SAN MARCOS
UNIVERSIDAD DEL PERÚ, DECANA
DE AMÉRICA
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
AMILOLÍTICOS Y PRODUCCION DE
AMILASA EN CULTIVO SUMERGIDO
Rojas Rua, Ada Jany; Vilca Somosa Paul Diego; Pamela; Medrano Villanueva Bryan Jose; Huaringa
Olave Allison Valeria; Amaro Huamani Diego Alonso
RESUMEN:
Las amilasas son enzimas que hidrolizan moléculas de almidón dando diversos productos
incluyendo maltosa (β-amilasa), dextrina (α-amilasa) y glucosa.
Se aislaron microorganismos con actividad enzimática productores de amilasa (amilolíticos)
que constituyen a un grupo microbiano llamado zimógeno, son importantes en la
microbiología agroindustrial, puesto que es la base para la disponibilidad de nuevas cepas
que puedan ser utilizadas en producción industrial. Utilizamos muestras de suelo en la cual
su número aumenta de acuerdo a la cantidad de sustrato
La producción industrial de amilasa se realiza principalmente mediante fermentación
sumergida, aunque existe también la posibilidad de producirla por fermentación en sustrato
sólido. Las bacterias y hongos como Bacillus y Aspergellus son utilizados como
microorganismos productores.
PALABRAS CLAVES: amilolítica, zimógeno, amilasa, sustrato
ABSTRACT:
Amylases are enzymes that hydrolyze starch molecules giving various products including
maltose (β-amylase), dextrin (α-amylase) and glucose.
Microorganisms with amylase-producing enzymatic activity (amylolytics) that constitute a
microbial group called zymogen were isolated. They are important in agroindustrial
microbiology, since they are the basis for the availability of new strains that can be used in
industrial production. We use soil samples in which their number increases according to the
amount of substrate
The industrial production of amylase is mainly carried out by submerged fermentation,
although there is also the possibility of producing it by fermentation on solid substrate.
Bacteria and fungi such as Bacillus and Aspergellus are used as producing microorganisms.
KEY WORDS: amylolitic, zymogen, amylase, substrate
Introducción
Amilasas es la denominación que ha recibido aquella familia de carbohidrasas encargadas de
la degradación del almidón, una de los polisacáridos más conocidos según Redleman (2000).
Según Pandey et al. (2000), su uso en la biotecnología es importante para diferentes procesos
industriales como lo son las industrias de los alimentos, del papel y los textiles, siendo muy
útil al reemplazar los procesos de hidrólisis del almidón mediante métodos químicos, los
cuales suelen dejar tras de sí residuos contaminantes. Estas son enzimas que se han reportado
muy extensamente en los microorganismos (aunque también en animales y plantas), siendo
la α-amilasa y la glucoamilasa las que se identifican con mayor frecuencia en estos. Debido
a su gran importancia, la producción de estas enzimas a gran escala es sin duda beneficiosa.
Sin embargo, primero debemos tener en cuenta que es necesario identificar a los organismos
que son capaces de producirla. La OEA (2000) establece que el éxito o fracaso de un proceso
fermentativo va a depender del microorganismo elegido, teniendo en cuenta ciertos criterios
como es la estabilidad genética de la cepa, que tenga una alta velocidad de crecimiento, que
esté libre de contaminantes (como fagos), que tengan requerimientos nutricionales tales que
sean satisfechos por medios de costo reducido, de fácil conservación por largos períodos de
tiempo sin perder sus características, que sea capaz de realizar el proceso fermentativo
completo en un lapso corto de tiempo y que si fuese obtenerse un producto lo haga con el
mayor rendimiento y con la mejor facilidad de extracción del medio posible . Las fuentes de
cepa pueden ser naturales o de una colección de cepas. Una vez elegida la fuente de
aislamiento, su éxito dependerá de la técnica usada por el mismo. Entre estas técnicas
tenemos al aislamiento directo y el uso del enriquecimiento del cultivo. En el primero es
deseable que el medio que se utiliza para el aislamiento posibilite la máxima expresión del
material genético del organismo, basándose en la forma de crecimiento o en la formación de
halos de degradación del sustrato u otro factor.
Materiales y métodos
Parte I
Enriquecimiento in situ.
- Muestra de suelo enriquecido.
- 4 placas Petri estériles.
- 1 frasco de tapa de rosca o Erlenmeyer con 90 ml de agua destilada estéril.
- 2 tubos con 9.9 ml de agua destilada estéril.
- 3 tubos con 9 ml de agua destilada estéril.
- 2 pipetas de 1 ml estériles.
- 1 Erlenmeyer con 60 ml de medio de aislamiento para hongos
Parte II Muestreo
- Caja de vidrio o plástico con yodo metálico.
- Aguja de Kölle.
- Láminas porta y cubre-objetos.
- 2 tubos en cuña con APD.
Parte III y IV
- 1 Tubo con 5 ml de agua destilada estéril.
- 1 Erlenmeyer de 250 ml con 80 ml de medio de producción de amilasas.
- Centrífuga.
- 2 Tubos de centrífuga de 15 ml.
- Sustrato para amilasa.
- 4 Pipetas de 1 ml.
Procedimiento
Parte I
Fecha 28/09
Fecha de inicio del cultivo
Sábado 29 de setiembre
Domingo 30 de setiembre
Lunes 1 de octubre
Martes 2 de octubre
Miércoles 3 de octubre
Jueves 4 de octubre
Viernes 5 de octubre
Sábado 6 de octubre
Domingo 7 de octubre
Lunes 8 de octubre
Martes 9 de octubre
Miércoles 10 de octubre
Muestreo (noche anterior a la práctica)
Aislamiento
1. Mezclar cuidadosamente la muestra de suelo.
2. Pesar 10 g de la muestra y agregarlos al frasco o Erlenmeyer que contiene 90 ml de agua
destilada estéril y rotularlo como dilución 100.
3. Agitar el frasco durante 10 min.
4. Realizar las diluciones indicadas en el esquema siguiente:
5. De las diluciones 10-3, 10-5, 10-6 y 10-7 tomar 1 ml y agregarlo a una placa Petri estéril.
6. Adicionar a cada placa Petri aproximadamente 15 ml de agar de aislamiento.
7. Incubar las placas a 30°C durante 5-7 días.
8. Proceder con la parte II.
Parte II
1. Colocar las placas Petri dentro de una caja de vidrio o plástico (con tapa hermética)
conteniendo yodo metálico hasta que el medio adquiera un color morado.
2. Las colonias de microorganismos amilolíticos presentarán un halo incoloro.
3. Elegir la colonia que presente el mayor halo de hidrólisis (incoloro).
4. Realizar un trasplante de la colonia elegida a dos tubos en cuñas de APD. Incubar los
tubos a 30° C hasta la siguiente sesión de prácticas.
5. Realizar una observación microscópica de la colonia elegida. En base a la observación
realice un intento de identificación.
Parte III
1. Inocule 6 x 106 esporas del microorganismo correspondiente a un Erlenmeyer
conteniendo 80 ml del medio de producción.
2. Incube el Erlenmeyer en un baño con agitación a 30°C y 200 movimientos por minuto
por 7 días.
Parte IV
Determinación de la actividad de amilasa (prueba de Fehling)
1. En un tubo de ensayo agregar 2ml del reactivo de Fehling A y 2ml del reactivo de
Fehling B.
2. Verter 3ml del filtrado a temperatura ambiente.
3. Introducir el tubo en baño maría durante 3 minutos.
4. Observar y dibujar los resultados.
Discusión y resultados
Luego de realizada la observación microscópica de la colonia amilolítica, se observó lo
siguiente:
Se observaron grandes
cantidades de cocos unidos en
forma de cadenas largas dando
lugar a los llamados
estreptococos y cadenas largas
de cocos pero a su vez su tienen
forma de paquetes a los cuales
llamamos estafilococos.
Debido a la pequeña tinción de color morado que se observaron en las respectivas placas
Petri, se concluye la presencia de una gran cantidad de colonias amilolíticas en las placas de
las diluciones 10−4 𝑦 10−5 . Además, se aprecia que mientras el color morado sea menor, la
presencia de microorganismos aumenta, tal como se puede apreciar en la dilución de 10-4.
Ya que esta prueba es de microorganismos amilolíticos que hidrolizan almidón el medio de
producción tuvo un gran porcentaje de almidón y tuvo un medio de pH de 6.5 pues el medio
óptimo de las bacterias es de 7.
Con respecto a la actividad de la amilasa mediante la prueba de Fehling se obtuvo un
resultado positivo observándose un color mostaza medio anaranjado.
Conclusiones
Luego de analizar los resultados (todos positivos) en las pruebas a las que fueron sometidos
los microorganismos amilolíticos aislados, véase caja con yodo metálico para reconocer el
halo de hidrólisis y prueba de Fehling para determinar la actividad de las amilasas, podemos
concluir que:
El suelo en el que se suministró la harina (sustrato) era de excelentes condiciones para
la formación de microorganismos productores de enzimas amilolíticas.
Efectivamente las colonias seleccionadas de las placas Petri (por el halo de hidrolisis)
eran las adecuadas ya que en la prueba de Fehling se observó la coloración rojo-
ladrillo (positiva en formación de azucares reductores).
Referencias bibliográficas
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http://publicaciones.unisangil.edu.co/index.php/revista-matices-
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Claudia Sanchez, Carlos Mejia, Carlos Figueroa, Mabel Esquivia, Lina Agudelo. (2005).
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Farmaceutica, Universidad de Antioquia, Medellin Sitio web:
http://www.scielo.org.co/pdf/vitae/v12n2/v12n2a03.pdf
Cuestionario