayor sea la tasa de consumo mayor será la tasa de crecimiento (μ).
qs = Ys/μ (ecuación 8)
Asimismo, cuanto mayor sea el rendimiento del substrato consumido,
también mayor será la tasa de crecimiento. Sin embargo, hay una cierta
compensación entre la tasa de consumo del substrato y el rendimiento de
forma que los microorganismos que tienen altas tasas de consumo de
substrato tienen rendimiento más bajos (o cuando se dan las condiciones
para una alta tasa, el rendimiento disminuye). A esta relación inversa se le
conoce con el nombre de efecto Pasteur.
Por último, nos falta relacionar la velocidad de crecimiento (μ) con la
concentración de substrato (S). En condiciones de substrato abundante, la
concentración de este no afecta al valor de μ; pero cuando el substrato se
hace limitante, sí existe ese efecto. La expresión matemática que relaciona
ambos parámetros se conoce con el nombre de ecuación de Monod y es la
siguiente:

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μ = μmax [S/(Ks+S)] (ecuación 9)

En esta ecuación la tasa de crecimiento (μ) depende de la máxima que puede
alcanzar el microorganismo (μmax), de la concentración de substrato (S) y de
un valor constante, Ks, que representa la concentración de substrato a la que
se alcanza una tasa de crecimiento igual a la mitad de la máxima. La ecuación
de Monod tendrá mucha importancia al tratar de cultivos continuos. Para
que se cumpla esta ecuación el rendimiento debe ser independiente de la
concentración de substrato. En la práctica, los valores de Ks suelen ser muy
bajos, lo que indica que los microorganismos crecen con tasas (μ) muy
próximas a las máximas (μmax) a concentraciones de substrato bajas y sólo
cuando estas son extremadamente bajas, la velocidad de crecimiento se
reduce. Esto es debido a que los sistemas de transporte de nutrientes suelen
tener valores de Km considerablemente reducidos (La Km indica la
concentración de substrato a la que la velocidad de transporte es la mitad de
la máxima).

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3.4 CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO LÍQUIDO

Si la bacteria crece en un medio líquido, en la mayoría de los casos las células
que se producen en cada división forman una suspensión de células libres.
En un cultivo discontinuo de bacterias en medio líquido, se pueden
diferenciar cuatro fases en la evolución de los parámetros que miden el
crecimiento microbiano.
1.- Fase lag o de adaptación durante la que los microorganismos adaptan su
metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de
nutrientes y condiciones de cultivo). En esta fase no hay incremento en el
número de células, pero hay gran actividad metabólica, aumento en el
tamaño individual de las células, en el contenido proteico, ADN y peso seco
de las células.
2.- Fase exponencial o logarítmica: en ella la velocidad de crecimiento es
máxima y el tiempo de generación es mínimo. Durante esta fase las bacterias
consumen a velocidad máxima los nutrientes del medio. La evolución del
número de células durante esta fase se explica con los modelos matemáticos
descritos anteriormente.
Si un cultivo que está creciendo en fase exponencial es inoculado al mismo
medio de cultivo bajo las mismas condiciones de crecimiento, no se observa
fase de latencia y el crecimiento exponencial sigue a la misma velocidad.
3.- Fase estacionaria: en ella no se incrementa el número de bacterias (ni la
masa u otros parámetros del cultivo). Las células en fase estacionaria
desarrollan un metabolismo diferente al de la fase exponencial y durante ella
se produce una acumulación y liberación de metabolitos secundarios que
pueden tener importancia industrial.

Fases del crecimiento microbiano

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4.- Fase de muerte: Si la incubación continúa después de que una población

microbiana alcanza la fase estacionaria, las células pueden seguir vivas y
continuar metabolizando, pero va a comenzar una disminución progresiva en
el número de células viables y cuando esto ocurre se dice que la población ha
entrado en fase de muerte.

3.5 CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO SÓLIDO

Las fases, parámetros y cinética de crecimiento discutidas para el caso de los
cultivos líquidos se presentan también en cultivos sólidos. La cinética de
crecimiento, en este caso, se puede estudiar siguiendo la evolución del
número de células viables por unidad de superficie o por unidad de masa.
Cuando una célula aislada e inmóvil comienza a crecer sobre un substrato
sólido, el resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. Por
consiguiente, se denomina unidad formadora de colonia (UFC) a una célula
bacteriana viva y aislada que si se encuentra en condiciones de substrato y
ambientales adecuadas da lugar a la producción de una colonia en un breve
lapso de tiempo. Si el número inicial de bacterias por unidad de superficie es
muy alto, la confluencia de las colonias da lugar a lo que se llama
un césped cuando se realizan los cultivos en placas de laboratorio.
En el caso de microorganismos móviles (deslizantes) o en el de los hongos
filamentosos que tienen un crecimiento trófico no se producen colonias
aisladas sino formaciones más difusas o miceliares.
3.6 MEDIDA DEL CRECIMIENTO Y ENUMERACIÓN DE
MICROORGANISMOS

Existen diferentes sistemas para detectar y medir el crecimiento de

microorganismos.
Los métodos mas utilizados son el recuento de viables en placa y el método
turbidimétrico:
1.- Recuento de viables: Consiste en la dilución de una muestra (con solución
salina estéril, buffer fosfato, agua peptona) hasta que las bacterias se diluyan
lo suficiente como para contar con precisión. Se siembra un volumen

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determinado de cultivo o muestra sobre el medio de cultivo sólido adecuado

para estimar el número de viables contando el número de colonias que se
forman puesto que cada una de estas deriva de una célula aislada. Las placas
de final de la serie debe tienen entre 25 y 250 colonias (o entre 30 y 300
colonias). Menos de 25 las colonias no son aceptables por razones
estadísticas, y más de 250 colonias en una placa es probable que produzcan
colonias muy cerca unos de otros para ser distinguidos como distintas
unidades formadoras de colonias (UFC).
En ciertas ocasiones en las que la densidad de microorganismos es
demasiado baja, éstos se pueden recolectar por filtración a través de una
membrana (de 0.2 μm de tamaño de poro) y posterior colocación de la
membrana en un medio de cultivo adecuado para que se formen las
colonias.

Las relaciones de dilución, pueden presentarse ya sea con dos puntos (:) o
barras (/). Una barra indica la proporción de una parte a un conjunto, por
ejemplo, 1 / 2 significa 1 de 2 partes, con de un total de 2 partes. Dos puntos
indica la proporción de 1 parte a 2 partes, con un total de 3 partes. Así, 1 / 2
es igual a 1:1, pero 1:2 es igual a 1 / 3.
2.- Método turbidimétrico: el sistema se basa en que las células en
suspensión dispersan la luz causando la turbidez del cultivo. La turbidez
depende de la masa en suspensión y, por tanto, midiendo esta se puede

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estimar aquella. Este es el parámetro de medida más fácil de usar en los

cultivos de laboratorio. La densidad de células debe ser del orden de 105 por
ml. Esta metodología se basa en la ley de Lambert-Beer.
Ley de Lambert-Beer:
Hay una relación exponencial entre la transmisión de luz a través de una
sustancia y la concentración de la sustancia, así como también entre la
transmisión y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa. Si conocemos Io y I1,
la concentración de la sustancia puede ser deducida a partir de la cantidad
de luz transmitida.
La intensidad de la energía radiante transmitida I1 es menor a la intensidad
inicial Iodebido precisamente a que la solución fue capaz de absorber cierta
cantidad de energía radiante.
La linealidad de la ley de Beer-Lambert se ve limitada por factores químicos
e instrumental:
* Desviaciones en los coeficientes de absorción a altas concentraciones (>
0,01 M), debido a las interacciones electrostáticas entre las moléculas en las
proximidades.
* Dispersión de la luz por partículas en la muestra.
* Fluoresecencia o fosforescencia de la muestra.
* Los cambios en el índice de refracción a alta concentración del analito.
El lector de Microplaca nos permite realizar el seguimiento del crecimiento
microbiano midiendo la turbidez del cultivo en los pocillos de una microplaca
(200 ml de cultivo). La lectura de la densidad óptica del cultivo se realiza
automáticamente en los tiempos indicados por el operador, durante todo el
tiempo de incubación sin necesidad de tomar muestras a los tiempos
correspondientes.
Obtenemos curvas de crecimiento como se observa en la figura siguiente:
Crecimiento de Listeria innocua 7 en caldo cerebro corazón, a 37 ºC en
diferentes condiciones. Cada curva corresponde a un pocillo de la
microplaca. El software entrega el valor de la velocidad máxima (m) como
Vmax para cada pocillo (círculo).
Otros métodos de recuento:

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3.- Recuento directo: consiste en la observación al microscopio de volúmenes

muy pequeños de suspensiones de bacterias. Se usan unos portaobjetos
especiales denominados cámaras de Petroff-Hausser. Para que la medida sea
correcta es necesario que la densidad de células sea del orden de 105 por ml.
4.- Medida del número de partículas usando contadores electrónicos de
partículas. Estos sistemas no nos indican si las partículas corresponden a
células vivas o muertas; pero nos pueden dar una idea del tamaño de las
partículas.

4 PARTE EXPERIMENTAL
4.1 MATERIALES

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Cajas Petri

Tubo de ensayo con tapa

Asa bacteriológica

Mechero

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Cultivo bacteriano

REACTIVOS
Agar nutritivo
Caldo nutritivo

EQUIPOS
Incubadora
Espectrofotómetro SQ118
Baño maría
Cámara flujo laminar con luz UV

La incubadora y el baño maría deberían estar previamente calibrados a la

temperatura requerida. No manipular el equipo y mantenerlo cerrado. Abrir
solamente para incluir el cultivo a incubar.

4.2 PROCEDIMENTO

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DETERMINACIÓN DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DE UN CULTIVO

BACTERIANO
 Transfiera con el asa bacteriología una porción de cultivo bacteriano a
un tubo de ensayo conteniendo (5ml) de caldo nutritivo. Prepare dos
cultivos (2 tubos de ensayo) para obtener una réplica.
 Determine el porcentaje de transmitancia (%T) de los cultivos
inicialmente preparados en la parte anterior, utilizando el
espectrofotómetro previamente calibrado a 660nm.
 Coloque los cultivos a incubar en “baño maría” a 35-37°C, realizando
agitaciones suaves cada cinco minutos para asegurarse de distribuir las
células y los nutrientes.
 Realice lectura del porcentaje de transmitancia de sus cultivos en el
espectrofotómetro cada 10 minutos hasta obtener la curva de
crecimiento del cultivo.
 Convertir el porcentaje de transmitancia obtenida en cada lectura a el
valor de densidad óptica del cultivo, aplicando la fórmula: D.O=2-log
%T.
 Con los valores convertidos realizamos la curva de crecimiento de su
cultivo bacteriano, cruzando las variables tiempo versus densidad
óptica.

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5 CONCLUSIONES

 Mediante este método podemos observar la calidad que tiene los

productos que consumimos y los microorganismos patógenos que se
encuentran en dichos productos alimentarios.

 Nos proporciona observar las diferentes bacterias que se encuentran

en los alimentos y saber cuan óptimos se encuentran para el consumo
humano.

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6 BIBLIOGRAFIA

 BENSON, HAROLD. 1981. Microbiological applications. A laboratory

manual in generalmicrobiology. Wm. C. Brown Company Publishers.
Iowa.

 MADIGANM.T.MARTINKO J.M y PARKER J.BROCK.Biologia de los.

Octava edición. Pearson Prentice Hall, Madrid,2004.

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