Gen Terinterupsi dalam Eukariota: Ekson dan Intron

Sebagian besar gen prokariota yang ditandai dengan baik terdiri dari urutan kontinu pasangan
nukleotida, yang menentukan urutan kolinear asam amino dalam produk gen polipeptida. Namun, pada
tahun 1977, analisis molekuler dari tiga gen eukariotik menghasilkan kejutan besar. Studi gen tikus dan
kelinci - globin (satu dari dua protein berbeda dalam hemoglobin) dan gen ayam ovalbumin (suatu
protein penyimpanan telur) mengungkapkan bahwa mereka mengandung sekuens nonkode yang
mengintervensi antara sekuens pengkodean. Mereka kemudian ditemukan di daerah yang tidak
diterjemahkan dari beberapa gen. Mereka disebut intron (untuk urutan intervensi.) Urutan yang tetap
ada dalam molekul mRNA matang (baik urutan pengkodean dan nonkode) disebut ekson (untuk urutan
yang diekspresikan). Beberapa bukti paling awal untuk intron pada gen mamalia-globin dihasilkan dari
visualisasi hibrida DNA-mRNA genom dengan mikroskop elektron. Karena dupleks DNA-RNA lebih stabil
daripada heliks ganda DNA, ketika heliks ganda DNA terdenaturasi diinkubasi dengan molekul RNA
homolog di bawah kondisi yang sesuai, untaian RNA akan berhibridisasi dengan untai DNA
komplementer, menggantikan untaian DNA ekivalen (Gambar 11.19a ). Struktur hibrid DNA-RNA yang
dihasilkan akan berisi daerah beruntai tunggal dari DNA yang disebut R-loop, tempat molekul RNA
memindahkan untaian DNA untuk membentuk daerah duplex DNA-RNA. R-loop ini dapat
divisualisasikan secara langsung dengan mikroskop elektron. Ketika Shirley Tilghman, Philip Leder, dan
rekannya mem-hibridisasi mRNA tikus-globin yang dimurnikan menjadi molekul DNA yang mengandung
gen globin tikus, mereka mengamati dua loop-R yang dipisahkan oleh satu lingkaran DNA untai ganda
(Gambar 11.19b). Hasil mereka menunjukkan adanya urutan pasangan nukleotida di tengah gen -globin
yang tidak ada dalam mRNA globin dan, oleh karena itu, tidak mengkodekan asam amino dalam
polipeptida -globin. Ketika Tilghman dan rekan kerja mengulangi eksperimen loop-R menggunakan
transkrip gen globin murni yang diisolasi dari nuklei dan diyakini sebagai transkrip gen primer atau
molekul pra-mRNA, sebagai pengganti mRNA sitoplasma-globin, mereka hanya mengamati satu loop-R
(Gambar 11.19 c). Hasil ini menunjukkan bahwa transkrip primer berisi urutan gen struktural lengkap,
termasuk ekson dan intron. Bersama-sama, hasil R-loop yang diperoleh dengan mRNA sitoplasma dan
pra-mRNA nuklir menunjukkan bahwa sekuens intron dieksisi dan sekuens ekson disambungkan
bersama selama peristiwa pemrosesan yang mengubah transkrip primer ke mRNA matang. Tilghman
dan rekannya mengkonfirmasi interpretasi mereka tentang hasil R-loop dengan membandingkan urutan
gen globin tikus dengan urutan asam amino yang diprediksi dari polipeptida -globin. Hasilnya
menunjukkan bahwa gen tersebut mengandung intron nonkoding pada posisi ini dalam gen. Penelitian
selanjutnya menunjukkan bahwa gen mouse-globin sebenarnya mengandung dua intron. Untuk
perincian studi ini dan informasi tambahan tentang penemuan intron, lihat Tonggak Sejarah Genetika:
Intron di situs Sahabat Siswa.

BEBERAPA GEN EUKARIOTIK SANGAT BESAR Setelah studi perintis pada gen globin mamalia dan gen
ovalbumin ayam (lihat Milestone di situs Sahabat Siswa), intron nonkode telah ditunjukkan dalam
sejumlah besar gen eukariotik. Faktanya, gen terputus jauh lebih umum daripada gen tidak terputus
pada hewan dan tumbuhan tingkat tinggi. Sebagai contoh, gen Xenopus laevis yang mengkode
vitellogenin A2 (yang berakhir sebagai protein kuning telur) mengandung 33 intron, dan gen kolagen
ayam 1? 2 mengandung setidaknya 50 intron. Gen kolagen membentang 37.000 pasangan nukleotida
tetapi memunculkan molekul mRNA hanya sekitar 4600 nukleotida. Gen lain mengandung relatif sedikit
intron, tetapi beberapa intron sangat besar. Sebagai contoh, gen Ultrabithorax (Ubx) dari Drosophila
mengandung intron yang panjangnya sekitar 70.000 pasangan nukleotida. Gen terbesar yang
dikarakterisasi hingga saat ini adalah gen DMD manusia, yang menyebabkan distrofi otot Duchenne
ketika dibuat tidak berfungsi oleh mutasi. Gen DMD mencakup 2,5 juta pasangan nukleotida dan
mengandung 78 intron. Meskipun intron ada di sebagian besar gen hewan dan tumbuhan tingkat tinggi,
mereka tidak penting karena tidak semua gen tersebut mengandung intron. Gen histone bulu babi laut
dan empat gen kejut panas Drosophila adalah di antara gen hewan pertama yang terbukti kekurangan
intron. Kita sekarang tahu bahwa banyak gen binatang dan tumbuhan tingkat tinggi kekurangan intron.

INTRON: SIGNIFIKANSI BIOLOGIS? Saat ini, para ilmuwan relatif tahu sedikit tentang signifikansi biologis
dari struktur ekson-intron gen eukariotik. Intron sangat bervariasi ukurannya, mulai dari sekitar 50
pasangan nukleotida hingga ribuan pasangan nukleotida. Fakta ini telah menimbulkan spekulasi bahwa
intron mungkin berperan dalam mengatur ekspresi gen. Meskipun tidak jelas bagaimana intron
mengatur ekspresi gen, penelitian baru menunjukkan bahwa beberapa intron mengandung urutan yang
dapat mengatur ekspresi gen baik secara positif maupun negatif. Intron lain mengandung promotor
spesifik jaringan alternatif; yang lain berisi urutan yang meningkatkan akumulasi transkrip. Fakta bahwa
intron mengakumulasi mutasi baru jauh lebih cepat daripada ekson menunjukkan bahwa banyak dari
sekuens inti pasangan nukleotida tertentu, tidak termasuk ujungnya, tidak terlalu penting. Dalam
beberapa kasus, ekson gen yang berbeda mengkodekan domain fungsional yang berbeda dari produk
gen protein. Ini paling jelas dalam kasus gen yang mengkode rantai antibodi berat dan ringan (lihat
Gambar 20.17). Dalam kasus gen globin mamalia, ekson tengah mengkodekan domain pengikat protein.
Ada spekulasi yang cukup besar bahwa struktur gen eukariotik ekson-intron dihasilkan dari evolusi gen
baru dengan penggabungan gen leluhur yang tidak terputus (ekson tunggal). Jika hipotesis ini benar,
intron mungkin hanya merupakan peninggalan dari proses evolusi. Atau, intron dapat memberikan
keuntungan selektif dengan meningkatkan tingkat di mana urutan pengkodean dalam ekson gen yang
berbeda dapat menata ulang dengan rekombinasi, sehingga mempercepat proses evolusi. Dalam
beberapa kasus, cara alternatif penyambungan transkrip menghasilkan keluarga protein terkait. Dalam
kasus ini, intron menghasilkan banyak produk dari satu gen. Penyambungan alternatif dari transkrip
tikus troponin T diilustrasikan pada Gambar 19.2. Dalam kasus gen mitokondria dari sitokrom b
pengkode ragi, intron mengandung ekson gen penyandi enzim yang terlibat dalam pemrosesan transkrip
primer gen. Dengan demikian, intron yang berbeda mungkin memang memainkan peran yang berbeda,
dan banyak intron mungkin tidak memiliki signifikansi biologis. Karena banyak gen eukariotik tidak
mengandung intron, daerah nonkode ini tidak diperlukan untuk ekspresi gen normal. Penghapusan
Urutan Intron oleh RNA Splicing

Sebagian besar gen nuklir yang menyandikan protein dalam eukariota multiseluler mengandung intron.
Lebih sedikit, tetapi masih banyak, dari gen eukariota uniseluler seperti ragi mengandung intron. Gen
archaea yang langka dan beberapa virus prokariota juga mengandung intron. Dalam kasus gen "split" ini,
transkrip primer berisi seluruh urutan gen, dan urutan intron dikeluarkan selama pemrosesan RNA (lihat
Gambar 11.12). Untuk gen yang menyandikan protein, mekanisme penyambungan harus tepat; ia harus
bergabung dengan rangkaian ekson dengan akurasi pada nukleotida tunggal untuk memastikan bahwa
kodon di ekson yang jauh dari intron dibaca dengan benar (Gambar 11.20). Akurasi pada tingkat ini
tampaknya membutuhkan sinyal splicing yang tepat, barangkali sekuens nukleotida di dalam intron dan
di persimpangan ekson-intron. Namun, dalam transkrip utama gen nuklir, satu-satunya sekuens yang
benar-benar dilestarikan dari intron yang berbeda adalah sekuens dinukleotida pada ujung intron, yaitu,

Urutan yang ditunjukkan di sini adalah untuk untai nontemplate DNA (setara dengan transkrip RNA,
tetapi dengan T daripada U). Selain itu, ada urutan konsensus pendek di persimpangan ekson-intron.
Untuk gen nuklir, persimpangan konsensus adalah

Subskrip numerik menunjukkan frekuensi frekuensi basis konsensus di setiap posisi; dengan demikian,
100 subskrip menunjukkan bahwa basis selalu ada di posisi itu. N dan Py menunjukkan bahwa masing-
masing dari empat nukleotida standar atau pirimidin, masing-masing, dapat hadir pada posisi yang
ditunjukkan. Persimpangan ekson-intron berbeda untuk gen tRNA dan gen struktural dalam mitokondria
dan kloroplas, yang menggunakan mekanisme penyambungan RNA yang berbeda. Namun, spesies yang
berbeda menunjukkan beberapa konservasi urutan di persimpangan ekson-intron. Penelitian terbaru
menunjukkan bahwa urutan splicing dan intron dapat memengaruhi ekspresi gen. Bukti langsung untuk
kepentingannya telah disediakan oleh mutasi pada situs-situs ini yang menyebabkan fenotipe mutan
pada banyak eukariota yang berbeda. Memang, mutasi semacam itu terkadang bertanggung jawab atas
penyakit bawaan pada manusia, seperti kelainan hemoglobin. Penemuan intron nonkode pada gen
menstimulasi minat yang kuat pada mekanisme di mana sekuens intron dihilangkan selama ekspresi
gen. Demonstrasi awal bahwa sekuens intron pada gen eukariotik ditranskripsikan bersama dengan
sekuens exon yang memfokuskan penelitian pada pemrosesan transkrip gen primer. Seperti halnya
sistem in vitro memberikan informasi penting tentang mekanisme transkripsi dan terjemahan, kunci
untuk memahami peristiwa penyambungan RNA adalah pengembangan sistem penyambungan in vitro.
Dengan menggunakan sistem ini, para peneliti telah menunjukkan bahwa ada tiga jenis eksisi intron
yang berbeda dari transkrip RNA.

1. Intron prekursor tRNA dieksisi dengan pembelahan endonukleolitik dan reaksi ligasi yang dikatalisasi
oleh aktivitas endonuklease dan ligase penyambungan khusus.

2. Inti dari beberapa prekursor rRNA dihilangkan secara autokatalitik dalam reaksi unik yang dimediasi
oleh molekul RNA itu sendiri. (Tidak ada aktivitas enzimatik protein yang terlibat.)

3. Intron transkrip pra-mRNA nuklir (hnRNA) disambungkan dalam reaksi dua langkah yang dilakukan
oleh partikel ribonucleoprotein kompleks yang disebut spliceosom. Tiga mekanisme eksisi intron dibahas
dalam tiga bagian berikut. Ada mekanisme eksisi intron lain, tetapi demi singkatnya mereka tidak
dibahas di sini.

SPRIK PRECURSOR tRNA: KEGIATAN NUCLEASE DAN LIGASE YANG UNIK Reaksi splicing prekursor tRNA
telah dikerjakan secara rinci dalam ragi Saccharomyces cerevisiae. Baik sistem splicing in vitro dan
mutan splicing suhu-sensitif telah digunakan dalam membedah mekanisme splicing tRNA di S.
cerevisiae. Eksisi intron dari prekursor tRNA ragi terjadi dalam dua tahap. Pada tahap I, endonuklease
penyambungan membran-terikat nuklir membuat dua pemotongan tepat di ujung intron. Kemudian,
pada tahap II, ligase penyambungan bergabung dengan dua bagian tRNA untuk menghasilkan bentuk
molekul tRNA yang matang. Spesifisitas untuk reaksi-reaksi ini berada pada fitur tiga dimensi kekal dari
prekursor tRNA, bukan dalam urutan nukleotida per se.

PEMERIKSAAN AUTOCATALYTIC Tema umum dalam biologi adalah bahwa metabolisme terjadi melalui
sekuens reaksi enzimatisatalisasi. Enzim yang sangat penting ini umumnya adalah protein, kadang-
kadang polipeptida tunggal dan kadang-kadang heteromultimer kompleks. Kadang-kadang, enzim
membutuhkan kofaktor nonprotein untuk menjalankan fungsinya. Ketika ikatan kovalen diubah,
biasanya diasumsikan bahwa reaksi dikatalisis oleh enzim. Dengan demikian, penemuan 1982 oleh
Thomas Cech dan rekan kerjanya bahwa intron dalam prekursor rRNA Tetrahymena thermophila
dikeluarkan tanpa keterlibatan aktivitas katalitik protein apa pun cukup mengejutkan. Namun, sekarang
jelas ditetapkan bahwa aktivitas penyambungan yang mengeksisi intron dari prekursor rRNA ini adalah
intrinsik bagi molekul RNA itu sendiri. Memang, Cech dan Sidney Altman berbagi Hadiah Nobel 1989
dalam Kimia untuk penemuan RNA katalitik mereka. Selain itu, kegiatan splicing atau autocatalytic
seperti itu telah terbukti terjadi pada prekursor rRNA dari beberapa eukariota yang lebih rendah dan
dalam sejumlah besar prekursor rRNA, tRNA, dan mRNA dalam mitokondria dan kloroplas dari banyak
spesies berbeda. Dalam kasus banyak intron ini, mekanisme penyambungan sendiri adalah sama atau
sangat mirip dengan yang digunakan oleh prekursor Tetrahymena rRNA (lihat? Gambar 11.21). Bagi yang
lain, mekanisme self-splicing mirip dengan mekanisme splicing yang diamati dengan prekursor mRNA
nuklir, tetapi tanpa keterlibatan spliceosome (lihat bagian selanjutnya). Eksisi autokatalitik intron dalam
prekursor Tetrahymena rRNA dan intron lainnya tidak memerlukan sumber energi eksternal dan tidak
ada aktivitas katalitik protein. Alih-alih, mekanisme splicing melibatkan serangkaian transfer ikatan
fosfoester, tanpa ikatan hilang atau diperoleh dalam proses. Reaksi ini membutuhkan nukleosida guanin
atau nukleotida dengan gugus 3? -OH bebas (GTP, GDP, GMP, atau guanosin semuanya berfungsi)
sebagai kofaktor plus kation monovalen dan kation divalen. Persyaratan untuk G-3? -OH adalah mutlak;
tidak ada basa lain yang dapat disubstitusi dalam kofaktor nukleosida atau nukleotida. Intron dieksisi
dengan menggunakan dua transfer ikatan fosfoester, dan intron yang dieksisi kemudian dapat diedarkan
dengan cara transfer ikatan fosfoester lain. Reaksi-reaksi ini digambarkan dalam Gambar 11.21.
Sirkularisasi autokatalitik intron yang dieksisi menunjukkan bahwa self-plicing dari prekursor rRNA ini
terutama berada, jika tidak sepenuhnya, dalam struktur intron itu sendiri. Agaknya, aktivitas
autokatalitik tergantung pada struktur sekunder intron atau setidaknya struktur sekunder molekul
prekursor RNA. Struktur sekunder dari RNA penyambungan sendiri ini harus membawa gugus reaktif ke
dalam penjajaran dekat untuk memungkinkan terjadinya ikatan ikatan fosfoester. Karena transfer ikatan
fosfoester penyambungan sendiri berpotensi reaksi reversibel, degradasi intron yang dieksisi dengan
cepat atau ekspor rRNA yang disambung ke sitoplasma dapat mendorong splicing ke arah depan.
Perhatikan bahwa reaksi splicing autokatalitik bersifat intramolekul dan karenanya tidak tergantung
pada konsentrasi. Selain itu, prekursor RNA mampu membentuk pusat aktif di mana kofaktor guanosin-
3? -OH mengikat. Penyambungan autokatalitik prekursor rRNA ini menunjukkan bahwa situs katalitik
tidak terbatas pada protein; Namun, tidak ada aktivitas trans katalitik seperti untuk enzim, hanya
aktivitas katalitik cis. Beberapa ilmuwan percaya bahwa penyambungan RNA autokatalitik mungkin
merupakan peninggalan dari dunia berbasis RNA awal.