Tinjauan Pustaka Biohidrogen Fermentasi PDF
Tinjauan Pustaka Biohidrogen Fermentasi PDF
dalam kondisi nitrogen terbatas. R. marinum spesifik dalam mediasi transfer elektron dari
memperoleh elektron dari senyawa organik donor elektron luar (feredoksin atau
untuk mereduksi proton menjadi molekul flavodoksin) ke dinitrogenase (Tamagnini et
hidrogen. Jika molekul nitrogen tidak ada, al. 2002). Homodimer protein Fe yang
enzim nitrogenase akan mereduksi proton dienkodekan oleh nifH mengandung dua situs
menjadi gas hidrogen yang dibantu dengan penempelan nukleotida (satu per subunit) dan
energi dalam bentuk ATP dan elektron yang satu kelas [4Fe-4S] pada antarmuka dimer.
diperoleh dari feredoksin. Dalam proses Bersamaan dengan hidrolisis ATP oleh
fotosistem bakteri ini, tidak terbentuk oksigen protein Fe, elektron ditransfer berturut-turut
sehingga tidak menghambat kerja enzim dari kelas [4Fe-4S] di dalam protein Fe
nitrogenase mengingat enzim nitrogenase melalui kelas P di dalam protein MoFe ke
sensitif terhadap oksigen (Akkerman 2002). FeMoco, yang mana terjadi reduksi substrat.
Protein Fe juga penting untuk perakitan dari
Enzim Penghasil Hidrogen komplek kelas di dalam protein MoFe. Delesi
Proses produksi hidrogen secara biologi gen nifH yang mengenkodekan protein Fe
bergantung pada keberadaan enzim penghasil menghasilkan pembentukan protein MoFe
hidrogen. Bakteri fotosintetik ungu nonsulfur, dengan kelas P terganggu atau prekursor
memiliki enzim yang dapat memproduksi fragmen yang terdiri atas [4Fe-4S] seperti
hidrogen yaitu nitrogenase dan hidrogenase. kelas P akan terganggu, mengindikasikan
Enzim hidrogenase memiliki kemampuan bahwa protein Fe mungkin memfasilitasi
memproduksi sekaligus dapat mengkonsumsi penggabungan fragmen-fragmen ini menjadi
hidrogen yang telah dihasilkan. Secara umum bentuk rakitan penuh [8Fe-7S] kelas P (Hu et
sifat hidrogenase dapat dikatakan sebagai al. 2006). Kofaktor logam baik Fe maupun
metabolik antagonis dari nitrogenase Mo meletakkan nitrogen di dalam posisi yang
(Tamagnini et al. 2002). mudah untuk dikonversi menjadi amonia.
Nitrogenase merupakan kompleks Kedua protein tersebut bersama-sama
enzimatik yang dapat memfiksasi nitrogen di memfiksasi nitrogen di udara. Nitrogenase
udara. Kompleks nitrogenase berada bebas di sangat sensitif terhadap oksigen. Oksigen
dalam organisme yang memfiksasi nitrogen dapat menginaktivasi aktivitas nitrogenase
dan juga berada di dalam bakteri yang (Tamagnini et al. 2002).
memfiksasi nitrogen. Berikut persamaan Hidrogenase merupakan enzim yang
reaksi pembentukan amonia dari fiksasi mengkatalisis oksidasi reversibel dari H2
nitrogen : menjadi proton. Beberapa mikroorganisme
N2 + 8H+ + 8e- + 16 ATP 2NH3 + H2 + menggunakan enzim ini dengan tujuan yang
16 ADP + 16 Pi. berbeda-beda. Banyak bakteri dan arkaea
Reduksi nitrogen menjadi amonia merupakan dapat menggunakan hidrogen sebagai sumber
reaksi endergonik yang memerlukan energi elektronnya dengan bantuan hidrogenase.
metabolisme tinggi dalam bentuk ATP. Beberapa bakteri fermentatif dan alga hijau
Amonia dibentuk pada proses ini ditambatkan menggunakan hidrogenase untuk melepas
ke dalam asam amino glutamat dan glutamin kelebihan power reduksi dengan mereduksi
serta asam nukleat (Tamagnini et al. 2002). proton menjadi hidrogen, dan bakteri
Kompleks nitrogenase mengandung 2 tipe pemfiksasi nitrogen menggunakan
protein, yaitu dinitrogenase (protein MoFe hidrogenase untuk menangkap kembali
atau protein 1 atau protein pertama), dan hidrogen yang telah diproduksi oleh
dinitrogenase reduktase (protein Fe atau nitrogenase (Lindberg 2003).
protein kedua). Protein MoFe memiliki berat Hidrogenase dibagi menjadi tiga kelas
molekul (BM) 220-240 kDa. Protein ini berdasarkan filogenetik, yaitu [Fe]-
merupakan heterotetramer α2β2 yang hidrogenase, [NiFe]-hidrogenase, dan logam
mengandung 28 ion Molibdenum sebagai bebas-hidrogenase (Linberg 2003).
kofaktor, (Tamagnini et al. 2002). Protein Berdasarkan komponen logam dari sisi aktif
MoFe mengandung dua set kelompok logam yang menempel atau membebaskan H2,
unik : kelas P ([8Fe-7S]) yang menjembatani hidrogenase terbagi atas 3 kelas yaitu [NiFe]-,
antara masing-masing pasangan subunit αβ, [FeFe]-, dan [Fe] hidrogenase (Stripp et al.
dan kofaktor FeMo (FeMoco) yang berlokasi 2009).
di dalam subunit α (Hu et al. 2006). Hidrogenase berpotensi sebagai katalis
Protein Fe memiliki BM 60-70 kDa, dalam menghasilkan bahan bakar sel,
dibentuk dari 2 subunit yang mengandung 8 menyediakan potensial elektron rendah untuk
atom Fe sebagai kofaktor, dan berperan digunakan dalam reaksi reduksi, dan
5
suatu grafik atau kurva pertumbuhan. fase, yaitu fase diam dengan luas area yang
Pertumbuhan populasi mikrob dibedakan besar, dan fase gerak berupa gas yang
menjadi dua, yaitu biakan sistem tertutup mengalir melewati fase diam. Pada proses
(batch culture) dan biakan sistem terbuka elusi, sampel diuapkan dan dibawa oleh gas
(continous culture). pembawa (fase gerak gas) melewati kolom.
Biakan sistem tertutup memerlukan Sampel dibagi ke dalam fase diam cair
pengamatan jumlah sel dalam waktu yang berdasarkan kelarutannya pada temperatur
cukup lama untuk memberikan gambaran yang diberikan. Komponen-komponen sampel
berdasarkan kurva pertumbuhan bahwa memisah dari yang lain berdasarkan tekanan
terdapat fase-fase pertumbuhan. Fase uap relatif dan afinitas terhadap fase diam
pertumbuhan dimulai pada fase permulaan, (Mcnair & Miller 1998).
fase pertumbuhan yang dipercepat, fase Berdasarkan fase diam yang digunakan,
pertumbuhan logaritma (eksponensial), fase kromatografi gas dibagi menjadi 2 jenis, yaitu
pertumbuhan yang mulai dihambat, fase kromatografi gas-padat dan kromatografi gas-
stasioner maksimum, fase kematian yang cair. Metode separasi dengan kromatografi
dipercepat, dan fase kematian logaritma. gas memiliki beberapa keuntungan, di
Fase permulaan ditandai dengan bakteri antaranya adalah 1) Analisis cepat, dalam
baru menyesuaikan diri dengan lingkungan beberapa menit. 2) Efisen karena
yang baru, sehingga sel belum membelah diri. menghasilkan resolusi yang tinggi, 3) Sensitif
Sel mikrob mulai membelah diri pada fase karena deteksi dalam ppm atau sering juga
pertumbuhan yang dipercepat, tetapi waktu ppb, 4) Tidak dekstruktif, sehingga bisa
generasinya masih panjang. Fase permulaan digabung dengan spektroskopi massa
sampai fase pertumbuhan dipercepat disebut (GCMS), 5) Keakuratan tinggi dalam analisis
lag phase. Sel membelah diri paling cepat kuantitatif, 6) Sampel yang digunakan sangat
terdapat pada fase pertumbuhan logaritma sedikit (dalam mikro), 7) Dan murah. Namun,
atau pertumbuhan eksponensial, dengan kromatografi gas ini juga memiliki
waktu generasi yang pendek dan konstan. keterbatasan, yaitu terbatas untuk sampel
Selama fase logaritma, metabolisme sel paling volatil, tidak cocok untuk sampel yang tidak
aktif, sintesis bahan sel sangat cepat dengan tahan panas, sulit bagi sampel preparatif atau
jumlah konstan sampai nutrien habis atau sampel yang banyak, dan memerlukan
terjadinya penimbunan hasil metabolisme spektroskopi untuk mengidentifikasi puncak
yang menyebabkan terhambatnya hasil kromatografi gas. (Mcnair & Miller
pertumbuhan. 1998)
Fase pertumbuhan yang mulai terhambat Bagian-bagian dasar gas kromatografi
ditandai dengan berkurangnya kecepatan secara sederhana di antaranya adalah gas
pembelahan sel dan jumlah sel yang mati pembawa, kontrol laju alir, injektor, kolom,
mulai bertambah. Pada fase stasioner, detektor, dan sistem data. Bagian utama dari
maksimum jumlah sel yang mati semakin kromatografi adalah kolom. Kolom
meningkat sampai terjadi jumlah sel hidup merupakan tabung yang berisi sokongan inert
hasil pembelahan sama dengan jumlah sel untuk fase diam cair yang dilapiskan. Kolom
yang mati, sehingga jumlah sel hidup yang sering digunakan saat ini adalah yang
konstan, seolah-olah tidak terjadi dibuat dari leburan silika dan tabung terbuka
pertumbuhan. Pada fase kematian yang dengan dimensi kapiler. Gas pembawa
dipercepat, kecepatan kematian sel terus berfungsi untuk membawa sampel melewati
meningkat, sedangkan kecepatan pembelahan kolom. Gas pembawa merupakan fase gerak
sel nol, sampai pada fase kematian logaritma yang inert dan terdiri dari berbagai jenis yang
maka kecepatan kematian sel mencapai memiliki kecocokan berbeda-beda untuk
maksimal, sehingga jumlah sel hidup berbagai detektor. Kolom kromatografi
menurun dengan cepat seperti deret ukur. dipaket secata kuat dengan fase diam pada
Namun, penurunan jumlah sel hidup tidak pendukung padat inert (Mcnair & Miller
mencapai nol, dalam jumlah minimum 1998).
tertentu sel mikrob akan tetap bertahan sangat Temperatur lubang injeksi hendaknya
lama dalam medium (Sumarsih 2007). cukup untuk menguapkan sampel dengan
cepat sehingga tidak mengurangi efisiensi
Kromatografi Gas hasil. Pada injeksi penguapan cepat,
Kromatografi gas merupakan metode temperatur lubang injeksi sekitar 50˚C lebih
separasi sampel yang dapat memisahkan panas dari titik leleh sampel. Temperatur
komponen-komponen sampel di antara dua kolom sebaiknya cukup panas, biasanya tidak
7
lebih tinggi dari titik leleh sampel. pipet pasteur, syringe (5 ml dan 50 ml), rak
Temperatur untuk detektor diatur berdasarkan tabung, selang, shaker, inkubator bergoyang,
detektor yang dipakai (Mcnair & Miller neraca analitik, neraca timbang, vortex,
1998). mikrosentrifus dan sentrifus RC26 rotor
Detektor sangat sensitif terhadap keluaran GSA. Alat yang digunakan untuk
dari kolom dan mencatat keluaran dalam pencahayaan, yaitu lampu berwarna merah,
bentuk kromatogram. Sinyal detektor sesuai kuning, biru, dan lampu ultraviolet (UV).
terhadap jumlah analit sehingga data dapat Selain itu, alat analisis yang digunakan adalah
digunakan untuk analisis kuantitatif. Detektor alat pengukur panjang gelombang lampu
yang paling umum adalah flame ionization USB2000 Vis-NIR Spectrophotometer, pH
detector (FID). FID merupakan detektor yang indikator universal, spektrofotometer UV-VIS
memiliki sensitivitas tinggi, linearitas, dan pharmaspec 1700, sensor hidrogen H2 scan
murah. Beberapa detektor lain adalah thermal model 2240 dan kromatografi gas (GC) HP
conductivity detector (TCD), electron capture 5890.
detector (ECD) (Mcnair & Miller 1998). Bahan mikrob yang digunakan adalah
Sistem data umumnya terdiri atas 2 jenis, biakan bakteri fotosintetik Rhodobium
yaitu integrator dan komputer. Pada integrator marinum NBRC No. 100434. Bahan yang
berbasis mikroprosesor, mikroprosesor digunakan dalam pembuatan media bakteri
didedikasikan dengan konventer analog ke adalah akuades, dinatrium suksinat, D-
digital untuk menghasilkan kromatrogram dan glukosa (Merck), ekstrak khamir, K2HPO4,
data analisis kuantitatif. Algoritma dipakai KH2PO4, EDTA.2Na, H3BO3, Na2MoO4.
untuk mendukung fungsi tersebut. Komputer 2H2O, ZnSO4.7H2O, MnCl2, Cu(Mo3)2. 3H2O,
memiliki fleksibilitas paling besar dalam FeSO4. 7H2O, CaCl2. 2H2O, Mg SO4. 7 H2O ,
mendapatkan data, mengontrol alat, larutan NaOH 1 N, larutan HCl 2 N, gas N2,
mereduksi data, menampilkan dan natrium hidrogen karbonat, dan vitamin B12.
mentransfer ke alat lain. Komputer lebih Bahan kimia yang digunakan untuk analisis
sering digunakan karena memorinya besar, kadar glukosa adalah glukosa kit merk
pemrosesan cepat, dan fleksibel untuk WAKO. Bahan yang digunakan untuk analisis
antarmuka pengguna (Mcnair & Miller 1998). H2 dengan GC , yaitu gas N2.
Cara kerja kromatografi secara
keseluruhan dan sederhana yaitu, gas Metode
pembawa yang inert mengalir secara kontinyu Pembuatan Media Pembibitan R. marinum
dari tabung silinder gas masuk ke lubang (Media Modifikasi Fotosintetik)
injeksi, kemudian ke kolom, dan detektor. Media R. marinum dibuat dengan
Laju alir gas pembawa ini dikontrol untuk komposisi sebagai berikut : 10 gram
menghasilkan waktu retensi yang tepat dan dinatrium suksinat, 0.3 gram ekstrak khamir
meminimalkan gangguan. Selanjutnya, ditimbang menggunakan neraca analitik
sampel diinjeksi ke dalam lubang injeksi yang kemudian dimasukkan ke dalam botol Schott,
panas, diuapkan dan dibawa ke dalam kolom. 10 ml Bassal medium 100x (K2HPO4 = 750
Sampel terpartisi antara fase diam dan fase mg, KH2PO4 = 850 mg, EDTA.2Na = 2 mg,
gerak, kemudian pemisahan komponen H3BO3 = 2,8 mg, Na2MoO4. 2H2O = 0,75 mg,
masing-masing berdasarkan kelarutan relatif ZnSO4. 7 H2O = 0,24 mg, MnCl2 = 2,1 mg,
dalam fase diam cair dan tekanan uap relatif. Cu(Mo3)2. 3H2O = 0,04 mg, FeSO4. 7H2O =
Setelah melewati kolom, gas pembawa dan 10 mg, CaCl2. 2H2O = 0,75 mg, Mg SO4. 7
sampel melalui detektor sehingga dihasilkan H2O = 200 mg, dan 1 L akuades) dimasukkan
sinyal-sinyal listrik yang kemudian ke dalam botol Schott lalu ditambahkan
dikirimkan ke sistem data atau sistem pencatat akuades 1000 ml sambil diaduk.
dan terakhir dihasilkan kromatogram. Sistem Pengkondisian pH menjadi 6.8 dengan
pencatatan data secara otomatis melaporkan menambahkan beberapa tetes NaOH 2 N atau
luas puncak, kalkulasi bentuk, data kuantitatif, HCl 2 N. Untuk menghilangkan oksigen
dan waktu retensi (Mcnair & Miller 1998). dalam media, dilakukan penambahan gas
nitrogen selama 1 jam. Setelah itu,
BAHAN DAN METODE ditambahkan 1.5 g NaHCO3. Media
disterilisasi di dalam autoklaf dengan suhu
Alat dan Bahan 121˚C selama 15 menit. Media didinginkan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian kemudian ditambahkan 5 ml vitamin B12 0.01
ini adalah tabung ulir, botol Schott 1000 ml, %. Penambahan vitamin ke dalam media
botol serum 100 ml, gelas kimia, pipet mikro, dilakukan di dalam laminar.