Metode Perhitungan Bakteri dengan Cara Multi Probale Number

1. Sejarah
Metode Most Probable Number MPN muncul sekitar awal abad 20
sehingga dikenal sudah sangat lama di dalam ilmu mikrobiologi. Estimasi akurat
dari tabel MPN dipublikasikan oleh Mc Crady pada tahun 1915 kemudian dasar
statistik dari metode MPN dikemukakan oleh Halvorson dan Ziegler pada 1933,
Eisenhart dan Wilson pada 1943 dan Cochran pada1950. Woodward menyarankan
tentang pengabaian hasil positif yang dapat meningkatkan kesalahan laboratorium
dalam tabel MPN. De Mann pada tahun 1983 mempublikasikan tentang metode
perhitungan tingkat kepercayaan (convidence interval) dalam tabel MPN. Sampai
sekarang metode MPN telah menjadi salah satu metode standard untuk menghitung
jenis Coliform, Fecal Coliform, Escherichia coli, dan S. aureus.
MPN adalah suatu metode perhitungan mikroorganisme berdasarkan data
kualitatif hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri
tabung untuk memperoleh kisaran data kuantitatif jumlah mikroorganisme tersebut
(MPN/ml(g)). Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel sampai
tingkat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang sesuai dan
jika ditanam dalam tabung menghasilkan frekuensi pertumbuhan tabung positif.
2. Prinsip Kerja
a) Uji Penduga
Praktikum hitungan MPN, percobaan pertama yang dilakukan adalah uji
penduga untuk menghitung jumlah tabung positif yang ditumbuhi mikroba setelah
diinkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam. Alat dan bahan yang digunakan adalah
5 pipet ukur 1 ml, 1 bulb hisap yang berfungsi untuk menghisap larutan, 1 rak
tabung reaksi, 4 tabung reaksi berisi pepton sebagai pengencer, 9 tabung reaksi
berisi media cair berupa lactose broth dan juga berisi tabung durham sebagai media
untuk menanam sampel, 2 gelas beker, masing-masing 500 ml dan 1000 ml, alkohol
70%, tisu, vortex untuk menghomogenkan larutan, korek dan bunsen.
Bahan yang digunakan berupa sampel air yang sudah terdapat bakteri
didalamnya. Ketika semua alat dan bahan siap kemudian mengaseptis diri dan
lingkungan dengan cara menyemprotkan alkohol 70% ke telapak tangan dan
kepunggung tangan, kemudian dilanjutkan dengan menyemprotkannya ke meja
kerja dan dibersihkan dengan cara dilap searah dengan menggunakan tisu.
Proses selanjutnya dilakukan pengenceran sampel, untuk sampel air
diencerkan hingga 10-4, Pertama menuangkan sampel ke gelas beker, kemudian
membuka semua kertas payung yang masih menutupi kapas penyumbat tabung
reaksi, menyalakan bunsen, melabeli plastik pipet ukur sesuai dengan jumlah
pengenceran yaitu 100–10-5, plastik PE pembungkus pipet ukur dibuka sedikit
hanya pada ujung-ujungnya saja supaya badan dari pipet ukur tidak terkena udara
dari luar, bulb lalu dipasangkan pada ujung tumpul pipet ukur. Pipet ukur pertama
yaitu dengan label pengenceran 100 yang diujungnya telah terpasang bulb
selanjutnya digunakan untuk mengambil sampel yang telah dituang ke gelas beker
sebanyak 1 ml, bulb yang digunakan terlebih dahulu dikempiskan dengan cara
menahan tombol A diatas bulb dan menekan bulb hingga semua udara didalamnya
keluar, kemudian cara mengambilnya adalah dengan menekan tombol S untuk
menghisap larutan sampel. Setelah larutan sampel masuk kedalam pipet ukur tepat
1 ml dengan memperhatikan meniskus bawah untuk sampel jernih.
Kapas penyumbat tabung reaksi berisi pepton dengan label 10-1 dibuka
dengan cara dijepit menggunakan jari kelingking dan jari manis tangan kanan dan
ditarik keluar, mulut tabung selanjutnya dipanasi sebentar di atas bunsen untuk
menghilangkan adanya kemungkinan bakteri yang menempel pada mulut tabung, 1
ml sampel yang telah diambil dan ada didalam pipet ukur selanjutnya dimasukkan
kedalam tabung ukur dengan cara menekan tombol E pada bulb agar semua larutan
didalam pipet ukur keluar, mulut tabung reaksi dipanaskan kembali sekali lagi dan
kemudian ditutup dengan sumbat kapas. Tabung reaksi berisi pepton dengan label
pengenceran 10-1 selanjutnya menghomogenkan larutan didalamnya.
Setelah dihomogenkan kemudian melakukan pengenceran kedua, tabung
reaksi pepton 10-1 dibuka tutup sumbat kapasnya, mulut tabung reaksi dipanaskan
dan cairan didalamnya diambil 1ml dengan menggunakan pipet ukur 1ml yang
berlabelkan 10-1, mulut tabung reaksi dipanaskan dan ditutup dengan sumbat
kapas. Kemudian tabung reaksi kedua berisi pepton dengan label pengenceran 10-2
disiapkan, dibuka tutup kapasnya dan dipanaskan mulut tabung reaksi sebentar
diatas bunsen. Selanjutnya cairan didalam pipet ukur dikeluarkan didalam tabung
reaksi, mulut tabung reaksi selanjutnya kembali dipanaskan dan ditutup dengan
menggunakan sumbat kapas, tabung kemudian di vortex untuk menghomogenkan.
Pengenceran kemudian dilakukan hingga didapatkan nilai pengenceran
yang diharapkan. Setelah diencerkan hingga ke nilai pengenceran yang diharapkan,
3 pengenceran terakhir dari masing-masing sampel selanjutnya ditanam didalam
tabung reaksi yang berisi lactose broth dan tabung durham untuk menguji adanya
bakteri koliform dalam tiap sampel. Pertama mengambil larutan sampel dari tabung
reaksi yang berisi pepton dengan label pengenceran 10-2 untuk sampel air
menggunakan pipet ukur sesuai dengan label yang telah dipasangi bulb pada
ujungnya, caranya sumbat kapas dibuka, mulut tabung reaksi dipanasi, pipet ukur
dimasukkan hingga terkena larutan dan bulb ditekan huruf S, setelah terambil 1 ml
kemudian pipet dikeluarkan, mulut tabung reaksi dipanasi sekali lagi untuk
selanjutnya ditutup dengan menggunakan sumbat kapas.
Tabung reaksi yang berisi lactose broth dan durham dipersiapkan, sumbat
kapas dibuka, mulut tabung reaksi dipanaskan, pipet ukur dimasukkan sedikit dan
bulb ditekan tombol E untuk mengeluarkan semua larutan didalam pipet ukur. Pipet
ukur dikeluarkan dan mulut tabung reaksi dipanaskan sekali lagi, kemudian sumbat
kapas ditutupkan. Tabung reaksi tidak perlu di vortex karena didalamnya terdapat
tabung durham. Tiap pengenceran dari tiga pengenceran terakhir diambil 3 ml
larutannya untuk dimasukkan ke dalam tiga tabung reaksi yang berisi vortex
masing-masing 1 ml menggunakan pipet ukur 1 ml. Tabung reaksi berisi lactose
broth yang telah ditambahkan larutan pengenceran sampel dan disumbat dengan
kapas selanjutnya pada ujung atas ditutup dengan menggunakan kertas payung dan
dikareti. Tabung reaksi selanjutnya diinkubasikan pada suhu 37°C selama 48 jam.
Setelah, itu diamati pembentuk gas pada tabung durham dan tingkat kekeruhan
yang ada. Setalah itu dicatat tabung yang positif dan dihitung.
b) Uji Penguat
Setelah melakukan uji penduga, kegiatan selanjutnya adalah melakukan
uji penguat. Alat dan bahan yang dibutuhkan adalah dua cawan petri yang berisi
media EMBA untuk menginokulasikan bakteri yang tumbuh pada tabung reaksi
LB, alkohol 70%, tisu, rak tabung, ose, dan dua tabung reaksi yang positif tabung
reaksi positif ditandai dengan terbentuknya gelembung udara pada tabung durham
sebanyak 10% atau lebih dan perubahan warna larutan menjadi keruh akibat asam
yang dihasilkan dari adanya aktivitas metabolisme dari bakteri yang
memfermentasi laktosa.
Pertama yang dilakukan adalah aseptis diri dan lingkungan dengan cara
menyemprotkan alkohol 70% ke kedua telapak tangan dan punggung tangan dan
kemeja kerja kemudia dibersihkan dengan cara dilap searah dengan memakai tisu,
kemudian mensterilisasi ose yang akan digunakan dengan cara mencelupkan ose ke
larutan alkohol 70% dan dipanasi diatas bunsen dan dilakukan sebanyak tiga kali.
Cawan petri yang akan menjadi tempat inokulasi digambar kuadran. Tabung reaksi
positif yang paling banyak gelembung selanjutnya dibuka tutup dan sumbat
kapasnya, mulut tabung reaksi dipanaskan sebentar, ose yang telah steril
dimasukkan untuk mengambil bakteri yang berbentuk seperti gumpalan putih,
mulut cawan petri dipanaskan, ose kemudian dikeluarkan dari tabung reaksi dan
dimasukkan kedalam cawan petri digoreskan pada kuadran I, ose dikeluarkan dan
dibakar lalu dibiarkan hingga dingin dan gores pada kuadran I dilanjutkan ke
kuadran II, dilakukan cara ini hingga ke kuadran IV.
Melakukan kegiatan yang sama untuk semua sampel. Setelah selesai
kemudian cawan petri dibalik dan dibungkus dengan menggunakan kertas payung,
selanjutnya diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam untuk diamati pertumbuhan
bakteri koliform fekal dan non-fekalnya.
c. Uji Pelengkap (Complete test)
Uji pelengkap dilakukan dengan menginokulasikan koloni bakteri pada
medium agar dengan cara digoreskan dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu
35˚C. agar yang digunakan adalah endo agar dan Eosin Metil Blue (EMB).
Pembenihan pada media agar ini mengakibatkan media agar menjadi bewarna ungu
tua dengan kemilau tembaga metalik dan membentuk koloni dengan pusat gelap
(Willey, 2008).
MEDIA YANG DIGUNAKAN
Lactose broth digunakan untuk menumbuhkan Salmonella dan bakteri
koliform dari makanan, air dan hasil ternak. Reaksi enzimatis elatin dan ekstrak
sapi memberikan sumber karbon dan nitrogen untuk pertumbuhan bakteri pada
lactose broth. Laktosa adalah karbohidrat. Fermentasi laktosa dibuktikan dnegan
timbulnya gas. Agar Eosin Methylene Blue (EMB) merupakan media padat untuk
menentukan jenis bakteri E.coli dengan memberikan hasil positif dalam tabung dan
memiliki indikator berupa eosin dan methylene blue. Media EMB ini mempunyai
keistimewaan mengandung laktosa dan berfungsi untuk membedakan mikroba
yang memfermentasikan laktosa seperti S. aureus, P. aerugenosa, dan Salmonella.
Mikroba yang memfermentasi laktosa menghasilkan koloni dengan inti
berwarna gelap dengan kilap logam. Sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh
koloninya tidak berwarna. Fungsi dari eosin dan metilen blue membantu
mempertajam perbedaan warna. Namun demikian, jika media ini digunakan pada
tahap awal, kuman lain bisa juga tumbuh terutama P. Aerugenosa dan Salmonella
sp. Hal ini dapat menimbulkan keraguan. Media ini sangat baik untuk
mengkonfirmasi bahwa kontaminan tersebut adalah E.coli
Brilliant Green Lactose Bile Broth adalam pengujian MPN digunakan
sebagai uji kepastian atau uji penegasan pada media yang digunakan. BGLB
merupakan media yang akan berubah menjadi warna hijau metalik jika terdapat
reaksi fermentasi dengan media karena adanya koloni coliform yang bereaksi
Media BGLB merupakan media yang digunakan untuk uji bakteri coliform yang
biasanya terdapat pada air minum, air limbah, makanan dan produk susu serta
produk lain yang menjadi perhatian sanitasi. Komposisi media ini adalah petone
untuk menyediakan nitrogen , vitamin, mineral dan asam amino esensisal untuk
pertumbuhan bakteri, laktosa merupakan karbohidrat yang difermentasi sehingga
dapat menyediakan karbon dan energi. Oxbile dan brilliant ngreen dapat
menghambat bakteri gram positif dan bakteri garm negatif kecuali coliform. Media
BGLB dibuat dengan menimbang bubuk media sebanyak 8 g dan dilarutkan dengan
aquadest sebanyak 200 ml, warna dari media BGLB adalah hijau tua . Kemudian
dipanaskan dengan kompor listrik sampai homogen, dan di cek pH media BGLB
yakni 7,4 ± 0,2 setelah itu di tuang media BGLB kedalam tabung reaksi yang telah
berisi tabung durham (posisi terbalik) sebanyak 10 ml, dan dipastikan tidak
terdapat gelembung udara dalam tabung durham. Kemudian di tutup tabung reaksi
dengan kapas berlemak dan kertas buram untuk selanjutnya disterilisasi di
autoclave dengan suhu 121ºC selama 15 menit
DAFTAR PUSTAKA