Anda di halaman 1dari 24

ORIGINAL PASAL Perbandingan metode ekstraksi 

sampel serum yang berbeda dan kesesuaian mereka 


untuk analisis spektrometri massa 
Saudi Pharmaceutical Journal (2015) 23, 689-697 

Thamir M. Alshammari sebuah, Ahmed Ali Al-Hassan b, Taibi B. Hadda d, 


Mohamad Aljofan sebuah, c, 

Farmasi Universitas Hail University, Hail, Arab Saudi b Fakultas Pertanian dan Vet Medicine, Qassim University, Buraidah, 
Qassim 51.432, Arab Saudi c Departemen Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran, Keperawatan dan Ilmu Kesehatan, Universitas 
Monash, Clayton, VIC 3800, Australia d Laboratoire Chimie Mate riaux, FSO, Universite Mohammed 1er, Oujda 60000, 
Maroko 
Diterima 11 Desember 2014; diterima 27 Januari 2015 Tersedia online 10 Februari 2015 
KATA KUNCI 
Mass spektrometri; Metode ekstraksi protein; Sampel serum; Dalam-gel alkilasi 
Abstrak  Mass  spektrometri  telah  banyak  digunakan,  terutama  dalam  penyelidikan  farmakokinetik  dan untuk tujuan pemantauan 
obat  terapeutik.  Seperti  metode  analisis  lainnya  beberapa  kesulitan  ada  di  mempekerjakan  spektrometri  massa,  terutama  bila 
digunakan  untuk  menguji  sampel  biologis,  seperti  untuk  mendeteksi  kandidat  obat  dalam  serum  mamalia,  yang  kaya  akan 
protein,  lipid  dan  konten  lainnya  yang  dapat  mengganggu  obat  yang  diteliti  .  Kompleksitas  proteome  serum  menyajikan 
tantangan  untuk  persiapan  sampel  yang  efisien  dan  sensitivitas  yang  memadai  untuk  analisis  spektrometri massa obat. Prosedur 
pengayaan  sebelum  analisis  obat  seringkali  diperlukan  dan  sebagai  hasilnya,  studi  serum  atau  plasma  komponen  biasanya 
menuntut  baik  metode  pemurnian  atau  penipisan  satu  atau  lebih.  Pemilihan  kombinasi  terbaik  dari  metode  pengenalan  sampel 
adalah  minant  deter-  penting dari sensitivitas dan akurasi spektrometri massa. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui 
aktivitas  curah  hujan  protein  serum  tertinggi  lima  sampel  metode  persiapan  umum  digunakan  dan  menguji  kesesuaian  mereka 
untuk spektrometri massa. Kami melonjak tiga molekul kecil menjadi kelinciserum: 
Singkatan PP, curah hujan protein; MS, spektrometri massa; LC, cair * 
Sesuaikromatografi 
penulisdi:  Departemen  Mikrobiologi,  Fakultas  Kedokteran,  Keperawatan  dan  Ilmu  Kesehatan,  Universitas 
Monash, Clayton, VIC 3800, Australia. Tel .: +966 53100 8895; fax: +613 9902 9500. 
alamatE-mail: m.aljofan@gmail.com (M. Aljofan). Peer review di bawah tanggung jawab Universitas Raja Saud. 
Produksi dan hosting yang oleh Elsevier 
http://dx.doi.org/10.1016/j.jsps.2015.01.023 1319-0164 a 2015 Penulis. Produksi dan hosting yang oleh Elsevier atas nama Raja 
Saud University. Ini adalah sebuah artikel akses terbuka di bawah CC BY-NC-ND lisensi 
(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 

Raja Saud University 


Saudi Pharmaceutical Journal 
www.ksu.edu.sa www.sciencedirect.com 
 
690 TM Alshammari et al. 
dan diterapkan metode presipitasi protein yang berbeda untuk menentukan aktivitas curah hujan dan penerapan sebagai alat 
spektrometri massa pengantar. a 2015 Penulis. Produksi dan hosting yang oleh Elsevier atas nama Raja Saud University. Ini 
adalah sebuah artikel akses terbuka di bawah CC BY-NC-ND lisensi (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 
1. Pendahuluan 
Plasma  sering  digunakan  sebagai  matriks  biologi  karena  mudah  untuk mengumpulkan (Olsen et al, 2004;. Sjöholm et al, 1979.). 
Biasanya,  itu  secara  luas  digunakan  dalam  studi  pengembangan  metode  analisis  dan  validasi,  sesaat  sebelum hewan percobaan. 
Memang,  persiapan  sampel  yang tepat sangat penting untuk mendapatkan hasil yang dapat diandalkan dan bermakna. Akibatnya, 
persiapan  sampel  masih  merupakan  daerah  penting  tinggi  ketika  kromatografi  cair  dan  spektrometri  massa  (LC  /  MS  /  MS) 
metode  dikembangkan  untuk  assay  sampel  biologis  (Xu  et  al.,  2005).  Hal  ini  terutama  digunakan  dalam  'optimasi'  dari  sampel 
untuk  analisis  dengan  spektrometri  massa  (MS)  memakai  teknik.  Pentingnya  persiapan sampel adalah untuk memastikan bahwa 
metode  analisis  mempertahankan  unsur  di  tertentu  penting  dari  ketahanan  dan  konsistensi  yang  diharapkan  dalam  setiap  uji 
bioanalytical (Xu et al., 2005). 
Umumnya,  dua  metode  persiapan  sampel  utama  yang  digunakan  untuk  analisis  MS  darah,  serum  plasma  dan  urin  sampel 
ekstraksi  cair-cair  atau  ekstraksi  fase padat (SPE) (Bouzas et al., 2009). Namun, untuk penemuan obat dan farmakokinetik, curah 
hujan  protein  (PP)  /  ekstraksi  adalah  prosedur persiapan sampel yang paling umum, yang merupakan pendekatan plest sim- yang 
membutuhkan  pengembangan  metode  minimal  dan  menghilangkan  sebagian  besar  protein  dari  sampel  (Xu  et  al.  2005).  PP 
dengan  pelarut  organik  larut  (biasanya  asetonitril  atau  metanol)  adalah  metode  persiapan  sampel  yang  paling  umum  digunakan 
karena  biaya  rendah  dan  metode  minimal  mengembangkan-  persyaratan  ment  (Ma  et  al.,  2008).  Sementara,  ada banyak pelarut 
PP  yang  banyak  digunakan  termasuk  pelarut  organik  dan  anorganik  (Bouzas  et  al,  2009;.  Lawson,  1989),  seleksi  pra  dominan 
tergantung  pada  senyawa  diteliti  digunakan. Biasanya, penggunaan metanol sangat berharga bagi dukungan studi farmakokinetik 
praklinis  yang  dilakukan  selama  tahap  optimasi  memimpin  penemuan obat, di mana devel-opment cepat tes untuk senyawa baru 
adalah  penting  (Henry  et  al,  2013;..  Ma  et  al,  2008).  Dalam  upaya  untuk  menyelidiki  ity  suitabil-  dari  masing-masing  pelarut 
yang  digunakan  untuk  analisis  MS  molekul  kecil  dalam  studi  farmakokinetik,  kami  melakukan  PP  menggunakan  lima  sistem 
pelarut  yang  berbeda  dan  dibandingkan  kemampuan  mereka  untuk  pra protein serum cipitate dan ekstrak molekul obat potensial 
untuk MS analisis. 
2. Bahan dan metode 
2.1. Sampel serum 
darah  dikumpulkan  dari  kelinci  yang  sehat  bertempat  di  Fasilitas  Hewan  Kecil  dari  Laboratorium  Kesehatan  Hewan  CSIRO 
Australia.  Serum  diperoleh  dengan  memungkinkan  darah  untuk  membeku  pada  suhu  kamar  selama  2  jam.  Darah  menggumpal 
kemudian disentrifugasi selama 10 menit pada 12,000g. Serum kemudian dikumpulkan dan disimpan pada A20 ° C. 
2.2. Konfirmasi identitas senyawa dan kemurnian menggunakan MS 
Tiga  senyawa  antiviral  potensi  berat  molekul  kecil  (paten  tertunda)  dipilih  untuk  penelitian  ini  dan  diberi  kode  ent  berbeda- 
(AAHL  13,  AAHL  18  dan  AAHL  42).  Pound  com-  awalnya  dilarutkan  dalam  metanol  pada konsentrasi 0,5 mg / ml, kemudian 
diencerkan  dalam  50%  metanol  /  0,2%  asam  format  untuk  konsentrasi  akhir  10  ug  /  ml.  Sampel  diencerkan  dianalisis  dengan 
infus  langsung  pada  tingkat  10  ml  /  menit  ke  sumber  ionisasi  electrospray  dari  spektrometer massa LCQ ion-trap (Thermo, San 
Jose,  CA, USA). Spectra diperoleh dan rata-rata lebih dari 50 scan berturut-turut. Scan penuh diperoleh selama rentang massa m / 
z  50-500  untuk  memberikan  indikasi  kemurnian  sampel.  Resolusi  tinggi  zoom  scan  juga  dilakukan  yang  memungkinkan 
penentuan negara massa / muatan ion yang dipilih dan karenanya pengukuran massa akurat dari ion yang dipilih. 
2.3. Deteksi senyawa dalam serum kelinci 
Kelinci  serum  dibubuhi  tiga  senyawa  yang  diteliti  (AAHL  13,  AAHL  18  atau AAHL 42) di sebuah tion concentra- 0,5 mg / ml. 
Serum  berduri  kemudian  menjalani  presipitasi  protein  menggunakan  metode  yang  dijelaskan.  Supernatan  dari  setiap  perlakuan 
dikumpulkan dan diencerkan 1: 1 dengan 0,4% v / v asam format untuk memberikan komposisi pelarut akhir 50% metanol / 0,2% 
asam format dan dianalisis dengan MS. 
2.4. Metode ekstraksi metanol 
Secara  singkat, 100 ml serum dicampur dengan 900 ml metanol HPLC grade. Berikut sentrifugasi, aliquot dari 100 ml supernatan 
dikeringkan  dan  kemudian  disuspensi  dalam  sampel  elektroforesis  penyangga  (MES)  dan  dianalisis  dengan  elektroforesis,  atau 
aliquots diencerkan dalam 50% metanol / 0,2% formiat asam untuk analisis MS. 
2.5. Metode ekstraksi Folch 
Sebuah  campuran  kloroform-metanol  dengan  perbandingan  2:  1  dengan  vol-  ume  disiapkan  dan  400  ml  campuran  ini 
ditambahkan  ke  100  ml  serum.  Tahap  atas  masing-masing  sampel  digunakan  untuk  analisis,  karena  protein  diendapkan  di  dle 
pertengahan dan fase yang lebih rendah. 
2.6. Metode ekstraksi aseton 
Secara  singkat,  900  ml  aseton  ditambahkan  ke  100  ml  serum.  Supernatan  hanya digunakan untuk analisis. Untuk elektroforesis, 
sampel  dikeringkan  dan  kemudian  resuspended  dalam  buffer  sampel  (MES)  dan  untuk  MS  sampel  analisis  diencerkan  dalam 
50% metanol / 0,2% asam format. 
 
2.7. Metode ekstraksi asetonitril 
Sebuah  volume  100  ml  serum dicampur dengan volume 300 ml asetonitril. Sampel disentrifugasi dan natant super dari campuran 
dikumpulkan dan kemudian dianalisis. 
2.8. Metode deplesi protein proteinase K 
Metode  proteinase  K  dilakukan  sesuai  rekomendasi  sebagai  pembuat  turer ini. Secara singkat, sampel serum diobati dengan 200 
mg  /  ml  proteinase  K  selama  18 jam pada 37 ° C. Dalam rangka untuk menentukan konsentrasi yang paling efektif proteinase K, 
sejumlah  konsentrasi  yang  berbeda  dan  periode inkubasi yang membuntuti. Konsentrasi yang paling efektif kemudian digunakan 
dan dibandingkan dengan metode ekstraksi lainnya. Proteinase K trea- sampel ted disentrifugasi dan supernatannya diambil untuk 
analisis. 
2.9. Konfirmasi presipitasi protein olehelektroforesis 
Supernatandari  protein  diendapkan  sampel  serum  dari  metode  ekstraksi  yang  berbeda  diperoleh  setelah trifugation-abad sampel 
diperlakukan  yang  pellet  protein  diendapkan.  Supernatan  kemudian  dikeringkan  dalam  suatu  konsentrator  vakum  sentrifugal 
(Savant  Speedvac,  Thermo).  Sampel  dikeringkan  kemudian  diencerkan  1:  100  dalam  sampel  elektroforesis  penyangga.  Sampel 
diencerkan kemudian dipisahkan oleh SDS-PAGE dan protein divisualisasikan dengan Coomassie biru atau perak pewarnaan. 
2.10. Dalam-gel alkilasi dan pencernaan protein 
Secara  singkat,  Coomassie  biru  band  patri  dipotong  dari  gel  SDS-PAGE,  dikurangi  dan teralkilasi, di-gel dicerna menggunakan 
tripsin, diekstraksi dan dianalisis menggunakan LC-MS / MS untuk menentukan identitas mereka. 
3. Hasil 
3.1. Konfirmasi identitas senyawa dan kemurnian 
Identitas  dan  kemurnian  masing-masing  tiga  senyawa  (Gbr.  1a-f)  dikonfirmasi  terhadap  massa  yang  diberikan  (Tabel  1).  Dari 
catatan,  sejumlah  puncak  kecil  ditunjukkan  pada  semua  spektrum  (Gambar.  1a-f),  yang  mewakili  pembacaan  latar  belakang 
masing-masing  sampel.  Dengan  demikian,  spektrum  yang  diperbesar  memberikan  ings  read  yang  lebih  akurat  dari  puncak 
dominan  yang  dapat  digunakan  untuk  mengkonfirmasi  tity  iDEN-  dan  memperkirakan  kemurnian  senyawa  diteliti.  Sebuah 
puncak  terlihat  pada  massa  320  jelas  dalam  spektrum  AAHL  42  dan  AAHL  18  (Gbr.  1a  dan  e,  masing-masing).  Sementara 
sumber  puncak  ini  tidak  diketahui,  hal  ini  juga  diketahui  bahwa  sampel  serum yang diendapkan mengandung konsentrasi tinggi 
garam  (Huang  et  al,  2013;.  Cai  et  al,  2002.);  karenanya,  adalah  mungkin  bahwa  puncak  massa  320  adalah  salah  satu  dari 
garam-garam  yang  dominan  hadir  dalam  natant  super.  Yang  penting,  nilai-nilai  massa  yang  disajikan  oleh  puncak  yang  sedikit 
berbeda  dengan yang ada di Tabel 1. Misalnya puncak terdeteksi untuk AAHL 42 berada di 318,1, AAHL 13 berada di 333,1 dan 
AAHL  18  terdeteksi  pada  402,9,  sementara  nilai-nilai mereka dilaporkan (Tabel 1 ) menunjukkan AAHL 42 di 315,8, AAHL 13 
di  332,36  dan  AAHL  18  di  402,16.  Perbedaan  diamati  adalah  karena  fakta  bahwa  nilai-nilai  pada Tabel 1 adalah berat molekul 
nilai 
Perbandingan metode yang berbeda dan kesesuaian 691mereka, 
(massa  rata-rata  isotop  yang  mungkin  termasuk  kurang  berlimpah  alami  isotop)  yang  adalah  nilai-nilai  yang  digunakan  dalam 
tabel  periodik  elemen  (Grueiro  Noche  et  al,  2013;..  Leigh  et  al,  1998)  sedangkan,  nilai  puncak  yang  disajikan  dalam  spektrum 
adalah  dari  spektrum  massa  monoisotop  (spektrum  yang  hanya  berisi  ions  terdiri  dari  isotop  utama  atom  yang  membentuk 
molekul  asli)  (Selvadurai  dan  Meyyanathan,  2011;  McNaught  dan  Wilkinson,  1997).  Massa  monoisotop  adalah  massa  isotop 
kelimpahan unsur kimia secara alami ditemukan, yang juga dikenal sebagai alami isotop kelimpahan (Leigh et al., 1998). 
3.2. Perbandingan metode ekstraksi yang berbeda 
konsentrasi  yang  berbeda  dari  proteinase  K  digunakan  pada  waktu  inkubasi  yang  berbeda  untuk  menentukan  konsentrasi  yang 
optimal  untuk  menggunakan  (lihat  Gambar.  2).  Berdasarkan  hasil saat ini kita dapat menyimpulkan bahwa pada 18 jam inkubasi 
200  ug  /  ml  proteinase  K  telah  dicerna  dan  dihapus  sebagian  besar  protein  serum.  Setelah  tion  determinasi  konsentrasi  K 
proteinase  cocok,  sejumlah  metode  ekstraksi  protein  yang  dikenal  dibandingkan  dengan  menggunakan  analisis  trophoretic 
elektroforesis. 
Semua  konsentrasi  dan  perawatan  dilakukan sesuai pabrikan atau literatur rekomendasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa 
sebagian  besar  pelarut  yang  digunakan  diproduksi penurunan yang signifikan dalam serum protein (Gambar. 3a dan b). Metanol, 
nada  ACE  dan  ekstraksi  asetonitril  metode  hampir  com-  pletely  dihapus semua protein serum. Berdasarkan fakta bahwa metode 
ekstraksi  metanol  efektif  serta  fakta  bahwa  senyawa  diteliti  dilarutkan  dalam  metanol,  memberikan  metode  ekstraksi  metanol 
beberapa tage advan- atas metode lain yang digunakan. 
3.3. Pemulihan senyawa yang diteliti sebagaimana dinilai denganMS 
analisisMS sampel dari supernatan serum diobati dengan aseton, asetonitril, kloroform-metanol dan teinase pro K tidak 
menunjukkan pemulihan dari salah satu senyawa yang diteliti. Namun, salah satu dari tiga pon com- diteliti dari metanol 
diperlakukan AAHL18 serum terdeteksi oleh MS (Gambar. 4). Senyawa itu sebagian besar terdeteksi sebagai aduk sodiated (M + 
Na) pada m / z 425 (juga terlihat pada Gambar. 1 e) dengan jumlah kecil dari non-sodiated pada m / z 403. Pemulihan buruk dari 
dua lainnya senyawa mungkin disebabkan karena berbagai alasan yang berbeda. Yang paling mungkin biochem- istry alasan 
terkait yang mungkin memberikan jawaban ini adalah ketidakstabilan senyawa diteliti (reaksi insentience) dan kemungkinan 
adanya reaktif komponen serum yang tersisa di supernatan setelah PP, yang keduanya memerlukan penyelidikan lebih lanjut. 
3.4. Penentuan diteliti senyawa hilangnya 
Potensi  alasan  untuk  pemulihan  miskin  senyawa  diteliti  dari  serum  diselidiki.  Salah  satu  kemungkinan  yang  bisa  menjelaskan 
tingkat  pemulihan  rendah  dari  senyawa  adalah  stabilitas  senyawa  ini,  yang  dianggap  tidak  mungkin  berdasarkan  data  yang 
diberikan  bahwa  struktur  kimianya  tampak  stabil,  senyawa  ini  disiapkan  hampir  satu  dekade  lalu  dan  komposisi  kimia  mereka 
diperiksa ulang dan con- menguat berulang kali (data tidak ditampilkan). Kemungkinan kedua 
 
mungkinkehadiran  komponen  reaktif  dalam  serum  yang  tersisa  setelah  PP  berbasis  metanol.  Supernatant  kering  dari  metanol 
diekstraksi  sampel  serum  dilarutkan  dalam  umes  vol-  berbeda  MES  penyangga,  dianalisis  dengan  elektroforesis  dan  kemudian 
divisualisasikan  oleh  nitrat  pewarnaan  perak  (Gbr.  5).  Tanpa  diduga,  sampel  terbukti mengandung sejumlah teins pro diketahui, 
yang mungkin, seperti yang berspekulasi, telah bereaksi dengan atau memodi- fikasi senyawa dan dicegah pemulihan mereka. 
692 TM Alshammari et al. 
# 31687_zoom318 # 31687_fs # 1-50 RT: 0,01-0,72 AV: 50 NL: 4.30E6 
# 1-50 RT: 0,01-0,94 AV: 50 NL: 1.08E5 T: + c ms 
[50,00-700,00] 
T: + p ms Z [313,00-323,00] 100 
(a) 95 
318,1 
100 95 
(b) 
317,98 
90 
90 
85 
85 
80 
80 
75 
75 
70 
320,1 
70 
65 
65 
319,96 
60 
60 
55 
55 
50 
50 
45 
45 
40 
40 
35 
35 
30 
30 
25 
25 
20 
20 
15 
15 
318,98 
321,97 322,0 10 
10 
320,92 
320,96 
321,00 

71,4 
86,0 136,1 
149,0 176,9 223,0 238,1 256,2 270,2 302,0 339,9 
362,4 401,3 434,7 
450,9 495,5 
496,5 


314,00 
314,95 315,96 317,04 320,83 322,99 0 
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 
314 315 316 317 318 319 320 321 322 323 m / z 
m / z 
19497_FS # 1-49 RT: 0,01-0,66 AV: 49 NL: 1.66E7 T: + c ms penuh [50,00-700,00] 
(c) (d) 
50 100 200 250 300 150 350 400 450 500 
m / z 
19497_zoom333 # 1-50 RT: 0,01-0,86 AV: 50 NL: 5.21E5 T: + p Z ms [328,00-338,00] 
 
 
 
100 333,1 349,8 355,0 361,7 74,9 112,0 144,0 
95 
90 
90 
85 
85 
80 
80 
75 
75 
70 
70 
65 
65 
60 
60 
55 
55 
50 
50 
45 
45 
40 
40 
35 
35 
30 
30 
25 
25 
20 
20 
15 
15 
333,88 
333,92 
10 
10 
334,91 



171,9 172,9 221 
 
 
 
.2 267,1 313,1 370,8 383,8 449,7 463,9 465,9 
 
 
m / z 
Gambar  1  MS  spektra  dari  senyawa  timbal  3.  Elektron  spektrum  massa  ionisasi  AAHL  42  (a)  dan  format  yang  diperbesar dari 
spektrum  (b),  mewakili  puncak  tinggi  diselesaikan  dengan  baik dari massa yang diharapkan dari senyawa hit sekitar 318. Angka 
(c) dan (d) mewakili elektron spektrum massa ionisasi dan formatnya diperbesar untuk AAHL 13 masing-masing. Puncak-puncak 
tinggi  yang  didefinisikan  333,1  disajikan  dalam spektrum menunjukkan nilai massa yang diharapkan dari senyawa hit. Spektrum 
untuk  senyawa  AAHL 18 hit disajikan dalam angka (e) dan (f) dengan puncak tertinggi dari 402,86 mewakili nomor massa untuk 
senyawa ini (lihat Tabel 1 untuk massa senyawa). 
3.5. Identifikasi protein dari serum kelinci dengan 'di-gel' alkilasi protein dan pencernaan 
Untuk menentukan identitas protein diketahui, empat jalur dari masing-masing band atas dan bawah dari gel patri biru Coomassie 
yang  dipotong  dan  diperlakukan  seperti  di  atas  dan  di  protease  -gel  dicerna  dengan  tripsin.  Umumnya,  Coomassie  noda  biru 
kurang sensitif dibandingkan noda perak; dengan demikian, hanyaatas 
 
Perbandingan metode yang berbeda dan kesesuaian mereka 693 
34652_fs # 1-50 RT: 0,01-0,64 AV: 50 NL: 4.32E7 T: + c ms penuh [50,00-700,00] 
100 150 200 50 250 300 350 400 450 500 m / z 
34652_ZOOM403 # 1-50 RT: 0,01-0,83 AV: 50 NL: 9.21E5 T: + p Z ms [398,00-408,00] 100 
402,9 
100 


 
 
 
 
 
424,9 319,1 401,0 425,9 80,0 94,0 95,9 150,0 
317,1 
402,86 
95 
(e) 
95 
(f) 
90 
90 
85 
85 
80 
80 
75 
75 
70 
70 ecnad 
65 
65 
inti 
60 
ecnad 
60 
A EVIT 
55 
inti 
55 
la e 
50 
A evi 
50 
45 
40 
t la e 
45 
40 
35 
35 
30 
30 
25 
25 
20 
20 
403,84 
15 
15 
10 
10 

320,1 

400,83 
400,92 
358,9 
393,0 440,7 466,8 486,8 400,77 
398,99 400,63 401,06 
401,13 
402,48 
404,80 


404,96 405,85 407,20 407,98 
399 400 401 402 403 404 405 406 407 408 
m / z 
Gambar 1 (lanjutan) 
Tabel 1 Karakterisasi senyawa diteliti. 
Senyawa ID HPLC berat molekul kemurnian (%) Metode mengkonfirmasi senyawa identitas 
AAHL 42 315,8 98,8 ESI MS / 

H NMRA AAHL 13 
323,36 99,8 ESI MS / 1H NMR AAHL 18 402,16 99,5 ESI MS / 

H NMR 
Tabel meliputi identitas, molekul berat, kemurnian HPLC dan metode konfirmasi kemurnian. 
a ESI MS = [electrospray ionisasi massa spektrometri]. 

H NMR = [Hidrogen-1 resonansi magnetik nuklir]. 
1 kDa 2 3 4 5 6 7 8 9 10 188 
98 
62 
49 
38 
28 
17 
14 

Gambar  2  analisis  SDS  PAGE  protein  serum  setelah  pengobatan  dengan  konsentrasi  yang  berbeda  proteinase  analisis  K. 
elektroforesis  serum  kelinci  diobati  dengan  proteinase  yang  berbeda  konsentrasi  K.  Dari  kiri  ke  kanan,  jalur  pertama  memiliki 
penanda  MW,  jalur  2  mengandung  serum  yang  tidak  diobati  diencerkan  1:  200  dalam  menjalankan  penyangga,  jalur  3, 4 dan 5 
adalah  sampel  yang  dicerna  untuk  18h  dengan  100  ug  /  ml,  200  mg  /  ml  300 mg / ml proteinase K, masing-masing. Sementara, 
jalur  6  kosong, jalur 7 sampai 10 berisi sampel serum dicerna dengan konsentrasi yang sama dan urutan jalur sebelumnya kecuali 
ini dirawat selama 1 jam sebagai gantinya. 
band  dan  band  yang  lebih  rendah  (62  dan  12  kDa,  masing-masing)  diwarnai  oleh  perak  nitrat  noda  (Gbr.  5).  Oleh  karena  itu, 
hanya band-band ini dikirim untuk analisis LC-MS / MS. 
Analisis  data  LC-MS  /  MS  baku  untuk gested Band tripsin-di- diketahui atas (62 kDa) mencari terhadap NCBI database yang 
protein  non-redundant  mengungkapkan  pertandingan  untuk  albumin  serum  kelinci.  Tiga  belas  peptida  diidentifikasi  yang 
memenuhi  kriteria  pencarian  korelasi  silang  (lihat  di  peptida  tebal  pada  Gambar.  6)  dan  peptida ini mewakili cakupan 31% dari 
urutan  albumin  serum  kelinci. Tidak ada identifikasi diperoleh untuk tripsin diketahui dicerna band yang lebih rendah ($ 12 kDa) 
(lihat Gambar. 7). 
4. Diskusi 
Kecepatan  dan  keandalan  bioanalysis  throughput  tinggi  dari  calon  obat  dalam  sampel  plasma  sangat  penting  untuk 
farmakokinetik,  farmakodinamik  dan  ies  stud-  toxicokinetic  (Bouzas  et  al,  2009;..  Ma  et  al,  2008). Analisis spektrometri massa 
telah  menjadi  teknik  pilihan  untuk  analisis  (Grueiro  Noche  et  al,  2013;..  Leigh  et  al,  1998)  dan  itu  adalah metode bioanalytical 
paling banyak digunakan di arena penemuan obat. Metode yang dipilih diantisipasi akan digunakan untuk 
 
menganalisissenyawa  diteliti  dari  sampel  serum.  Oleh  karena  itu,  karena  kompleksitas  dari  matriks,  dalam  kebanyakan  kasus 
sebuah tion langkah pencabutan yang untuk sampel bersih-bersih dan pra-konsentrasi, seperti 
694 TM Alshammari et al. 
1 kDa 
2 3 4 5 6 7 8 9 10 kDa 
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 
188 
188 
98 
98 
62 
62 
49 
49 
38 
38 
28 
28 
17 
17 
14 
14 


Gambar  3  SDS  HALAMAN  perbandingan  antara  supernatan  dari  ekstraksi  yang  berbeda  metode.  Analisis elektroforesis serum 
kelinci  dipicu  oleh  metode  presipitasi  protein  yang  berbeda.  Dari  kiri  ke  kanan,  jalur  pertama  mengandung  MW  spidol,  jalur 
kedua  dan  ketiga  mewakili  serum  (1:  100  dalam  menjalankan  buffer)  dan  pelet  dari metanol diendapkan serum masing-masing, 
metode  aseton  presipitasi  (jalur  4),  metode  kloroform-metanol  (jalur  5).  Sementara  jalur  6  merupakan  serum  yang  diendapkan 
dengan  200  mg  /  ml  proteinase  K,  dan  jalur  7  dan  lajur  8  mewakili  asetonitril  dan  metanol  diendapkan  serum, masing-masing. 
Serum diendapkan sampel dikeringkan dan kemudian dilarutkan dalam 100 ml MES, yang 15,6 ml digunakan per lane. 
# 34652_PSS_FS # 1-50 RT: 0,00-0,49 AV: 50 NL: 7.93E6 T: + c ms penuh [50,00-500,00] 

(a) (b) 
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 
m / z 
# 34652_PSS_zoom425 # 1-50 RT: 0,01-0,83 AV: 50 NL: 2.99E5 T: + p Z ms [420,00-430,00] 100 
425,0 
424,88 
499,1 
484,4 

 
 
 
 
 
 
 
469,7 455,0 426,0 440,4 425,87 425,92 235,2 349,3 
 
 
 
 
 
 
 
 
166,1 195,0 203,0 254,3 
270,8 318,3 359,0 71,8 
422,83 
422,94 
426,90 422,76 423,01 423,80 420,84 421,33 422,63 
421 422 423 424 425 426 427 428 429 430 
m / z 
426,80 426,98 427,78 428,96 429,28 
Gambar  4  Spektrum  senyawa  AAHL18  pulih  dari  supernatan  metanol  diperlakukan  serum  .  Sebuah  spektrum  massa AAHL 18 
senyawa  pulih  dari  serum  berduri  (a)  dan  formatnya  diperbesar  (b).  Tingkat  pemulihan  cukup  rendah  dibandingkan  dengan 
kontrol  positif  (Gambar.  1e)  dengan  jumlah  puncak  tinggi  lain  yang  hadir  dalam  spektrum.  Sementara  puncak  diharapkan  dari 
402 hampir hilang, puncak tinggi 425,0 mewakili bentuk sodiated dari AAHL 18 senyawa. 
100 
95 
95 
90 
90 
85 
85 
80 
80 
75 
75 
70 
70 
65 
65 
ecnadnub A ev 
60 
55 
ecnadnub 
60 
50 
A evital 
55 

50 
itale 
45 

45 
40 
40 
35 
35 
30 
30 
25 
25 
20 
20 
15 
15 
10 
10 




(a) Coomassie bluestained gel. (b) Perak bernoda gel. 
curah  hujan  protein,  diperlukan  sebelum  analisis  untuk  mencapai  sensitivitas  yang  diperlukan  (Moreno-Bondi  et  al.,  2009). 
Pentingnya persiapan sampel untuk bioanalytical 
 
1 kDa 2 3 4 5 38 
28 
14 

Gambar  analisis  5  SDS-PAGE  protein  unprecipitated  dari  metanol  diperlakukan  serum.  Pemisahan  elektroforesis  protein  yang 
berasal  dari  supernatan  dari  protein  metanol  diendapkan  serum  kelinci.  Lanes:  (1)  penanda  berat  molekul  lajur  2,  3,  4  dan  5 
supernatant  kering  dilarutkan  dalam  20,  40,  80  dan  100  ml  berjalan  buffer,  masing-masing.  Total  volume  20  ml  per  lajur 
masing-masing  sampel  yang  dimuat  (15,6  ml  sampel  dilarutkan  ditambah  memuat  buffer  membuat  volume  akhir  20  ml).  Gel 
diwarnai dengan perak nitrat. 
metode  tidak  bisa  lebih ditekankan. Langkah persiapan sampel sebelum analisis MS dimaksudkan untuk memfasilitasi penentuan 
komponen kandidat obat yang melibatkan farmakokinetik dan stabilitas metabolik (Huang et al, 2013;. Lee, 2002). 
Studi saat ini menggambarkan tahap awal analisis netic pharmacoki-, metode yaitu analisis validasi menggunakan tiga 
1 MKWVTFISLL FLFSSAYSRG VFRREAHKSE IAHRFNDVGE EHFIGLVLIT FSQYLQKCPY 
61 EEHAKLVKEV TDLAKACVAD ESAANCDKSL HDIFGDKICA LPSLRDTYGD VADCCEKKEP 
121 ERNECFLHHK DDKPDLPPFA RPEADVLCKA FHDDEKAFFG HYLYEVARRH PYFYAPELLY 
181 YAQKYKAILT ECCEAADKGA CLTPKLDALE GKSLISAAQE RLRCASIQKF GDRAYKAWAL 
241 VRLSQRFPKA DFTDISKIVT DLTKVHKECC HGDLLECADD RADLAKYMCE HQETISSHLK 
301 ECCDKPILEK AHCIYGLHND ETPAGLPAVA EEFVEDKDVC KNYEEAKDLF LGKFLYEYSR 
361 RHPDYSVVLL LRLGKAYEAT LKKCCATDDP HACYAKVLDE FQPLVDEPKN LVKQNCELYE 
421 QLGDYNFQNA LLVRYTKKVP QVSTPTLVEI SRSLGKVGSK CCKHPEAERL PCVEDYLSVV 
481 LNRLCVLHEK TPVSEKVTKC CSESLVDRRP CFSALGPDET YVPKEFNAET FTFHADICTL 
541 PETERKIKKQ TALVELVKHK PHATNDQLKT VVGEFTALLD KCCSAEDKEA CFAVEGPKLV 
601 ESSKATLG 
Gambar  6  Urutan  albumin  serum  kelinci.  Urutan  Enbolded  mewakili  peptida  diidentifikasi  dengan  analisis  MS.  Hasilnya 
dibandingkan  dengan  yang  NCBI  database  protein  non-redundant,  dari  yang  tiga  belas  peptida  dari  $  62  kDa  protein  cocok 
kelinci albumin serum. 
Perbandingan metode yang berbeda dan kesesuaian mereka 695 
188 
98 
62 
49 
17 
senyawa  yang  diteliti  (AAHL  13,  AAHL  18  dan  AAHL  42).  Metode  analisis  untuk  mendeteksi  narkoba  merupakan  faktor 
penentu  yang  signifikan  dalam  melakukan  setiap  studi  hewan.  Tujuan  utama  dari  penelitian  farmakokinetik  adalah  untuk 
menentukan  nasib  senyawa  yang  diteliti  setelah  pemberian  untuk  hewan  percobaan.  Ini  hanya  dapat  dicapai  dengan 
menggunakan  metode  analisis  yang  handal  yang  dapat  memberikan  hasil  yang  dapat  diandalkan  dan  diinterpretasi.  Hal  ini 
dianggap  ceptable  unac-  untuk  melakukan  eksperimen  hewan  tanpa  menggunakan  metode  analisis  yang  handal  dan  sensitif. 
Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk  memvalidasi  metode  persiapan  sampel  untuk  analisis  spektrometri  massa  untuk  studi 
farmakokinetik.  Dengan  demikian,  kemampuan  pengendapan  lima  metode  ekstraksi  protein  yang  berbeda dibandingkan dengan 
menggunakan  analisis  elektroforesis.  Persiapan  sampel  plasma  adalah  pertimbangan  utama dalam kehandalan sistem deteksi (Li 
et  al,  2012;.  Ma  et  al,  2008.).  Perbandingan  antara  kemampuan  ekstraksi  protein  dari  masing-masing  metode  yang  berbeda 
menunjukkan  perbedaan  yang  signifikan  antara  metode diuji dengan metode metanol curah hujan yang terbukti telah diendapkan 
sebagian  besar  protein  serum  (Gambar.  3a  dan  b).  Kelarutan  senyawa  yang  diteliti  merupakan  faktor  penting  dalam  pemilihan 
metode,  dan  dalam  penelitian  ini  senyawa  diteliti  yang  larut  metanol;  karenanya,  metanol  terpilih  sebagai  metode  cipitation 
serum  paling  cocok  pra.  Anehnya,  tingkat  pemulihan  yang  sangat  rendah  dari  senyawa  diteliti  diamati  dalam  ekstrak  metanol. 
Setelah  kegagalan  untuk  mendeteksi  senyawa  diteliti  dari  sampel  serum,  ods  meth- lainnya kemudian secara terpisah digunakan 
untuk  menyelidiki  apakah  hilangnya  pound  com-  itu  metanol  terkait.  Pada  tahap  ini,  besarnya  perbedaan  antara  kemampuan 
curah  hujan  serum  diamati  sebelumnya  tampaknya  tidak  penting.  Tingkat  deteksi senyawa diteliti dengan menggunakan metode 
pencabutan  yang  lainnya  tetap  rendah,  menunjukkan  bahwa  ketidakmampuan  mendeteksi  senyawa  yang  diteliti  dalam  sampel 
serum  mungkin  tidak  berhubungan  dengan  sampel  metode  persiapan  yang  digunakan.  Untuk  menguji  teori  ini,  supernatan  dari 
metanol  diendapkan  sampel  serum  dibubuhi  dengan  senyawa  tional  penyelidik.  Analisis  MS  dari  supernatan  berduri  hanya 
menunjukkan  tingkat  rendah  deteksi  salah  satu  dari  tiga  senyawa  yang  diuji  (AAHL  18)  (Gambar.  4), yang secara signifikan di 
bawah batas deteksi. Tingkat deteksi yang rendah menunjukkan adanya komponen serum (s) dalam supernatan, yang 
 
mungkin  mengganggu  senyawa  diteliti.  Menariknya,  Coomassie  analisis  noda  biru  dan  perak  dari  supernatan  dari  metanol 
diendapkan  serum,  jelas  menunjukkan  dua  band  protein  (Gambar.  5).  Analisis LC-MS / MS dari band-band ini mengungkapkan 
bahwa  band  atas  (67  kDa)  adalah  albumin,  tapi  band  yang  lebih  rendah  (12  kDa) tidak cocok dengan database. Oleh karena itu, 
kemungkinan  bahwa  protein  terdeteksi  mungkin  telah  mengganggu  senyawa  diteliti.  Misalnya,  albumin  adalah  protein  yang 
paling  banyak dalam plasma darah (Zammataro et al, 2011;.. Olsen et al, 2004) dan memiliki obat tinggi mengikat afinitas (Wang 
et  al,  2012;..  Sjöholm  et  al,  1979).  Protein  unprecipitated  lain  bisa juga mempengaruhi senyawa. Secara teoritis, supernatan dari 
sampel  serum  yang  diendapkan  gratis  protein,  tetapi  dalam  kenyataannya,  setidaknya  10%  dari  protein  serum,  sebagian  besar 
kurang  dari  20kDa  tetap  unprecipitated  (Alpert  dan  Shukla,  2003).  Kemungkinan  gangguan  protein  serum  dengan  senyawa 
diteliti  berpotensi  dapat  dikonfirmasi  dengan  menggunakan  dialisis  kelinci  serum;  Namun,  konfirmasi  tersebut  tidak  akan 
membuat kontribusi besar untuk pemulihan mereka dengan MS. 
Ketidakmampuan  untuk  mendeteksi  senyawa  dari  sampel  serum  mungkin  disebabkan  karena  beberapa  faktor,  salah  satunya 
adalah ence interfer- komponen serum. Ada kemungkinan bahwa komponen ini rusak atau instan diserap senyawa berduri. 
696 TM Alshammari et al. 
RT: RT: 0,00-74,99 
0,00-74,98 100 
37,77 
NL: 1.02E8 
100 
Base Puncak 
MS Mo # atas 
38,51 
NL: (a) 95 
95 

(b) 
7.03E7 Basis Puncak 
MS Mo # lebih rendah 
90 
90 
85 
85 
38,36 
80 
37,71 
80 
75 
75 
70 
70 
65 
42,17 
65 
ecn 
60 
42,24 
ecn 
60 
adnu 
55 
37,37 36,74 
adnu 
55 
38,30 
b A ev 
50 
b A ev 
50 
38,59 
itale R 
45 
36,68 
itale R 
45 
38,67 
40 
40 
43,03 
35 
35 
43,17 
30 
42,38 
30 42,46 
25 
25 
20 
45,97 
 
 
 
 
 
 
20 15 32,54 35,51 46,05 32,06 15 37,61 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
40 50 60 70 
0 10 20 30 40 50 60 70 
Waktu (min) 
Waktu (min) 
Gambar  7  analisis  spektrometri  massa  protein  unprecipitated. Analisis spektrometri massa $ 62 kDa (a) dan $ 12 kDa (b) protein 
dari  metanol  diendapkan  serum.  Band  dipotong  dari  gel  dan  kemudian  mengalami  dalam  alkilasi  protein  gel  dan  pencernaan. 
Protein dicerna kemudian dianalisis dengan LC / MS / MS. 


Mungkin  juga  mungkin bahwa senyawa diteliti diendapkan dengan protein serum. Sementara endapan tidak dianalisis, kegagalan 
untuk  mendeteksi  senyawa  setelah  spiking  supernatan  dari  metanol  diekstraksi  serum,  yang  seharusnya  tidak  mengandung 
protein  apapun,  mengesampingkan  kemungkinan  co-presipitasi.  Ini  juga  telah  mengesampingkan  kemungkinan  metabolisme 
instan  dari  senyawa  dengan  komponen  serum.  Terlepas  dari  kenyataan  bahwa  senyawa  tersebut  puncak-kasikan  menjadi relatif 
stabil  secara  kimiawi,  stabilitas  mereka  dalam  serum  tidak  ditentukan  dan  dengan  demikian,  ketidakstabilan  senyawa  dalam 
serum  mungkin  juga  menjadi  faktor  yang  mungkin  yang  berkontribusi  pada  tingkat  pemulihan  yang  rendah.  Dari  catatan, 
senyawa  yang  terbukti  stabil  dalam  metanol  baik  pada  suhu  kamar  dan  pada  suhu  4  °  C  di  mana  mereka  disimpan  selama 
berbulan-bulan.  Dengan demikian, metanol tidak akan ered pertimbangan- sebagai faktor yang mungkin untuk pemulihan rendah. 
Deteksi  rendah  dari  senyawa  ini  dari  serum  mungkin  bisa menjadi hasil dari kombinasi alasan yang menyebabkan jumlah residu 
kecil  yang  tidak terdeteksi oleh MS. Namun, mekanisme yang tepat tentang bagaimana senyawa ini hilang masih belum jelas dan 
kecuali ditentukan, kemungkinan hanya akan menjadi spekulasi. 
Persiapan  sampel merupakan bagian penting dari MS untuk sampel serum analisis. Tampaknya ada perbedaan yang signifikan 
antara kemampuan curah hujan protein dari lima metode diuji, dengan ekstraksi metanol menunjukkan memiliki tertinggi 
 
aktivitascurah  hujandi  antara  semua.  The  inability  of  completely  precipitating  all  serum  proteins  warrants  further  investigation 
into possible method modification to possibly enhance protein precipitation activity. 
Acknowledgements 
MA  is  supported  by  National  Health  and  Medical  Research  Council  of  Australia  (Peter  Doherty  Biomedical  Fellowship 
#GNT1037092). The author would like to thank Mr. Brian Shield for his valuable assistant with mass spectrometry. 
References 
Alpert, AJ, Shukla AK, 2003. Precipitation of large, high-abun- dance proteins from serum with organic solvents. The 
Association of Biomolecular Resource Facilities (ABRF). No. P111-W, Denver, USA. Bouzas, NF, Dresen, S., Munz, B., 
Weinmann, W., 2009. Determination of basic drugs of abuse in human serum by online extraction and LC-MS/MS. Anal. 
Bioanal. Chem. 395 (8), 2499– 2507. Cai, K., Miller, JL, Stenland, CJ, Gilligan, KJ, Hartwell, RC, Terry, JC, Evans-Storms, RB, 
Rubenstein, R., Petteway Jr., SR, Lee, DC, 2002. Solvent-dependent precipitation of prion protein. Biochim. Biophys. Acta 1597 
(1), 28–35. Grueiro Noche, G., Ferna ́ndez Laespada, ME, Pe ́rez Pavo ́n, JL, Moreno Cordero, B., Muniategui Lorenzo, S., 
2013. Determination of chlorobenzenes in water samples based on fully automated microextraction by packed sorbent coupled 
with programmed temperature vaporization-gas chromatography-mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem., June 19. Henry, M., 
Kowalczyk, M., Maldini, M., Piacente, S., Stochmal, A., Oleszek, W., 2013. Saponin inventory from Argania spinosa kernel 
cakes by liquid chromatography and mass spectrometry. Phytochem. Anal. http://dx.doi.org/10.1002/pca.2440, June 18. Huang, 
X., Chen, L., Yuan, D., 2013. Development of monolith-based stir bar sorptive extraction and liquid chromatography tandem 
mass spectrometry method for sensitive determination of ten sulfonamides in pork and chicken samples. Anal. Bioanal. Chem., 
June 19. Lawson, A., 1989. In: Lawson, AM (Ed.), Mass Spectrometry. 
Walter de Gruyter, pp. 435–450. 
Comparison of different methods and their suitability 697 
Lee, MS, 2002. LC/MS Application in Drug Development. John 
Wiley & Sons, Inc., New York. Leigh, GJ, Favre, HA, Metanomski, WV, 1998. Principles of Chemical Nomenclature: A 
Guide to IUPAC Recommendations. Blackwell Science, pp. 50–71, ISBN 0-86542-6856. Li, H., Wen, XS, Di, W., 2012. A 
simple LC-MS/MS method for determination of magnolol in rat blood and its application in a pharmacokinetic study. 
Arzneimittelforschung 62 (2), 83–87. http://dx.doi.org/10.1055/s-0031-129548, Epub 2012 February 16. Ma, J., Shi, J., Le, H., 
Cho, R., Huang, JC, Miao, S., Wong, BK, 2008. A fully automated plasma protein precipitation sample preparation method for 
LC-MS/MS bioanalysis. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 862 (1–2), 219–226. McNaught, AD, Wilkinson, A., 
1997. In: Compendium of Chemical Terminology, second ed.. The Gold Book Blackwell Science, pp. 1307–1375, ISBN: 
0-86542-6848. Moreno-Bondi, MC, Marazuela, MD, Herranz, S., Rodriguez, E., 2009. An overview of sample preparation 
procedures for LC-MS multiclass antibiotic determination in environmental and food samples. Anal. Bioanal. Chem. 395 (4), 
921–946. Olsen, H., Andersen, A., Nordbo, A., Kongsgaard, UE, Bormer, OP, 2004. Pharmaceutical-grade albumin: impaired 
drug-binding capacity in vitro. BMC Clin. Pharmacol. 4, 4. Selvadurai, M., Meyyanathan, SN, 2011. Determination of deflaza- 
cort in human plasma by liquid chromatography-mass spectrome- try after liquid-liquid extraction and its application in human 
pharmacokinetics studies. Pharm. Methods 2 (2), 106–111. http:// dx.doi.org/10.4103/2229-4708.84450. Sjoholm, I., Ekman, B., 
Kober, A., Ljungstedt-Pahlman, I., Seiving, B., Sjodin, T., 1979. Binding of drugs to human serum albumin: XI. The specificity 
of three binding sites as studied with albumin immobilized in microparticles. Mol. Pharmacol. 16 (3), 767–777. Wang, D., Li, F., 
Li, P., Zhang, J., Liu, L., Xu, P., Zhou, L., Liu, X., 2012. Validated LC-MS/MS assay for the quantitative determina- tion of 
clematichinenoside AR in rat plasma and its application to a pharmacokinetic study. Biomed. Chromatogr. 26 (10), 1282–1285. 
http://dx.doi.org/10.1002/bmc.269, Epub 2012 February 16. Xu, X., Lan, J., Korfmacher, WA, 2005. Rapid LC/MS/MS method 
development for drug discovery. Anal. Chem. 77 (19), 389A–394A. Zammataro, A., Civiale, C., Saletti, R., Foti, S., 2011. 
Development and validation of a liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry method for the 
quantification of latanoprost free acid in rabbit aqueous humor and ciliary body. J. Mass Spectrom. 46 (11), 1168–1174. 
http://dx.doi.org/10.1002/ jms.2004.