La cuantificación de proteínas es una parte de la concentración de las proteínas es un esencial de cualquier trabajo de laboratorio que ensayo originalmente descrito por Bradford, involucre extracción, purificación o análisis de este método se basa en la unión de un tinte a la proteínas. La cuantificación de proteínas es a proteína. Este método cuenta con un alto veces necesaria para el aislamiento, separación coeficiente de extinción molar, lo que se traduce y análisis por cromatografía o técnicas en que la sustancia absorbe la luz de una forma inmunoquímicas y electroforéticas. muy eficiente a la longitud de onda adecuada Dependiendo de la precisión requerida y del (Walker, J., 2002). porcentaje de pureza de la proteína de interés, Debido a que las proteínas difieren en su diferentes métodos serán apropiados para composición de aminoácidos cada una determinar la concentración de la proteína responde de manera diferente a cada tipo de (Hayworth, D., 2010). método de cuantificación. Para lograr una alta En general para la cuantificación de proteínas eficiencia en la estimación de la concentración se pueden emplear numerosos métodos. Es total de alguna proteína en muestras necesario decir que la selección del método desconocidas es esencial incluir una curva de debe ser cuidadosa ya que en muchas calibración la cual indicará en cierto margen de ocasiones la presencia de sustancias que correlación una concentración a partir de esta interfieren genera un ruido al momento de la curva fabricada a partir de estándares de cuantificación. Entre los distintos métodos se concentraciones conocidas (Hayworth, D., pueden nombrar los siguientes: métodos 2010). espectrométricos, métodos químicos como la Objetivo. técnica de Kjeldahl mediante el cual se Realizar y comprender el fundamento de una determina el contenido de nitrógeno o el método técnica de cuantificación de proteínas de Biuret que se basa en la reacción de las (Bradford) y calcular la concentración de una muestra problema. proteínas con sulfato de cobre que absorbe la Metodología. luz a una determinada longitud de onda, ente Se inició el procedimiento con la realización de otros métodos (Santiago, S., 2005). una curva de calibración a concentraciones de 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 mg/mL en 1 mL, esta curva fue a partir de una solución con una concentración que en lugar de los 100 µL de solución, se de 4 mg/mL. Una vez hechas las soluciones de añadió esta cantidad de agua destilada, esto la curva de calibración se tomó de cada una 100 para usar como blanco. Después se leyó en el µL y se le adicionó 1 mL de reactivo de Bradford espectrofotómetro a una absorbancia de 595 y se incubo por 5 minutos a temperatura nm. ambiente, este último proceso se repitió solo Resultados. A continuación se muestra la tabla No. 1 en la cual se observan los resultados obtenidos, los cuales incluyen la absorbancia dada en cada concentración de la muestra, así como su promedio. En la gráfica No. 1 se muestra la curva de calibración con los promedios de absorbancia obtenidos por cada equipo, además muestra el coeficiente de correlación y la ecuación de la recta con la cual se obtuvo la concentración de la muestra problema. Concentración (mg/mL) Equipo No. Equipo No. 2 Equipo No. 3 Equipo No. 4 Promedio 1 Absorbancia a 595 nm. 0.1 0.41 - - 0.19 0.3 0.2 1.019 0.971 0.386 0.53 0.7265 0.3 1.026 0.756 0.756 0.847 0.84625 0.4 1.444 0.987 0.833 1.002 1.0665 Tabla No. 1.- Resultados en absorbancia de la curva de calibración.
Gráfica No. 1.- Curva de calibración, ecuación de la recta, y coeficiente de correlación.
La ecuación obtenida de la gráfica No. 1 se y verde las cuales absorben a una longitud de despejó para obtener: onda de 470 y 650 nm respectivamente. En 𝑦 − 0.13 contraste la forma anicónica es el azul, el cual 𝑥= 2.4193 se une a la proteína, este azul absorbe a 595 En esta ecuación se sustituye Y por la nm, con lo cual se entiende que se cuantifica el absorbancia de la muestra problema que en azul de este colorante. El colorante aparece este caso fue: cuando se una a residuos de arginina y lisina en - Muestra problema No. 1 = 0.769. la proteína, esta unión es un enlace iónico o - Muestra problema No. 2 = 0.212. salino, dado que la arginina y lisina son Y se obtuvo una concentración de: aminoácidos cargados de forma positiva - Concentración real de problema No. 1 = (cationes) y el colorante está cargado de forma 0.264125 mg/mL. negativa (anión). - Concentración real de problema No. 2 = Además Stephenson menciona que la 0.03389 mg/mL. intensidad de absorción depende del contenido Discusión. de aminoácidos básicos y aromáticos. Las Los resultados de la curva de calibración interferencias o no existen o son mínimas por muestran mucha variación, es por eso que se cationes tanto sodio como potasio y decidió sacar un promedio y graficar a partir de carbohidratos como la sacarosa. Otras este. Los dos datos faltantes en la sustancias que interfieren en el ensayo son los concentración de 0.1 de los equipos 2 y 3 agentes fuertemente alcalinos (fácilmente reflejan la variación de los datos, estos solucionable con la utilización de buffers). Los resultados pueden deberse a ciertos factores únicos componentes encontrados que dan una sin embargo los demás datos demuestran que excesiva interferencia en el color del ensayo, la mencionada variación no fue causada solo son altas concentraciones de detergentes como por algún factor si no que fueron varios factores el SDS, Triton X-100, etc. los que congeniaron para que estos resultados Conclusión. se dieran de esta manera. Se cumplió con los objetivos propuestos para la Según Kruger, N. (2002) la reacción para el práctica dado que se logró realizar la técnica de ensayo de Bradford se da entre el colorante cuantificación de Bradford y además mediante Coomasie Blue g250 y la proteína. Menciona la realización de este reporte se logró también que diversos estudios dicen que el comprender el fundamento de esta técnica. colorante libre puede existir en 4 diferentes Además mediante los datos obtenidos en la formas iónicas cuyos pKa son 1.15, 1.82 y 12.4. práctica se logró calcular la concentración de De las tres formas cargadas del colorante se una muestra problema a partir de una curva de encuentran las catiónicas que son de color rojo calibración. Debido a los resultados tan variables obtenidos se puede decir que la overview. United Kingdon: University of manera en que se aplicó el método no es Oxford.
buena, pero dada la investigación bibliográfica • Stephenson, F. (2008). Measuring
protein concentration by colorimetric que indica que el método tiene un alto assay. Calculation for molecular biology coeficiente de extinción lo cual es and biotechnology. imprescindible para aumentar la sensibilidad en la medición de proteínas y que la unión colorante-proteína es un proceso muy rápido, dos minutos, y el complejo permanece estable durante un tiempo relativamente largo, una hora, haciendo de este un proceso muy rápido, y que no requiere un tiempo crítico para el ensayo, además de que es un método muy reproducible se puede llegar a la conclusión de que el método de Bradford es un método muy recomendable para la cuantificación de proteínas, siempre y cuando se lleve de una manera correcta. Bibliografía. • Hayworth, D. (2010). Assays methods. Overview of protein assays methods. U.S.: Thermo Scientific Pierce. • Santiago, S. (2005). Separación y determinación de proteínas. Contribución a la determinación de la fracción de metales traza ligados a las proteínas similares a las metaloproteínas en muestras de mejillón. España: Universidad de Santiago de Compostela. • Walker, J. (2002). The protein quantitation. The protein protocols handbook. New Yersey: University of Hertfordshire. • Kruger, N. (2002). Sample preparation for protein assays. Protein methods