“AÑO DEL DIÁLOGO Y RECONCILIACIÓN NACIONAL”

Facultad: FARMACIA Y BIOQUÍMICA

Asignatura: QUÍMICA ORGÁNICA III

Tema: IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOS POR METODOS

CROMATOGRAFICOS

Docente :
Q.F. Rodriguez Maribel

Integrantes:
 Moran Marcos, Angel
 Mamani Mamani, Noemi
 Lujan Obregon, Taylor
 Poma Ticse, Christian
 Rojas Vàsquez, Ester
 Santos Jacinto, yesenia
 Zegarra Fernandez, Susana
Sección : FB5 M2
 INTRODUCCIÓN

La cromatografía en papel se utiliza para compuestos muy polares o poli

funcionales. Los azúcares son retenidos por la fase acuosa adherida al papel y
arrastrados por la fase orgánica móvil. Se trata fundamentalmente de una
cromatografía líquido-líquido de partición. Cada azúcar avanza desde el origen, en
una longitud proporcional al desplazamiento de la fase orgánica; esta longitud se
reseña mediante el parámetro Rf (Factor de Retención). Antes de que alcance el
extremo del papel, este se extrae de la cámara cromatográfica, se evapora el
disolvente y se revelan los azúcares con un reactivo característico.
El papel cromatográfico debe ser retirado de la cámara cromatográfica antes de que
el disolvente alcance el extremo del papel, de esa manera se evapora el disolvente
y se revelan los azúcares con un reactivo característico, además con frecuencia se
usan reacciones de reducción. Para identificar un azúcar desconocida se
cromatografía junto con patrones conocidos.
Clases:
1- Cromatografía ascendente: el disolvente se encuentra en el fondo del recipiente
que sostiene al papel y va subiendo a través de él por capilaridad.
2- Cromatografía descendente: el disolvente está en un recipiente está en un
recipiente del que cuelga el papel, fluye por él hacia abajo por una combinación de
capilaridad y gravedad.

HIDRÓLISIS. La hidrólisis es el proceso químico en el cual una molécula es

separada en dos partes por la adición de una molécula de agua. La reacción se lleva
a cabo cuando uno de los fragmentos del par molecular gana una molécula de
hidrogeno (H+) mientras que el otro grupo recibe un grupo hidroxilo (OH-). Las
reacciones de hidrólisis se basan en el rompimiento de tres tipos principales de
macromoléculas que son los polipéptidos, los polisacáridos y los ácidos nucleicos,
Cuando la molécula está compuesta por almidón el polisacárido es fraccionado en
unidades de menor tamaño llamadas dextrinas que son cuantificadas por diferentes
métodos (HPLC15, DNS).
 MARCO TEORICO

CARBOHIDRATOS:

Biomoléculas compuestas por carbono, hidrógeno y oxígeno, cuya función en los

seres vivos, es proporcionar energía.
Se clasifican en:

Monosacáridos
Es una unidad, ya no se subdivide más por hidrólisis ácida o enzimática, por ejemplo
glucosa, fructosa o galactosa. La estructura contiene pues, varios grupos hidroxilos
y un grupo carbonilo. El sufijo que se utiliza al referirnos a ellos es "osa”. Una hexosa
es por tanto, un monosacárido de seis átomos de carbono. Si el carbonilo se
presenta como aldehído será una aldohexosa y si se presenta de forma similar a
una cetona, diremos es una cetohexosa.

Disacárido
Los disacáridos son un tipo de glúcidos formados por la unión de dos azúcares
monosacáridos iguales o distintos mediante un enlace O-glucosídico (con pérdida
de una molécula de agua) pues se establece en forma de éter siendo un átomo de
oxígeno el que une cada pareja de monosacáridos, mono o dicarbonílico, que
además puede ser α o β en función del -OH hemiacetal o hemicetal.
Sacarosa
Es un disacárido. Por hidrólisis ácida da una mezcla equimolar de los dos
monosacáridos que la componen: la D-glucosa y la D-fructosa. El que la sacarosa
no experimente mutarrotación, no sea reductora y forme osazona, forma acetal y
cetal.

Polisacáridos
Son biomoléculas formadas por la unión de una gran cantidad de monosacáridos.
Se encuentran entre los glúcidos, y cumplen funciones diversas, sobre todo de
reservas energéticas y estructurales. Los polisacáridos son polímeros cuyos
constituyentes, son monosacáridos, los cuales se unen repetitivamente mediante
enlaces glucosídicos. Estos compuestos llegan a tener un peso molecular muy
elevado, que depende del número de residuos o unidades de monosacáridos que
participen en su estructura.

Almidón
El almidón está realmente formado por una mezcla de dos sustancias, amilosa y
amilopectina, que sólo difieren en su estructura: la forma en la que se unen las
unidades de glucosa entre sí para formar las cadenas. Pero esto es determinante
para sus propiedades.
Competencias
- Describe y realiza la hidrolisis de un disacárido y polisacárido.
- Explica y conoce las técnicas cromatográficas para identificar carbohidratos.

Materiales:
1. Matraz de 250mL
2. Pipetas de 5mL y 10mL
3. Cocinilla eléctrica
4. Centrífuga
5. Espátula
6. Backer 250mL
7. Pro pipeta
8. Bagueta
9. Balanza analítica
10. Cuba cromatografica pequeña
11. Asperjador con bombilla

Reactivos:
1. Ácido Sulfúrico al 5%
2. Carbonato de Calcio
3. Cromatofolio 20 x20 cm
5. Ácido acético
6. Piridina
7. Acetato de Etilo
8. Sacarosa Q.P
9. Almidón Q.P
10. Antrona
11. Lugol
12. Etanol
13. Revelador de difenilamina
 Procedimiento
14.

En un matraz colocar 1 g de sacarosa
después añadimos 10mL de H2SO4
al 5%
Colocarlo en baño maría hirviendo, esperar 25
minutos con la finalidad que la sacarosa
(disacárido) se convierta en dos monosacárido,
observaremos que presenta una solución de color
marrón
Enfriar el hidrolizado con agua corriente
y neutralizarlos con suficiente cantidad
de carbonato de calcio. Luego
Centrifugar y filtrar, y utilizar para la
identificación de los azúcares por
cromatografía en capa fina.

Fructuosa

MP
MS
Glucosa

Utilizaremos como
Calentar la placa por 2
revelador la antrona para Preparar los siguientes sistemas de
minutos para poder
identificar la presencia de solventes: n-butanol-agua-ácido acético
observar el recorrido de
los carbohidratos en la (5:4:1). Sembrar las placas con patrón
nuestra muestra
sacarosa de glucosa vs los hidrolizados.
Almidón

Enfriar el hidrolizado con agua corriente

Colocarlo en baño maría hirviendo, esperar 25
En un matraz colocar 1 g de almidón y neutralizarlos con suficiente cantidad
minutos con la finalidad que el almidón
después añadimos 10mL de H2SO4 de carbonato de calcio. Luego
(polisacárido) se convierta en monosacárido,
al 5% Centrifugar y filtrar, y utilizar para la
observaremos que presenta una solución de color
identificación de los azúcares por
anaranjado.
cromatografía en capa fina.

Glucosa
MP
MS

Utilizaremos como
Calentar la placa por 2 revelador la antrona para Preparar los siguientes sistemas de
minutos para poder identificar la presencia de solventes: n-butanol-agua-ácido acético
observar el recorrido de los carbohidratos en la (5:4:1). Sembrar las placas con patrón
nuestra muestra sacarosa de glucosa vs los hidrolizados.
 RESULTADOS

HIDROLISIS:

SACAROSA (disacárido) :
 D-GLUCOSA + D-FRUCTUOSA

Sacarosa

ALMIDON (polisacárido):
 MALTOSA (se forma previo a la formación de glucosa)
 D-GLUCOSA + D-GLUCOSA
 MILES DE DISACARIDO

Almidón
RESULTADOS TEORICOS PARA REALIZAR LA DE HIDROLISIS

a) En la hidrolisis el H2SO4 (ácido sulfúrico) se usó para romper los enlace y

realizar la hidrolisis más rápida.
b) Con la temperatura se aceleró el proceso de hidrolisis.
c) Se usó CaCO2 para neutralizar la acides del H2SO4.

Hidrolisis del almidón Hidrolisis de la sacarosa

Ambas hidrolisis se tornaron de color caramelo oscuro

RESULTADOS DE LA FASE MOVIL

d) N-METANOL: no polar
e) AGUA DESTILADA: polar
f) ACIDO ACETICO: semi-polar
2.- DATOS OBTENIDOS EN LABORATORIO:

1ra placa:
Fase móvil: 4.2 cm
Recorrido glucosa (monosacárido) estándar: 1.2 cm
Fase móvil: 4.2 cm
Recorrido almidón (polisacárido) muestra: 0.5 cm

2da placa:
Fase móvil: 4.1 cm
Recorrido glucosa (monosacárido) estándar: 0.9 cm
Fase móvil: 4.1 cm
Recorrido sacarosa (disacárido) muestra:
Recorrido de la glucosa (monosacárido): 0.5 cm
Recorrido de la fructuosa (monosacárido): 3.2 cm

Placas con la siembre del estándar y las

muestras en la cuba de cromatografía
RESULTADOS (RF):

 Teniendo en cuenta los datos de la placa n° 1

Glucosa y Almidón

 Teniendo en cuenta los datos de la placa n° 2

Glucosa y sacarosa
DISCUSION

HIDROLISIS DE LA SACAROSA

La sacarosa es un disacárido que no posee carbonos anoméricos libres por lo que

carece de poder reductor. Sin embargo, por medio de una hidrolisis acida; en
presencia de H2SO4 que actua como catalizador sometido a altas temperaruras, la
sacarosa se hidroliza, es decir, incorpora una molécula de agua y se descompone,
esto debido a que se rompen los enlaces glicosidicos (α -1,2) dando como resultado
a sus dos monosacaridos que lo conforman; glucosa y fructosa, que sí son
reductores.

La hidrólisis de la sacarosa (rotación óptica de +66.5°) produce una molécula de

glucosa (+52.5°) y una molécula de fructosa (-92°). Por lo tanto, los productos
cambian la dextro-rotación a levo-rotación. La mezcla molar de la glucosa y fructosa
así formada se llama azúcar invertido.
HIDROLISIS DE ALMIDON

El almidón es un polisacárido de glucosa con dos fracciones, por un lado la amilosa

que constituye un 20% y la amilopectina que conforma el 80% restante. La amilosa
es una cadena de tipo lineal de glucosas, producto de la condensación de D-
glucopiranosas por medio de enlaces glucosídicos α (1,4). La amilopectina tiene una
estructura en forma ramificada que se encuentra constituida por glucosas unidas
por enlaces α -D-(1,6).

A través de hidrólisis ácida, el almidón da glucosa. El almidón es tratado con un

ácido y altas temperatura lo que permite el rompimiento de las cadenas del almidon
dando lugar a la dextrina y estas a su vez se rompen en los enlace α(1,4) dando
lugar a la glucosa, hay que tener cuidado con la concentración del ácido, el pH, la
temperatura y el tiempo de hidrólisis son los parámetros de los cuales depende el
grado de degradación.

Así, es que determinamos que la amilosa es soluble en agua y más fácilmente

hidrolizable que la amilopectina (es más fácil romper su cadena para liberar las
moléculas de glucosa).
ANTRONA

La reacción de color para medir la concentración de carbohidratos solubles por

espectrofotometría se basa en la utilización de un compuesto llamado antrona que
se disuelve en ácido sulfúrico concentrado. El medio ácido hidroliza el enlace
glicosídico de los oligosacáridos, polizacaridos y los monosacaridos resultantes
reaccionan con la antrona. produce un derivado del furano que tiene su máximo de
absorción en 620 nm. produciendo un color verde – azulado.

FENILAMINA: Caracteriza a las aldohexosas y aldopentosas

Es un revelador de presencia de azúcares, se calienta porque es a través de los

vapores que se realiza el revelado
El reactivo de difenilamina-anilina se ha utilizado para la detección de diferentes
monosacáridos y sus derivados. En condiciones definidas, el reactivo da reacciones
de color específicos y se puede utilizar para distinguir entre los azúcares de
diferente estructura y para detectar diversos derivados de azúcares no reductores.

.
ACIDO 3.5 - DINITROSALISILICO: Caracteriza azucares reductores

El método DNS determina la presencia de grupos carbónicos libres (C=O) de los

azucares reductores. El procedimiento se basa en una reacción redox, que ocurre
en la utilización de ácido 3,5 dinitrosalisílico para provocar la oxidación de los
azucares y al mismo tiempo su propia reducción endotermica. Un mol de azúcar
reacciona con un mol de ácido 3,5 dinitrosalisílico, dando lugar a una reacción
estequiométrica que permite conocer la cantidad de azucares reductores presentes
en la muestra.

La sacarosa es un disacárido no reductor, pero tras su hidrólisis en medio ácido se

liberan glucosa y fructosa que sí son reductores y reaccionan con el DNS generando
un producto coloreado. La intensidad del color, que se puede medir por métodos
espectrofotométricos es proporcional a la concentración de sacarosa.

Transformación de azúcar reducida a oxidada utilizando un ácido en una disolución

alcalina.

Reducción entre acido 3.5-dinitrosalisilico y los azucares reductores.

el Método DNS se fundamenta en una reacción de óxido reducción, la cual es propia

de los azúcares reductores debido a que los iones de oxígenos presente en el
dinitrosalisilico en su forma oxidada son cedidos al grupo funcional aldehído (grupos
carbónicos libres).
La reacción es colorimétrica, el ácido 3.5 dinitrosalisílico es de color amarillo,
mientras que la aparición de ácido 3-amino, 5-nitrosalicílico provoca un viraje a
pardo oscuro, cuya intensidad será proporcional a la cantidad de azucares
reductores. Por esta razón, el método no es recomendable para muestras
coloreadas, ya que pueden afectar en la lectura.
 CONCLUSIÓN

Llegamos a la conclusión la sacarosa que es un disacárido puede hidrolizarse para

dar una unidad de glucosa y otra de fructosa. Tanto los monosacáridos como los
disacáridos son, por lo general, solubles en agua y de sabor dulce, observamos una
coloración marrón oscuro. La sacarosa es inerte a bajas temperaturas, pero ante
un calentamiento se produce una hidrólisis para dar glucosa y fructosa.

En la Hidrolisis Acida, se determina como el proceso que se fundamenta en que los

enlaces glucosídicos son más rápidamente descompuestos en medio ácido que en
medio alcalino, en los que poseen bastante estabilidad. El aumento de temperatura
incrementa en gran medida la velocidad de hidrólisis de glucósidos.

Se concluye que las pruebas de cromatografía, los métodos cromatográficos son

las técnicas analíticas más poderosas para el análisis cualitativo y cuantitativo de
monosacáridos y oligosacáridos.

En lo que respecta a la cromatografía de absorción, representa una buena

alternativa para evaluar selectivamente el perfil de sacarosa, glucosa y fructosa y
poder realizar el cálculo del Rf en donde en nuestra practica de laboratorio nos da
menor a uno, cumpliendo con los valores estándares.
 CUESTIONARIO

1.- Indique otros reveladores para identificar azucares por cromatografía en

capa fina.

DIFENILAMINA: caracteriza a las aldohexosas y aldopentosas.

ACIDO 3.5- DINITROSALISILICO: caracteriza a los azucares reductores.

2.- Que otros métodos cromatográficos se aplican para identificar

carbohidratos. Dé ejemplos (adjunte cromatogramas, gráficos o figuras)

Existen varias técnicas cromatográficas para determinar cuantitativamente varios

carbohidratos en simultánea. Las más importantes son:

LA CROMATOGRAFÍA EN FASE GASEOSA DE ALTA RESOLUCIÓN (CGAR).

La CGAR requiere la derivación del sustrato con trimetilsilil o acetato, antes de la

separación, lo que produce anomerizaciones que en algunos casos pueden
dificultar la identificación y recuperación de los azucares. Su resolución es alta, pero
dado se alto costo en equipo y funcionamiento, se recomienda solo para el análisis
de muestras con carbohidratos desconocidos.

LA CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA (CCF)

La CCF se basa en la migración diferencial de los azucares con solventes en placas

de silica gel, celulosa, NH2-propil sílica, o de intercambio iónico. Después de la
separación de los productos en la placa, se derivan para medirlos por fluorescencia,
índice de absorción o detección ultravioleta. Este método es muy sencillo cuando
sólo se quiere estimar su concentración, comparando con patrones conocidos.

LA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA PRESIÓN (CLAP).

La CLAP se adecua más al análisis rutinario, y en corto tiempo produce información

completa de los carbohidratos presentes.
 REFERENCIA BIBLIOGRAFICA

 Fessenden J. Carbohidratos, Lípidos y Proteínas Química Orgánica, Editorial

Iberoamericana 1ra. Ed.

 Ruiz ME. Nutrición [internet]. 1 era edición. Costa Rica: Rispal; 1990
[Actualizado 1990; citado 08 Sept 2018] disponible en:
https://books.google.com.pe/books?id=sx4gwEmruhYC&pg=PA17&dq=met
odo+cromatograficos+para+identificar+carbohidratos&hl=qu&sa=X&ved=0a
hUKEwjP59v6kq7dAhVE61MKHdiHC7UQ6AEIIzAA#v=onepage&q=metodo
%20cromatograficos%20para%20identificar%20carbohidratos&f=false

 Miller G., 1959. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of

Reducing Sugar. Anal. Chem. 31: 426-428.
https://es.scribd.com/document/377664185/Practica-Azucares-Reductores

 https://es.slideshare.net/LeidyCristancho/manual-de-mtodos-generales-
para-determinacin-de-carbohidratos.

 Sánchez Puertas M. Comprobación de la Actividad Tintorera en Fibras

Orgánicas y Sintéticas de la Berberis halliii. Riobamba, Ecuador: 2010.
[Internet] [Consultado 07 Sep 2018] pág. 83. Disponible en:
http://dspace.espoch.edu.ec/bitstream/123456789/698/1/56T00228.pdf