AMONIO CUATERNARIO EN LA AGRICULTURA

OBJETIVO GENERAL
Determinar la dosis, en la cual, el amonio cuaternario actúa como fungicida y
bactericida eficaz de dichos microorganismos que están presentes en árboles
frutales del suroccidente colombiano y flores caracterizadas del Oriente
Antioqueño.

OBJETIVOS ESPECIFICOS
● Identificar la capacidad fungicida y bactericida del amonio cuaternario en la
agricultura.
● Cuantificar los posibles residuos de amonio cuaternario en los frutos, tales
como: granadilla, fresa, tomate y lulo, por medio de HPLC.
● Evaluar los resultados obtenidos in vivo, de la concentración de dicho producto
en las muestras frutales anteriormente mencionadas.
● Si la anterior evaluación arroja resultados viables, estableceremos
recomendaciones de manejo del amonio cuaternario para los agricultores que
utilizan este compuesto de aplicacion y uso en cuanto a la dosificación y
manejo del producto. Por el contrario si los resultados obtenidos en la
cuantificación de rastras son excedentes a la norma, nuestro objetivo viable
fundamentar una política pública en la cual se prohíba el uso de dichos
compuestos en productos de consumo humano.
 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En el Valle de Sibundoy- Putumayo y en Potosí e Ipiales –Nariño, se comenzó a

utilizar sales de amonio cuaternario para controlar plagas de bacterias y hongos
en sus cultivos, tales como: granadilla, lulo, fresa, arveja, tomate de árbol, dando
como resultados óptimos para el control de estas, pero lo que consideramos es
que hay poco conocimiento del efecto a largo plazo y los residuos que pueden
quedar en los frutos, y la poca información que existe de parte de los ingenieros
agrónomos ya que solo se hizo una aplicación experimental, después de ver
buenos resultados a corto plazo, se siguió utilizando este amonio cuaternario en
todos los cultivos presentes en esta zona sur del país.
Este desconocimiento nos llevó a investigar el impacto ambiental que puede
resultar por el uso indiscriminado, los riesgos que pueden generar a los que
aplican este producto, los residuos que pueden quedar en el fruto y la tierra y la
concentración que se deben utilizar.
Otro motivo, que nos llevó a realizar esta investigación es que los floricultores
antioqueños, han tenido muchos problemas con el control de las plagas y los
agroquímicos que han sido utilizado; aunque los agroquímicos controla las plagas,
son un bactericida y fungicida muy fuerte para las flores, y en el momento de
exportación hacia Europa, rechazan las flores por tener presencia de estos
residuos agroquímicos en altas concentraciones.
Este proyecto investigativo se desarrollará con las siguientes metodologías: con
medios envenenados para determinar la concentración mínima de inhibición y por
HPLC para cuantificar los residuos de amonio cuaternario en los frutos que se van
a estudiar.

JUSTIFICACION

Los fitosanitarios se han convertido desde hace varios años en herramientas

estratégicas para la producción agrícola. Sin embargo, hay una supuesta
marcada reducción de la peligrosidad de los mismo y temas pendientes a resolver.
Entre ellos se destacan los aspectos ligados a la salud humana, a la preservación
de los recursos naturales, todos ellos enmarcados en lo que se podría definir
como responsabilidad social y ambiental de las personas relacionadas con las
aplicaciones tendientes al control de plagas, enfermedades y malezas.
 MARCO DE REFERENCIA

Descripción general de los desinfectantes

La desinfección de instrumentos y superficies de los puestos de trabajo,
básicamente en el laboratorio donde se manipulan muestras biológicas, constituye
la forma más adecuada de evitar el posible contagio. Esto se consigue con una
correcta utilización de desinfectantes. Para el empleo de estos productos es
necesario conocer los riesgos ligados a su utilización y los consejos de prudencia
que deben estar indicados en la etiqueta y en la ficha de datos de seguridad. En
general, el producto debe poderse aplicar de tal manera que no presente ningún
riesgo de toxicidad aguda o crónica para los animales y el hombre. Debe tenerse
en cuenta que, por su propia función, destrucción de microorganismos, la mayoría
de desinfectantes tienen unas características de toxicidad importantes. La primera
acción preventiva en cuanto a su uso es comprobar que estén adecuadamente
etiquetados según la normativa vigente, (Reales Decretos 1078/1993, preparados,
y 363/1995, substancias, y siguientes, transposición de las correspondientes
Directivas de la Unión Europea), tanto si se ha adquirido comercialmente como si
se han preparado en el propio laboratorio. Al adquirir productos químicos debe
exigirse siempre con la primera entrega la ficha datos de seguridad
correspondiente.

Compuestos de amonio cuaternario

Este conjunto de compuestos (conocidos como "quats") representan una familia
de compuestos antimicrobianos en los cuales las cuatro valencias del átomo de
nitrógeno están ocupadas por grupos tipo alquilo de complejidad variable. Son
solubles en agua y en alcohol y poseen propiedades tensioactivas. Los
compuestos de amonio cuaternario actúan a nivel de la superficie celular,
incrementando la permeabilidad de la membrana con la consecuente pérdida de
los componentes citoplasmáticos. El espectro de actividad de estos productos es
bastante elevado frente a bacterias y hongos, pero escaso frente a virus y
esporas. Es necesario remarcar que hay microorganismos, como pseudomonas,
que en algunos amonios cuaternarios encuentran un medio de cultivo en el que se
multiplican perfectamente. Esta bacteria puede crecer, por ejemplo, en cloruro de
benzalconio que, utilizado como desinfectante de superficies, ha sido la causa de
inesperadas infecciones en hospitales. Los compuestos de amonio cuaternario
son inactivos frente a las aguas duras, por lo que no deben utilizarse para
desinfectar el agua de los sifones de vaciado, rica en sales.
En la revisión encontramos varios artículos, los cuales, realizaron estudios en
varios alimentos.

Alimento Preparación del Resultados Microorganismo

y objetivo inóculo estudiado

Cáscara Se siembra en agar Los niveles promedio Cepas

de nuez de soja tríptico de población de ​Salmonella​, ​E.
(TSA), obtenidos para cada coli​ O157: H7,
suplementado con patógeno después y ​L. monocytogenes
ácido nalidíxico a 50 del tratamiento con
g/ml (Tsan) y se los desinfectantes o
incubaròn a 37±2 °C líquidos de control se
durante 24±2 h. Las reportan aquí.
bacterias se Después de la
cultivaron y una sola inoculación en las
colonia se transfirió cáscaras de nuez, las
a una placa de poblaciones de
TSAN fresco y se partida para los tres
incubaron a 37±2 ° patógenos oscilaron
C durante 24±2 h. entre 4,4 y 6,1 log
1 ml de UFC / g.
desinfectante, se
añadió a cada tubo,
cerrar el tubo, agitar
por 30 s, las
muestras se
incubaron a 30 °C
durante 48 h.

Se evaluó A la fase de Los resultados Antibacteriano (​E​.​coli

mediante registro suspensión indicaron que la y ​S​ . ​albus​)
la bacteriana se diluyó acrilamida Antifungica (​R​. ​solani
determina en caldo de carne monómeros QAS y ​Foc​ actividades 4​)
ción de la de vacuno peptona eran inactivos contra
MIC en extracto para Foc 4 probado, y sus
contra de obtener una valores de MIC y
E . ​coli y concentración de MFC eran altas o
S . ​albus 10​6 -10 7​ UFC / mL. incluso no se pudo
por el Entonces se añadió determinar debido a
método 75 l 0,02% en peso los valores mucho
de de cloruro de más altos que la
coloración tetrazolio concentración
TTC, y la 2,3,5-trifenil (TTC) y ensayada (3,000
actividad el contenido de mg/mL).
antifúngic cada pocillo se Considerando
a se midió mezclaron por poliacrilamida Qass
mediante agitación vorticial fueron eficaces
la antes de la contra la ​Foc 4 con
inhibición incubación en la una menor MIC y los
del oscuridad a 37 ° C valores de MFC (1-5
crecimient durante 2-4 h. mg/ml) y las
o de Foc 4 fue elegido proporciones de
micelio, como el MFC/MIC de todos
así como microorganismo poliacrilamida Qass
MIC y la probado para fueron menos de 4, lo
concentra determinar los que indica que eran
ción valores de MIC y fungicidamente
mínima MFC de las eficaz.
fungicida muestras. ​Foc 4 Por otra parte, similar
valores microorganismos se con los resultados de
(MFC). incubaron a 28 ° C inhibición del
durante 7 días en crecimiento de
medio PDA; la micelio, los polímeros
suspensión fúngica con grupo bencilo en
se preparó la estructura de QAS
añadiendo 1 ml de muestran un mejor
0,85% de solución efecto antifúngico
salina que contiene con valores de MIC y
0,01 ml de Tween MFC de 1 y 1 mg/ml,
20 a la colonia se respectivamente. El
incubaron. mecanismo
concebible para la
acción antimicrobiana
del compuesto
cuaternizado es que
los grupos de amonio
interactúan con los
grupos aniónicos en
la superficie celular
microbiana que se
compone de
polisacáridos y ​β
-glucano. Las
estructuras de
bacterias y hongos
 fitopatógenos son
diferentes, por lo que
los factores (tales
como el peso y las
estructuras de
polímeros molecular)
que afectan las
actividades
antibacterianas y
antifúngicas difiere.

La concentración La actividad fúngica La actividad

mínima inhibitoria disminuyó con la antimicrobiana contra
(MIC) de los aplicación de bacterias de cultivos
compuestos de compuestos de que amenazan la
quitosano se quitosano. Sin Agrobacterium
determinó utilizando embargo, el nivel de tumefaciens y
el método de inhibición del Erwinia carotovora y
dilución NA contra crecimiento fúngico hongos ​Botrytis
A​. ​tumefaciens y ​E​. nunca alcanzó el cinerea ,
carotovora.​ Se 100%, lo que nos Botryodiplodia
vertió en las placas llevó a suponer que theobromae,​
de Petri a una el crecimiento de los Fusarium oxysporum
temperatura de hongos se vio y ​Phytophthora
40-45 ° C. Los afectada por los infestans se
compuestos se compuestos de evaluarción.
ensayaron a quitosano, pero no
concentraciones totalmente inhibida.
variaron de 100 a
3000 mg / L y cada
concentración se
ensayó por
triplicado.
La actividad
antifúngica de los
compuestos de
quitosano contra ​B.​
cinerea,​ ​Bd​.
theobromae,​ ​F.​
oxysporum y ​P.​
infestans fue
aprobada usando
técnica de
crecimiento radial
micelios.Después
 de la solidificación,
las mezclas se
inocularon con un 5
mm en los hongos
micelio de diámetro
en el centro de
placas de Petri y
éstas se incubaron
en la oscuridad a 27
° C. El crecimiento
de los hongos se
midió cuando el
control había
crecido hasta el
borde de la placa.

HIPÓTESIS DE ESTUDIO

1. Amonio cuaternario inhibe el crecimiento de hongos fitopatógenos de flores.

2. Residualidad del AC puede ser nociva para la salud.
3. AC puede tener un efecto fitotóxico.

DISEÑO EXPERIMENTAL

MEDIOS ENVENENADOS

El objetivo de la investigación fue evaluar la actividad antifúngica, antibacterial

in vitro de los extractos de pirul (Shinus molle), chirimoya (Annona cherimola),
canela (Cinnamomum zeylanicum) y tabaquillo (Nicotiana glauca) sobre el
crecimiento micelial y esporulación de Fusarium oxysporum, Fusarium
culmorum y Fusarium solani. El trabajo de investigación se realizó en la
Universidad Autónoma de Aguascalientes (UAA), y en la Universidad
Autónoma Agraria Antonio Narro (UAAAN). Las cepas de Fusarium fueron
previamente identificadas en el Laboratorio de Parasitología de la UAA. Los
extractos fueron obtenidos en el Laboratorio de Toxicología de la UAAAN. Para
determinar la inhibición del crecimiento micelial, dosis efectiva media (ED50) y
número de conidios, se utilizó la metodología de medio envenenado, donde se
evaluaron diversas concentraciones de los extractos.

valuación de los extractos vegetales. Se evaluaron los cuatro extractos

vegetales arriba mencionados, sobre F. oxysporum, F. culmorum y F. solani.
Para ello, se utilizó la metodología de medio de cultivo envenenado, utilizando
las siguientes dosis: canela: 50, 100, 150, 200, 250 y 300 ppm; chirimoya:
2000, 4000, 6000 y 10000 ppm; tabaquillo: 1000, 2000, 4000, 6000, 8000 y
10000 ppm, y Pirul: 500, 1000, 2000, 4000, 6000, 8000 y 10000 ppm. Para la
obtención de las dosis se tomó el extracto a una concentración del 100%, y
luego se realizaron diluciones utilizando como solvente el medio de cultivo
hasta obtener las concentraciones deseadas. Una vez obtenidos los medios de
cultivo a las diferentes concentraciones se colocaron explantes de 0,5 cm de
diámetro de los fitopatógenos evaluados, se incubaron a 25 °C ± 2 en
oscuridad hasta que el crecimiento del micelio de la caja testigo (PDA sin
extracto) alcanzó el tamaño de la placa. El diámetro del crecimiento del micelio
se midió diariamente con un vernier. El porcentaje de inhibición de crecimiento
se determinó de la siguiente manera: % inhibición = crecimiento micelial del
testigo - crecimiento micelial del tratamiento / crecimiento micelial del testigo x
100. Por otro lado se contabilizó el número de conidios a los 9 días después de
la inoculación en los diferentes tratamientos evaluados utilizando una cámara
de Neubauer.

1. ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DEL AMONIO CUATERNARIO

Todos los hongos se cultivan sobre el medio de cultivo papa-dextrosa-agar

(PDA) a pH=5.7, con alternancia de luz y oscuridad (16 y 8 horas
respectivamente) y a una temperatura de 26 a 28oC durante siete días.
Se evaluarán x concentraciones de amonio cuaternario. Cada una de las
concentraciones se disolverán en el medio cultivo papa dextrosa agar (PDA)
después de su esterilización. Se tomará un disco de micelio proveniente de un
cultivo sembrado con 10 días de anterioridad y se siembra en las cajas Petri
que contenían los diferentes tratamientos. Se incubarón a 27° C por 72 horas.
La evaluación se realizará mediante la medición del crecimiento radial del
micelio, utilizando la fórmula:
% Inhibición =
Donde C = Crecimiento radial del hongo en el control (Sin tratamiento)
T = Crecimiento radial del hongo con el tratamiento
Todas las concentraciones se evalúan por triplicado.
Tanto en la CMI como en la CE50 se utilizó como testigo el producto comercial.

1.2 Evaluación del efecto fungicida o fungistático

El efecto fungistático o fungicida se determinará después de la dilución de las
diferentes concentraciones de AC en el agar. De las cajas de Petri que
contenían los hongos expuestos a los tratamientos diluidos en el medio de
cultivo se tomarán discos de micelio de 6 mm de diámetro y se pusieron sobre
PDA sin tratar. Se incubarán a 27ºC por 72 horas y se midió el crecimiento
radial del micelio, sin tener en cuenta el tamaño del disco de micelio puesto
inicialmente (Veloz-García et al., 2010). Las evaluaciones se realizarán al
tercer, quinto y séptimo días posteriores a la inoculación, en las que se
determinó el crecimiento micelial midiendo el diámetro de cada colonia y
determinando el promedio de los micelios.

1.3. Análisis estadístico

Se realizó un diseño completamente aleatorizado y con tres repeticiones por
tratamiento.
Se realizará un análisis de varianza (ANOVA) y la prueba de comparación de
medias de Tukey para un nivel de significancia P≤ 0.05, usando el programa
estadístico R. Para determinar la concentración efectiva 50 (CE50) se utilizó el
método de regresión lineal.

2. ANÁLISIS DEL EFECTO FITOTÓXICO DEL AMONIO CUATERNARIO.

3. ANÁLISIS DE LA RESIDUALIDAD DE AMONIO CUATERNARIO EN
FLORES

BIBLIOGRAFIA
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Salmonella spp., Escherichia coli O157:H7, and Listeria monocytogenes on peanut and pistachio
shells​. McEgan, Rachel; Danyluk, Michelle D. (2015) ​Food Microbiology​ vol. 47 p. 93-98
2. NTP 429: Desinfectantes: características y usos más corrientes. ​España. Consulta
hecha 19-02-15. Disponible en:
http://www.insht.es/InshtWeb/Contenidos/Documentacion/FichasTecnicas/NTP/Fichero
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3. Synthesis and antimicrobial activities of acrylamide polymers containing quaternary
ammonium salts on bacteria and phytopathogenic fungi​. Zhang, Anqiang; Liu,
 Qiongqiong; Lei, Yufeng; Hong, Shuanghao; Lin, Yaling (2015). ​Reactive and Functional
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