Abstrak

Sampel rambut pasien psikiatri dianalisis dengan kromatografi cair-tandem mass spectrometry
(LC-MS-MS) untuk neuroleptik clozapine, flupentixol, haloperidol, penfluridol, thioridazine,
dan zuclopenthixol. Dalam penelitian ini, neuroleptik ini diberikan kepada pasien secara teratur
selama minimal enam bulan. Persiapan sampel dilakukan dengan mencuci, bedak dengan ball
mill, ekstraksi obat dari rambut dengan ultrasonication dengan metanol, pembersihan dengan
ekstraksi fase padat dan analisis LC-MS-MS menggunakan multiple reaction monitoring
(MRM). Kalibrasi dilakukan untuk semua obat dalam kisaran 0,05 sampai 10 ng / mg
menggunakan bubuk rambut berduri dan doxepind3 sebagai standar internal. Dua puluh hingga
50 mg bubuk rambut digunakan dan batas deteksi LC-MS-MS di bawah 0,05 ng / mg untuk
semua obat yang diuji. Dosis terapeutik, jumlah subjek, warna rambut, dan jumlah obat yang
terdeteksi adalah sebagai berikut: dozapine (150--400 mg / hari; n = 3, coklat muda, coklat
sedang, hitam; 0,47-0,92 ng / mg), haloperidol (150 rag / 3 minggu; n = 1, hitam / abu-abu;
12,2 ng / mg), penfluridol (20-30 rag / minggu; n = 2, cokelat sedang, hitam; 0,08 ng / mg;
tidak terdeteksi dalam satu kasus) ,

thioridazine (100-400 rag / hari; n-- 4, coklat muda, coklat sedang, hitam; 0,33-9,91 ng / mg,
tidak terdeteksi pada satu kasus). Selain obat aktif juga desmethyl-metabolit dari clozapine dan
thioridazine dideteksi oleh LC-MS-MS. Namun, flupentixol (5 rag / hari; rambut coklat muda)
dan zuclopenthixol (350 rag / 3 minggu; rambut coklat muda) tidak terdeteksi oleh metode ini
dalam satu kasus masing-masing, meskipun obat diberikan secara teratur kepada pasien ini.
Perbandingan dosis dan warna rambut dalam dua kasus dengan thioridazine dan penfluridol
menunjukkan bahwa faktor interindividual lain mungkin memiliki pengaruh pada konsentrasi
obat pada rambut.

pengantar

Selama 10 tahun terakhir, teknik analisis rambut telah dikembangkan untuk mendeteksi obat
terlarang (1). Sampai saat ini, lebih dari 100 obat terlarang dan terlarang dan metabolit obat
telah diidentifikasi dalam rambut, dan konsentrasi yang terdeteksi telah ditinjau baru-baru ini
(2). Misalnya, berbagai konsentrasi telah ditemukan untuk amitriptyline (3,4), dothiepin,
mianserin dan thioridazine (4), carbamazepine (5), chlorpromazine (4,6), maprotiline (2),
meprobamate (7), phenobarbital (8 ), dan lain-lain. Deteksi terutama dilakukan dengan
menggunakan spektrometri massa kromatografi gas (GC-MS) atau kromatografi cair kinerja
tinggi (HPLC) dengan deteksi fotodioda-array. Derivatisasi telah digunakan untuk mendeteksi
normetabolites dari antidepresan trisiklik oleh GC-MS. Analisis rambut untuk agen neuroleptik
telah dilakukan dalam beberapa kasus. Misalnya, haloperidol (6,9-11), clozapine (12-14), dan
thioridazine (4) dapat dideteksi pada rambut pasien dengan GC-MS dan pipamperone
ditemukan dengan kromatografi cair- spektrometri massa (LC-MS) di rambut (15). Deteksi
neuroleptik penfluridol, flupentixol, dan zuclopenthixol belum dilaporkan oleh analisis rambut.
Tujuan dari pekerjaan ini adalah pengembangan metode untuk mendeteksi obat-obatan ini di
rambut pasien psikiatri dengan dosis yang diketahui. Konsentrasi rambut dari berbagai obat
yang diperoleh setelah dosis yang sama dapat berbeda berdasarkan jumlah yang besar

karena pengaruh pada penggabungan obat, seperti lipofilisitas dan kebasaan obat, kandungan
melanin rambut, dan perbedaan pertumbuhan rambut (2,16,17). Selanjutnya, korelasi antara
konsentrasi obat dalam rambut dan dosis dan waktu asupan obat umumnya buruk. Deteksi obat-
obatan pada rambut dalam banyak kasus hanya untuk kepentingan forensik; Namun, dalam
beberapa kasus klinis, mungkin menarik jika obat telah diambil selama beberapa minggu
(penyalahgunaan obat atau kepatuhan) atau jika pantang dari obat-obatan dapat dipertahankan
oleh pasien setelah perawatan psikiatri penyalahgunaan narkoba.

Analisis rambut juga dapat membantu untuk memperkirakan perkembangan toleransi karena
asupan jangka panjang obat-obatan tertentu, yang dapat menjadi penting ketika toksisitas darah
dan konsentrasi jaringan postmortem harus dinilai dalam kasus forensik.

Material dan metode

Instrumentasi

Instrumentasi berikut digunakan: Sistem HPLC (Shimadzu, Duisburg, Jerman): pompa

LC10AD, mixer gradien tekanan rendah, detektor diode-array (DAD) SPDM10A, modul
antarmuka CBM10A, kolom RP-C8-pilih B, 125 mmx 2-ram id, ukuran partikel 5-1Jm (Merck,
Darmstadt, Jerman). Antarmuka LC-MS: sumber SCIEX TurL boIonSpray TM (Applied
Biosystems, Langen, Germany). Spektrometer Massa (MS): SCIEX AP1365 triple-quadrupole
MS (Applied Biosystems), perangkat lunak MassChrom 1.0 dan Multiview 1.4. Pelarut untuk
HPLC adalah air deionisasi (<0,1 pS dari cartridge-deionizer, Memtech, Moorenweis, Jerman),
asetonitril, 25% amonia berair dan asam format (kelas analitik, Merck). Gradien yang
digunakan adalah pelarut A (lmM amonium format / 0,1% asam format, pH 3) dan pelarut B
(asetonitril / 0,1% asam format): 0 hujan: B 10%; 0-6,6 hujan: B linear dari 10% hingga 30%;
6.6-26.6 hujan: B linear dari 30% hingga 70%, 26,6-33,3 hujan: B linear dari 70% hingga 90%.

Persiapan dan analisis sampel

Sampel rambut (segmen 1-2 cm, mewakili bagian rambut yang telah tumbuh selama terapi
dengan neuroleptik ketika konsentrasi steady-state telah tercapai) dicuci dengan tiga pelarut
dan bubuk dengan ball mill. Doxepin-d3 (100 ng), diperoleh dari Promochem / Radian (Wesel,
Jerman), ditambahkan ke 50 mg bubuk rambut yang kemudian diekstraksi dengan
ultrasonication dengan 4 mL metanol. selama 2 jam Pelarut diuapkan, residu dilarutkan dalam
dapar fosfat (pH 6,0) dan fase padat diekstraksi menggunakan mode campuran SPE-cartridges
("Chromabond Drug", 3 mL / 200 rag, Macherey- Nagel, D ~ iren, Jerman) dan SPE-perangkat
otomatis (RapidTrace, Zymark, Idstein, Jerman) (18). Metode ekstraksi baru-baru ini
dijelaskan untuk ekstraksi obat penyalahgunaan dari sampel serum (19). Eluat evaporasi
direkonstitusi dalam 100 IJL HPLC pelarut (A: B, 1: 1, v / v), dan 20 IJL disuntikkan ke dalam
sistem LC-MS-MS. Untuk pengembangan metode, spektrum produk-ion diperoleh dari standar
obat dan beberapa percobaan reaksi dikembangkan untuk mendeteksi transisi yang dipilih (ion
molekuler => ion fragmen). Transisi yang digunakan dirangkum dalam Tabel I.

Kalibrasi dilakukan dengan sampel rambut berduri (konsentrasi obat 0,05 sampai 10 ng / mg)
yang diperlakukan dengan cara yang sama seperti sampel rambut pasien. Untuk konsentrasi
yang lebih tinggi dalam sampel rambut (untuk haloperidol dalam kasus 1P18 dan untuk
thioridazine dalam kasus 5Ru22) hanya 20 mg rambut bubuk yang digunakan dengan 100 ng /
mg doxepin-d3, dan hasilnya dihitung ulang oleh faktor perkalian 2,5. Pemulihan (n = 5) dari
ekstraksi dari bubuk rambut berduri dan selanjutnya SPE dibandingkan dengan injeksi larutan
standar yang tidak diekstraksi ke dalam sistem LC-MS-MS.

Validasi metode

Pemulihan (n = 5) dari rambut bubuk berduri dan selanjutnya SPE berkisar antara 53 dan 92%
(lihat Tabel I). Linearitas yang baik dicapai dalam rentang konsentrasi yang mencakup dua
dekade (0,05-5 ng / mg, menggunakan 50 mg rambut bubuk). Intra-assay dan interassay
precision dievaluasi dengan menganalisis sampel rambut kosong berduri (0,2 ng / mg setiap
obat) lima kali dalam satu seri dan sekali pada masing-masing lima hari berikutnya (lihat Tabel
II). Batas deteksi (dengan rasio signal-to-noise 3) dan batas kuantisasi (tiga kali batas deteksi)
diberikan pada Tabel II.
Hasil analisis toksikologi

Clozapine / norclozapine, thioridazine / northioridazine, penfluridol, dan haloperidol terdeteksi

pada rambut pasien oleh LC-MS-MS menggunakan ionisasi elektrospray. Penfluridol dan
thioridazine tidak ditemukan pada salah satu dari dua (penflufidol) dan satu dari empat kasus
(thioridazine). Zuclopenthixol dan flupentixo] tidak terdeteksi setelah dosis terapi jangka
panjang (batas deteksi 0,008 n ~ mg dan 0,011 n ~ mg, masing-masing). Hasil dari analisis
toksikologi dirangkum dalam Tabel III. Pada Gambar I struktur kimia senyawa dan fragmentasi
oleh MS-MS ditampilkan. Angka 2 dan 3 menunjukkan kromatogram analisis LC-MS-MS dari
dua kasus.

Diskusi

Berbagai faktor, seperti sifat fisiko-kimia dan farmakokinetik obat, serta kandungan melanin
rambut dan pertumbuhan rambut, mempengaruhi penggabungan obat ke dalam rambut. Selain
itu, stabilitas obat dan kerentanannya terhadap degradasi atau oksidasi pada rambut mungkin
memiliki pengaruh pada kemampuan mendeteksi. Meskipun prosedur LC-MS-MS yang
digunakan di sini untuk analisis sejumlah terbatas rambut pasien psikiatri sangat sensitif untuk
analit target, tidak mungkin untuk mendeteksi zuclopenthixol dalam satu kasus, penfluridol
dalam satu dari dua kasus, thioridazinein satu empat kasus, dan flupentixol dalam satu kasus.
Selanjutnya, korelasi antara warna rambut, dosis, dan konsentrasi terdeteksi tidak ditemukan
seperti yang diharapkan ketika mengenai kasus 2W19 dan 5RU22. Dalam kasus 2W19,
konsentrasi thioridazine dan penfluridol lebih rendah daripada yang ditemukan dalam kasus
5RU22, meskipun 2W19 memiliki rambut hitam dan 5RU22 memiliki rambut cokelat sedang,
dan dosis untuk 2W19 lebih tinggi daripada untuk 5RU22. Satu perbedaan yang jelas adalah
kandungan lemak tubuh, 2W19 memiliki berat badan ideal dan 5RU22 kelebihan berat badan.
Temuan ini menunjukkan bahwa rasio dosis per kilogram berat badan serta kandungan lemak
tubuh mungkin penting. Perbedaan interindividual ini harus dipertimbangkan ketika
konsentrasi obat dalam rambut dibandingkan dan perlu diselidiki lebih detail. Clozapine
(5,9,10,11), haloperidol (12,13,14), dan thioridazine (4) telah ditemukan pada rambut dengan
metode GC-MS sebelum oleh penulis lain. Namun, dengan menggunakan LC-MS-MS
dimungkinkan untuk juga mendeteksi penfluridol, yang merupakan neuroleptik lain yang
diaplikasikan dalam dosis yang sangat rendah, serta metabolitnya Northernioridazine dan
norclozapine.
Kesimpulan

Sedangkan hasil positif dari analisis rambut segmental dapat membuktikan indikasi
penggunaan obat selama periode waktu tertentu, hasil negatif untuk neuroleptik tioridazine,
zuclopenthixol, dan flupentixol, seperti yang ditemukan dalam penelitian ini, tidak boleh
dianggap sebagai bukti bahwa salah satu dari ini obat-obatan belum diminum secara teratur
oleh pasien. Ini juga bisa menjadi kasus untuk obat lain atau zat lain (mis., Agen doping).
Karena publikasi hasil positif untuk presentasi strategi analitis baru lebih mungkin ("menjadi
yang pertama untuk mendeteksi obat di rambut") daripada publikasi kasus di mana metode baru
gagal mendeteksi analit yang menarik, ada adalah kemungkinan bahwa hasil negatif dalam
analisis rambut, meskipun asupan biasa senyawa dapat dibuktikan, kurang terwakili dalam
literatur ilmiah. Jadi, itu mungkin, itu obat-obatan belum terdeteksi di rambut lebih sering
setelah asupan lama, dari yang telah dilaporkan sejauh ini. Studi terkontrol tambahan dengan
rambut pasien harus dilakukan untuk penyelidikan keberadaan korelasi asupan obat jangka
panjang dan konsentrasi obat pada rambut, dengan mempertimbangkan perbedaan
interindividual yang dapat mempengaruhi obat penggabungan dalam rambut.