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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN

FACULTAD DE INGENIERÍA DE PROCESOS

ESCUELA PROFESIONAL INGENIERÍA QUÍMICA

CURSO: INGENIERÍA DE BIOPROCESOS

INVESTIGACIÓN FORMATIVA:
EXTRACCIÓN DE ADN DE TEJIDO ANIMAL

“Análisis de cantidad de ADN extraído de tejido de hígado y sangre de Cavia


porcellus (Cuy) mediante lisis”

DOCENTE: DR. PAVEL DELGADO SARMIENTO

INTEGRANTES:
- Causa Ayala, Ángelo
- Cordero Eguia, Heber
- León Villanueva, Aracelly
- Mullisaca, Mary
- Pinto Subia, Cinthya
- Vilcahuamán Churata, Flor
- Villafuerte Gonzales, Jonnathan
- Villalba Pari, Nathaly
- Yucra Chambilla, Erika

 GRUPO: “C”

AREQUIPA – PERÚ

2018
EXTRACCIÓN DE ADN DE TEJIDO ANIMAL
_____________________________________________________________________________________________

1. OBJETIVOS :

A. Objetivo general:

 Análisis de cantidad de ADN extraído de tejido de hígado y sangre de Cavia


porcellus (Cuy) mediante lisis

B. objetivos específicos:

 Extracción de ADN de tejido animal, usando como fuente Cavia porcellus (Cuy).
 Determinar la cantidad de ADN extraído sangre de Cavia porcellus (Cuy).
 Determinar la cantidad de ADN extraído de tejido del hígado de Cavia porcellus
(Cuy).
 Determinar la cantidad de ADN según el rendimiento.
 Determinar la cantidad de ADN extraído mediante prueba estadística de
comparación Múltiple de medias de acuerdo al criterio de Tukey.
 Analizar la cantidad de ADN obtenido de sangre e hígado.

2. JUSTIFICACIÓN:
El presente trabajo se realiza con el objetivo de determinar cuál de las fuentes de
extracción de ADN: tejido higado y sangre se obtiene mayor cantidad de ADN en Cavia
porcellus (Cuy).

3. ANTECEDENTES:

 Resistencia antimicrobiana y genotipificación de cepas de Salmonella Typhimurium


aisladas de cuyes (Cavia porcellus) provenientes de granjas de producción intensiva
de la ciudad de Lima, Perú.

 Análisis de cantidad y calidad de ADN genómico extraído en folículos pilosos y sangre


de Cavia porcellus “cuyes” mediante el método comercial.
- http://dspace.unitru.edu.pe/bitstream/handle/UNITRU/9657/Espinoza%20Blas%20
Magaly%20Evamaria.pdf?sequence=1&isAllowed=y

 Comparación de métodos para la extracción de ADN en cuyes (Cavia porcellus


Rodentia, caviidae).

- http://www.lrrd.cipav.org.co/lrrd22/4/burg22081.htm

 Diferenciación reproductiva, productiva y molecular de cuyes nativos de la región


Cajamarca.

- http://repositorio.concytec.gob.pe/bitstream/CONCYTEC/84/1/Mantilla.pdf

 Análisis de cantidad y calidad de ADN genómico extraído en folículos pilosos y sangre


de vicuña pacos “alpacas” mediante el método comercial.

- https://alicia.concytec.gob.pe/vufind/Record/UNIT_d651cead2ac0ece2bcbc3a5db7ff
011f

ANTECEDENTES HISTÓRICOS:

Las pruebas existentes demuestran que el cuy fue domesticado hace 2 500 a 3 600 años. En
los estudios estatigráficos hechos en el templo del Cerro Sechín (Perú), se encontraron
abundantes depósitos de excretas de cuy y en el primer periodo de la cultura Paracas?
denominado Cavernas (250 a 300 a.C.), ya se alimentaba con carne de cuy. Para el tercer
período de esta cultura (1400 d.C.), casi todas las casas tenían un cuyero (Tallo, citado por
Moreno, 1989). Se han encontrado cerámicas, como en los huacos Mochicas y Vicus, que
muestran la importancia que tenía este animal en la alimentación humana.

Se han extraído restos de cuyes en Ancón, ruinas de Huaycan, Cieneguilla y Mala. Allí se
encontraron cráneos más alargados y estrechos que los actuales, siendo además
abovedados y con la articulación naso-frontal irregular semejante al Cavia
aperea (Huckinghaus, 1961).

El hallazgo de pellejos y huesos de cuyes enterrados con restos humanos en las tumbas de
América del Sur son una muestra de la existencia y utilización de esta especie en épocas
precolombinas. Se refiere que la carne de cuyes conjuntamente con la de venado fue
utilizada por los ejércitos conquistadores en Colombia (Pulgar Vidal, 1952).

4. MARCO TEÓRICO:

4.1 Cuy

Es un pequeño mamífero del orden de los roedores originarios de la zona andina del
Perú y otros países sud americanos. Tiene el cuerpo compacto y mide entre 20 y 40
centímetros. El pelo de algunas especies es largo y la textura puede ser áspera o
suave. El color puede ser blanco, negro o leonado; también los hay de pelaje con
rayas o manchas de colores oscuros sobre fondo blanco.

El cuy por su rápida reproducción y por su crianza económica, ofrece las mejores
perspectivas para contribuir a elevar el estándar de vida de la población con
el consumo de carne en la alimentación.

4.2 Sangre de cuy.

Los valores de Hemoglobina los valores determinados son similares, variando entre
14.07 y 14.68; los % de hematocritos en promedio varias entre 41.40 a 42.60. Los
machos registran valores (42.86) ligeramente superiores que las hembras (41.8). Los
resultados según el análisis estadístico nos deja notar que no existe diferencia
significativa entre los promedios de los diferentes tipos y sexos, a excepción del
recuento de eritocritos en el que es altamente significativa la diferencia, siendo
mayor en los machos. las ligeras variaciones pueden estar relacionadas a los factores
de altitud, edad, peso o sexo.

La sangre y la carne de cuy ayudarían a controlar la enfermedad, y evitan que la


asparagina se siga convirtiendo en tumor.

"La asparaginasa es una enzima que ataca a la asparagina, proteína que la convierte
en ácido aspártico, que es inocuo. La asparagina está, por ejemplo, en la leucemia, y
es una de las proteínas más comunes en dichas neoplasias que se reproducen de
manera Rápida.

4.3 ADN

La biología molecular ha avanzado mucho en los cuarenta años siguientes al descubrimiento


de la estructura del ADN ya que es la que contiene la información genética. El primer paso
para realizar estudios es disponer de muestras de ADN con calidad y cantidad que permita su
análisis molecular. (De Jesús et al. 2005).

El ácido desoxirribonucleico (ADN) constituye el material genético de los organismos vivos,


la estructura del ADN es una pareja de largas cadenas de nucleótidos; cada nucleótido está
formado por un grupo fosfato, una desoxirribosa y una base nitrogenada. Existen cuatro
bases: dos purínicas (o púricas) denominadas adenina (A) y guanina (G) y dos pirimidínicas (o
pirimídicas) denominadas citosina (C) y timina (T) (Lodish et al. 2004).

Los ácidos son polímeros lineales de una unidad repetitiva llamada nucleótido el cual
está constituido por:

a) Una pentosa: ribosa o desoxirribosa


b) Una base nitrogenada: púrina o pirimidina
c) Ácido fosfórico (Ácido ortofosfórico)
La unión de las bases nitrogenadas con la pentosa constituye un nucleótido. Finalmente la
unión éster de un nucleósido con ácido fosfórico se conoce como nucleótido.

El DNA es el responsable de la transmisión de los caracteres hereditarios. El DNA está


formado por dos cadenas polinucleotidicas, enrolladas en espiral a lo largo de un eje común.
Las dos cadenas de la doble hélice corren en direcciones opuestas. El esqueleto azúcar
fosfato de cada una de las cadenas se encuentra hacia el exterior de la doble hélice y las
bases nitrogenadas están en el interior. Las dos cadenas están unidas por puentes de
hidrógeno establecidos entre las bases, se constituyen dos puentes de hidrógeno entre los
pares A-T y tres puentes hidrógeno entre los pares G-C.

La adenina siempre se unirá a la timina y la guanina siempre se unirá con la citosina. Los
puentes de hidrógeno pueden romperse por el calor y por agentes químicos, obteniéndose
un DNA desnaturalizado.

El aislamiento y purificación del DNA se puede realizar aprovechando su propiedad de


absorber luz a la longitud de onda 260 nm.

Figura n°1: Estructura helicoidal del DNA

La purificación del DNA es importante porque permite:


 Identificar mutaciones.
 Ver características propias de los tipos de DNA (Polimorfismo).
 Para clonar (Genes específicos, fragmentos de cromosomas o individuos).
 Aislar DNA afectado y compararlo con uno bueno.
 Detectar en las muestras, la presencia de un largo espectro de agentes patogénicos.
 Identificar resistencia microbiana.
 Evaluar desordenes genéticos, neurodegenerativos, neoplásicos, imunológicos.
 Medicina forense para la identificación de personas.
 Para hacer tests de paternidad.
ADN de Sangre

La sangre es una fuente excelente de ADN. Éste está presente en los glóbulos blancos (o
leucocitos), pero no en los glóbulos rojos humanos (eritrocitos o hematíes), pues éstos
carecen de núcleo. Una mancha de sangre del tamaño de una moneda pequeña,
correspondiente a unos 50 microlitros, tiene suficiente ADN para un análisis típico de VNTR.
ADN de Tejido Cualquier tejido del cuerpo que no se haya degradado es una fuente potencial
de ADN.
5. HIPÓTESIS:
Si es posible extraer el ADN de Cavia porcellus “cuyes” de mayor calidad y cantidad a
través de folículo piloso.

6. METODOLOGÍA:
LISIS DEL ADN

Las sales aumentan el poder iónico de la solución y ocasionan la precipitación del ADN

Tejidos: sangre - hígado

7. PARTE EXPERIMENTAL
7.1.- MATERIALES:

 6 tubos de ensayo con tapón rosca


 Vasos De PP
 3 Pipetas Pasteur
 1 Gotero
 1 bagueta
 3 placas petri
 Papel filtro
 Gradilla para tubos de ensayo.

7.2.-REACTIVOS

 Bicarbonato de Sodio
 Alcohol de 96 grados
 Jabón liquido o Detergente líquido
 Agua DESTILADA o Agua Mineral.
 NaCl.

7.3.-MUESTRA

 Tejido Sangre
 Tejido Hígado.

7.4 PROCEDIMIENTO

SOLUCIÓN TAMPON LISIS.


Materiales:
 agua destilada o agua mineral no especifica la cantidad.
 NaCl
 Bicarbonato de Sodio (NaHCO3 ) no especifica cantidad.
 Detergente líquido o jabón líquido.
Preparación:
1.-Mezclar en la secuencia anterior todos los ingredientes ya que al mover esta
mezcla neutraliza las cargas negativas.
2.-Tapar y agitar la mezcla.

SOLUCIÓN DE LISIS

PARA LA OBTENCIÓN DE MUESTRAS SE EXTRAEN DEL CAVIA PORCELLUS


TEJIDO – HIGADO

1. Picar el hígado y Triturar el hígado con sal, solución de lisis y SDS hasta que la
muestra quede liquida.

 Filtrar y llevar a tubos de ensayo

2. Lisis de las membranas celulares con detergente, en solución salina para liberar los ácidos
nucleicos y las proteínas.
3. Digestión de las proteínas por acción enzimática de proteasas (Opcional).

4. Precipitación con etanol helado. El DNA es soluble en alcohol, pero se torna insoluble en
presencia de sal (NaCl) porque el sodio neutraliza la carga negativa de los grupos fosfatos. El
etanol formará una capa en la superficie por ser menos denso que la solución acuosa.

5. Observación de agregados moleculares, de consistencia mucoidea, en la interfase entre la


solución acuosa y el alcohol.

TEJIDO - SANGRE

1.- Obtenemos la muestra colectada.

2.- Verter la muestra problema 10 ml. con gotero a un tubo de ensayo.

3.- Llevar a centrifugadora y separar el plasma por 2 min a 4000 RPM y luego 3 min a 3000
RPM.

4.- Una vez separados el plasma y plaquetas, extraer el plasma.


5.- Verter 20 ml la solución LISIS O TAMPÓN agitada previamente hacia la solución de
sangre extraída en el paso 3).

6.- Agregar alcohol de 96 grados o 96 % “por los bordes del tubo e inclinándolos” (tener en
cuenta).

7.- Aparece Interfase banda blanquecina - rosacea que corresponde al ADN para recoger,
recogerlo con pipeta Pasteur.

8.- Reposar LA MUESTRA por unos cuantos minutos (5 min a más aprox.)

9.- Llevar a Centrifugación por 40 revoluciones a un tiempo de 10 minutos.

10.- Lo que se observa como la muestra salpicada en el tubo de ensayo indica que es el
ADN.
TEJIDO - HIGADO

Se realiza el mismo procedimiento que en la sangre.


6.- RESULTADOS:
Obtuvimos lo siguiente: para las muestras de sangre

La parte de encima es la muestra de ADN.

En el hígado se observa agregados moleculares, de consistencia mucoidea, en la interfase


entre la solución acuosa y el alcohol.
EN TEJIDO DE HÍGADO:

Muestra Al triturar el hígado +Solución de +Sal y agua


detergente destilada

OBSERVACIÓN:
Se forma una masa semi- Se origina una masa Se vuelve una masa
TEJIDO-HIGADO
líquida. parcialmente líquida. casi completamente
líquida.
COLOR :
marrón Marrón suave Rojo oscuro
INTERPRETACIÓN:
Esto muestra una ruptura El detergente al entrar en Los iones sodios (en la
total del tejido, es decir, contacto con las células, sal), impiden que las
se separan las células captura los lípidos y las cargas negativas de los
unas de otras. proteínas, que forman grupos fosfatos (en el
Es la primera destrucción parte de las membranas. ADN), interaccionen
física de la muestra para En este proceso la con las moléculas de
aislar al ADN. membrana nuclear han agua. Por ello, la sal
sido destruidas. permite que el ADN se
Además el detergente vuelva insoluble, que
permite de las proteínas las cadenas de ADN no
que acompañan al ADN, sean cortadas y que
que son de gran tamaño, favorezcan en la
sean cadenas más precipitación de
pequeñas y se puedan solución de alcohol. En
separar. la sal, la cual también
ayuda a que no se
produzcan uniones de
las proteínas
(histonas) con el ADN.
Por otro lado el agua
destilada ayuda en
gran medida a la
visualización del ADN.
Por el contrario si
hubiera un cierto
exceso no se
visualizarla el producto
final.
Al ser sometido a un + Alcohol Después de algunos Al extraer el ADN
proceso de filtrado segundos

OBSERVACIÓN:
Después de este Poco a poco Permanecieron las dos El ADN toma el aspecto
proceso, la muestra apareció una capas iniciales pero con de una nube de
liquida tiene 2cm de capa de fibras de más intensidad. algodón oscuro
volumen. color marron , Aparecen pequeñas de mojado, pequeño y
como fragmentos ADN que se han pegajoso.
de algodón formado.
ocscuro, que
situaron sobre la
mezcla dehigado.
COLOR:
Marron opaco marron opaco en Marron más opaco Fibras marrones
el inferior y claro (parte inferior) y claro
en la parte (parte superior).
superior.
INTERPRETACIÓN:
El proceso de El alcohol al ser El ADN se enrolla de El ADN ha sufrido
filtrado ha permitido menos denso que manera muy ajustada cambios en su
la eliminación de el agua se situó en formando grumos estructura, se ha
restos celulares. El la capa superior. dentro de las células. desenrollado y en
ADN pasa el tubo de Precipitó al ADN, y Y al ser extraídas aún consecuencia adopta
ensayo como este al siguen permaneciendo esta estructura.
líquido, que no es encontrarse con el ajustadas formando Además puede ser
retenido en el filtro. alcohol se grumos pero no como observado y por ende,
desenrollo, ya que en un principio. extraído al estar en
el ADN no es contacto con el
soluble en este alcohol.
líquido. Cabe recordar que el
Por otro lado, la ADN obtenido es
parte acuosa, que producto del
se ubicó en la rompimiento de
parte inferior, muchas células,
contiene entonces todo este
proteínas, lípidos, ADN puede también
y otros ser visible debido a la
componentes de la cantidad de células
celulares. que habían en el
De esta manera, el higado.
alcohol aisló al
ADN.
7.- CÁLCULOS
Hígado:

Datos:

- Hígado de cuy=15 g (triturado)


- Agua destilada = 2ml
- NaCl = 4g
- NaHCO3=2g
- Detergente=3ml
- Alcohol etanol= 10ml
- ADN obtenido (filamentos) = 0.05g
- Rendimiento del ADN en hígado:

0,05g ADN
∗ 100 = 0.33%
15g higado

Sangre:

Datos:

- Sangre de cuy=10 ml
- Agua destilada = 2ml
- NaCl = 4g
- NaHCO3=2g
- Detergente=3ml
- Alcohol etanol= 10ml
- ADN obtenido (filamentos) = 0.01g
- Rendimiento del ADN en sangre:

0,01g ADN
∗ 100 = 10%
0.10g sangre

 Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza del ADN:

 Cantidad de material de partida


 Número de copias de las moléculas de ADN
 Cantidad de tejido.
 Condiciones en las que se encuentra el material de inicio(fresco, congelado, fijado)
 Contaminantes e interferentes en el material biológico

EVALUACION 1

TEJIDO
ADN TEJIDO SANGRE HIGADO
OBSERVACION
#1 5 5
OBSERVACION
#2 5 5
OBSERVACION
#3 5 5
OBSERVACION
#4 4 4
OBSERVACION
#5 4 4
OBSERVACION
#6 3 4
OBSERVACION
#7 3 4
OBSERVACION
#8 5 2
OBSERVACION
#9 5 2
8.- CONCLUSIONES:

 Se logró determinar la cantidad de ADN obtenido de sangre e hígado.


 Se logró extraer el ADN de tejido animal del Cavia porcellus (Cuy).
 Se logró determinar la cantidad de ADN extraído de la sangre del Cavia porcellus
(Cuy).
 Determinar la cantidad de ADN extraído de tejido del hígado de Cavia porcellus
(Cuy).

 Se logró determinar la cantidad de ADN extraído sangre y tejido de Hígado del Cavia
porcellus (Cuy ) mediante el rendimiento, que fue del 10% para el ADN en sangre ,y
0,33% en ADN en tejido de Hígado, comprobando que el rendimiento en sangre es
mayor que en el de hígado.
 Se logró determinar la cantidad de ADN extraído mediante prueba estadística de
comparación Múltiple de medias de acuerdo al criterio de Tukey, demostrando que si
existen diferencias significativas entre la cantidad de ADN extraído en sangre y el
tejido de Hígado, dando un 0.44% de diferencia del tejido de Hígado con el tejido de
Sangre, con un 95% de nivel de confianza, y 0.05% de error.

9.- DISCUSIONES:
Según algunos autores que han realizado estudios a nivel de genética molecular en cuyes,
han indicado tejidos para la obtención de extracción de ADN, como la sangre, hígado y piel
(Spotorno et al 2004, Burgos et al 2007). Sin embargo, en múltiples ocasiones, la obtención
de estos tejidos, implica una situación de estrés para el animal, e inclusive su muerte. Ante
esta situación es necesario realizar ensayos que permitan la obtención de muestras, que no
sean invasivas o perjudiciales para el animal.

Los resultados de esos estudios, indicaron que le extracción de ADN de sangre permitió
obtener una mayor concentración de ADN, que la realizada en pelo o tejido tal y como lo
menciona Nozawa et al (1999). Sin embargo, la colección de muestras de pelo no generó la
perdida de individuos y por el contrario, permitió incrementar el número de individuos
muestreados. Lo que nos indica que la mayor concentración de ADN está en la sangre que en
los folículos pilosos, por ese motivo se realizó la extracción de ADN de la sangre.
Para fines experimentales se tuvo que sacrificar al cuy (para la rápida extracción de
muestra), dado que la cantidad de sangre era pequeña, y su coagulación rápida.

Para un mejor análisis molecular de la Cavia porcellus, que parta desde la estandarización de
los procesos de colección de muestras de sangre, amplificación del ADN y visualización de
fragmentos de dicha molécula, se necesita usar las tarjetas FTA ofrecen varias ventajas para
los análisis de muestras de ADN extraído de la sangre del cuy, principalmente en cuanto a
facilidad de transporte y almacenamiento de las muestras. Los resultados obtenidos en
“Polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados (AFLP´s) a partir de muestras de
sangre almacenadas en tarjetas FTA para la especie Cavia porcellus Lin. (Rodentia: Caviidae)”
permiten recomendar la utilización de tres discos de FTA por individuo, para analizar el ADN
del cuy, ya que de este modo se obtiene un producto amplificado con la calidad necesaria
para visualizar fragmentos de ADN. Pero no se pudo obtener estas tarjetas para realizar el
análisis calidad.
Por motivos de falta de reactivos (como el de fenol-cloroformo) y equipos e instrumentos
(como las tarjetas FTA) para la extracción y análisis de ADN de la especie Cavia porcellus, el
cuy, no se pudo hacer un análisis adecuado, por lo que experimentalmente se logró observar
la extracción de ADN.

10.- BIBLIOGRAFIA:

http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/purelink_genomic_man.pdf
http://learn.genetics.utah.edu/es/units/activities/extraction/
http://www.joseacortes.com/practicas/extraccionADN.htm
http://www.jpimentel.com/ciencias_experimentales/pagwebciencias/pagweb/la_cie
ncia_a_tu_alcance_II/quimica/Experiencias_quimica_extraccion_de_adn.htm
http://www.bioapuntes.cl/laboratorio/extrac-adn.htm
http://www.slideshare.net/marcia_karina/extraccion-adn
https://prezi.com/gtfrscaw_cnb/prueba-de-tukey/
/prueba-de-tukey-para-experimentos.html