I.

Teknik Pengambilan Sampel Dalam Analisis Mikrobiologi

Dalam suatu analisis mikrobiologi, pengambilan sampel merupakan

salah satu kunci utama yang sangat mendukung keberhasilan suatu

analisa, yaitu memindahkan sampel atau kultur bakterial dari satu

tempat ke tempat yang lain secara aseptis (terhindar dari

kontaminasi).

Saat mengambil sampel harus benar-benar diperhatikan bahwa

pengambilan tersebut harus secara aseptis, yaitu aman dari

kontaminasi mikroba selain dari sampel tersebut. Biasanya beberapa

hal yang mungkin dapat menyebabkan kontaminasi saat pengambilan

sampel antara lain :

a. Peralatan yang tidak steril

b. Kontaminasi udara

c. Kesalahan analis

d. Kesalahan prosedur

e. Teknik pengambilan sampel terbagi menjadi dua teknik utama

yaitu :

f. Teknik pipetting

g. Inokulasi dengan jarum ose

TEKNIK PIPETTING

Teknik pipetting (mentransfer dengan pipet) sering digunakan

saat menganalisa sampel dengan kondisi standar. Keunggulan teknik ini

adalah kita dapat menghitung jumlah bakteri yang kita pindah tersebut

(opsianal, bila di inginkan) misalkan saat kita melakukan metode TPC

(menghitung jumlah koloni bakteri).

 Teknik pipetting dapat dilakukan dengan pengenceran ataupun

tanpa pengenceran. Untuk pipetting dengan pengenceran kita dapat

menggunakan pipet volume sedangkan pipetting tanpa pengenceran kita

dapat menggunakan micro volome pipettor.

Isolasi Sampel

Inokulasi dengan jarum ose

Teknik ini digunakan untuk memindahkan kultur bakterial dari

suatu media ke media lainnya.

Berbeda dengan teknik pipetting , pada teknik ini jumlah bakteri

sangatlah banyak sehingga kita tidak akan bisa menghitungnya. Namun,

beberapa tujuan utama dari teknik ini antaralain :

a. Perbanyakan (Enrichment)

Memperbanyak jumlah bakteri yang dimiliki dengan cara

menanam bekteri ke media-media baru sehingga dapat

memperbanyak stok jumlah bakteri yang ada. Media yang

digunakan dalam teknik ini adalah media yang sama.

b. Seleksi

Inokulasi dengan cara menanam bakteri pada media yang selektif

pada bakteri tertentu, teknik ini bertujuan agar bakteri yang

tumbuh adalah bakteri tersangka (target) sehingga dapat

diperoleh bakteri yang sesuai dengan yang diharapkan.

Sebagai contoh, misalkan kita dapat menggunakan media MCA

(MacConcey Agar) untuk menyeleksi pertunbuhan bakteri

Salmonella sp. saat menyeleksi dari bakteri patogen lainnya.

c. Isolasi
 Teknik inokulasi yang sering digunakan untuk metode ini adalah

teknik gores, yaitu menggoreskan biakan ke cawan petri secara

terus-menerus untuk diperoleh satu koloni yang tidak tercampur

dengan koloni lainnya.

d. Pemurnian Kultur Bakterial

Metode ini adalah teknik gabungan dari teknik-teknik diatas.

Cara pemurnian kultur dilakukan dengan menyeleksi kemudian

mengisolasi bakteri yang akan dimurnikan.

Metode ini harus dilakukan dengan cara menyeleksi dan

mengisolasi berulang kali dan dengan media yang berbeda-beda

agar dapat diperoleh kultur yang benar-benar tidak tercampur

dengan bakteri lain.

II. STERILISASI

Sterilisasi dalam mikrobiologi adalah suatu proses untuk

mematikan semua organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu

benda. Ketika untuk pertama kalinya melakukan pemindahan biakan

bakteri secara aseptik, sesungguhnya hal itu telah menggunakan salah

satu cara sterilisasi, yaitu pembakaran. Namun, kebanyakan peralatan

dan media yang umum dipakai di dalam pekerjaan mikrobiologi akan

menjadi rusak bila dibakar. Ada tiga cara utama yang umum dipakai

dalam sterilisasi yaitu penggunaan panas, bahan kimia, dan penyaringan

atau filtrasi

Sterilisasi yang baik dapat mencegah tumbuhnya mikroba lain

yang tidak diharapkan dalam bahan yang telah disterilisasi. Teknik

sterilisasi yang digunakan berbeda antara satu dengan lainnya,

tergantung dari jenis material yang digunakan. Alat-alat yang

digunakan dalam praktikum mikrobiologi juga harus dalam keadaan

steril atau bebas dari kuman serta bakteri, virus dan jamur. Dan untuk

mensterilkannya diperlukan pula pengetahuan tentang cara-cara dan

teknik sterilisasi. Hal ini dilakukan karena alat- alat yang digunakan

pada laboratorium mikrobiologi memiliki teknik sterilisasi yang

berbeda

Steril merupakan syarat mutlak keberhasilan kerja dalam

laboratorium mikrobiologi. Dalam melakukan sterilisasi, diperlukan

teknik-teknik agar sterilisasi dapat dilakukan secara sempurna, dalam

arti tidak ada mikroorganisme lain yang mengkontaminasi media. Ada

beberapa teknik sterilisasi, yaitu dengan cara

fisikdengan panas, mekanik dengan filtrasi dan kimia dengan senyawa-

senyawa kimia. Pembersihan benda-benda atau permukaan tubuh akan

mengurangi jumlah mikroba sehingga memperkecil kemungkinan

terjadinya infeksi. Misalnya cuci tangan dengan sabun dan bilas dengan

air mengalir sebelum mengoperasikan

Pada pengerjaan mikrobiologi, diperlukan suatu kondisi yang

benar-benar aseptik dimana alat penunjang serta nutrient dan substrat

harus benar-benar steril. Hal ini berarti mikroba kontaminan harus

dimatikan. Sterilisasi dilakukan pada suhu 121oC selama 30 menit, yaitu

agar spora atau mikroba dapat dimatikan. Spora adalah sel istirahat

yang resisitan terhadap panas dan lingkungan yang berfungsi sebagai

tunas untuk berkembang biak selanjutnya. Udara tekan yang digunakan

juga harus dalam kondisi steril. Substrat yang berisi nutrien tidak peka

terhadap suhu, maka sterilisasi media substrat dilakukan pada 138oC

selama 5 menit. Pada substrat yang berisi nutrien tetapi peka terhadap

suhu, maka sterilisasi media substrat dilakukan dengan penyaringan

bertekanan melalui saringan milipore diameter 0,22 µm

Beberapa faktor-faktor yang mempengaruhi sterilisasi ini

termasuk kelembaban, konsentrasi gas, suhu dan distribusi gas dalam

chamber pengesterilan. Penghancuran bakteri tergantung pada adanya

kelembaban, gas dan suhu dalam bahan pengemas, penetrasi melalui

bahan pengemas, pada pengemas pertama atau kedua, harus dilakukan,

persyaratan desain khusus pada bahan pengemas

sterilisasi alat-alat laboratorium hanya digunakan dua metode

sterilisasi yaitu :
a. Sterilisasi basah

Sterilisasi basah adalah metode sterilisasi dengan uap air

bertekanan. Alat yang digunakan ketika sterilisasi dengan

metode ini menggunakan autoklaf manual dan autoklaf elektrik.

Prinsip kerja dari alat ini cukup sederhana.

1. Autoklaf diisi dengan air secukupnya dan semua alat-alat yang

akan disterilkan seperti tabung reaksi, spoid, labu erlemeyer,

ose, dimasukkan kedalamnya.

2. Sebelum ditutup, semua alat perlu disusun dengan baik untuk

menghindari alat-alat gelas pecah sewaktu proses sterilisasi

berlangsung yang disebabkan oleh tekanan dari uap air.

3. Proses berikutnya adalah menutup autoklaf dengan memutar

setiap sekrup dari arah berlawanan dengan kuat hingga tidak

terdapat lagi celah untuk keluarnya uap air yang dihasilkan saat

pemanasan berlangsung.

4. Langkah terakhir adalah memanaskan autoklaf tersebut dengan

nyala api hingga menghasilkan uap air jenuh bertekanan pada

suhu 121oC selama 15 menit.

5. Setelah selesai autoklaf didiamkan terlebih dahulu beberapa

menit. Apabila autoklaf telah dingin, sekrup dan baut pengunci

dapat dibuka dan semua alat-alat yang sudah steril dapat

dikeluarkan satu persatu.

6. Adapun untuk sterilisasi menggunakan autoklaf elektrik terlebih

dahulu air dengan takaran yang telah ditentukan dimasukkan

kedalamnya kemudian alat-alat yang akan disterilkan seperti labu

 Erlemeyer dan gelas ukur. Suhu, tekanan, dan waktu yang

dibutuhkan diseting sesuai kebutuhan.

7. Biasanya proses sterilisasi menggunakan autoklaf elektrik

berlangsung sekitar 15 menit dengan suhu 121 0C.

8. Sterilisasi basah dapat digunakan untuk mensterilkan bahan apa

saja yang dapat ditembus uap air dan tidak rusak bila dipanaskan

dengan suhu yang berkisar antara 110 oC dan 121 oC.

b. Sterilisasi kering

Sterilisasi kering merupakan sterilisasi dengan udara panas. Alat

yang digunakan adalah oven. Cara ini umum dilakukan untuk

mensterilkan peralatan gelas seperti cawan petri, tabung reaksi, dan

alat-alat gelas lainnya.

Prinsip kerja dari alat ini lebih sederhana yaitu pintu oven dibuka

dan semua alat-alat yang akan disterilkan disusun rapi. Setelah itu

pintu oven ditutup, suhu diseting pada angka 160-180oC selama 1-2

jam. Keuntungan dari pemanasan kering adalah tidak adanya uap air

yang membasahi bahan atau alat yang disterilkan.

III. IDENTIFIKASI BAKTERI DAN PENGECATAN

a. PEMBUATAN PREPARAT BAKTERI, JAMUR

Tujuan dilakukannya praktikum pembuatan Preparat yaitu nantinya

diharapkan agar kita nantinya dapat membuat preparat dari kultur cair

dan Mengerti teknik pewarnaan

Dalam pembuatan preparat alat dan bahan yang digunakan yaitu

mikroskop, objek glass, kawat ose, Bunsen, pipet tetes, koloni mikroba,

agar miring, alcohol 95%, larutan Kristal violet, fuchsin basa, larutan

lugol.

Proses pembuatan preparat bakteri yaitu:

1. kawat ose dipijarkan diatas api Bunsen.

2. Setelah itu diambil koloni bakteri pada agar miring PCA (Plate

Count Agar) lalu taruh koloni bakteri tersebut diatas objek

glass.

3. Penempatan koloni bakteri tersebut tidak boleh terlalu tebal

karena untuk memudahkan pengamatan.

4. Setelah itu ditambahkan fuchsin basa dan Kristal violet pada

kaca preparat dan didiamkan selama 1 menit, lalu difiksasi

dimana fungsi fiksasi yaitu melekatkan mikroba pada objek

glass, memperjelas pengamatan dibawah mikroskop dan

membunuh mikroba.

5. Setelah itu diamati di bawah mikroskop dan digambar

Membuat Preparat Awetan Jamur

Cara membuat biakan murni jamur (lakukan perkelompok masing-masing

5 orang).
 1. Dicuci bersih tangan praktikan menggunakan sabun dan

dibersihkan hingga kering.

2. Dicuci kembali tangan menggunakan alcohol

3. Dicuci bersih jarum ose, cover glass, dan objek glass kemudian

dikeringkan dengan menggunakan tisu.

4. Dipanaskan jarum ose diatas api Bunsen.

5. Diambil jamur pada roti menggunakan jarum ose yang telah

dipanaskan diatas api Bunsen.

6. Diletakan jamur pada roti diatas objek glass.

7. Ditetesi 1 tetes aquadest pada objek glass.

8. Diletakan cover glass diatas objek glass.

9. Diletakan diatas mikroskop.

10. Diamati menggunakan mikroskop.

PEWARNAAN BAKTERI

Pewarnaan pada bakteri di bagi menjadi tiga, yaitu :

1. Pewarnaan sederhana

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling

banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan

satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut.

Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan

sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dan

basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana

umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat

mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa

yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen

biru, kristal violet dan karbol fuchsin

a. Pewarnaan Asam

merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna

dengan tujuan untuk hanya untuk melihat bentuk sel. adapun

zat warna yang di pakai dalam pewarnaan positif adalah biru

metilen, dan air furksin. Cara kerja untuk melakukan pewarnaan

bakteri yaitu sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan

bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan

menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika

suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan

saat mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan

untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada

object glass tanpa merusak struktur selnya.

b. Pewarnaan Basa Pewarnaan basa atau negatif merupakan

metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai

latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini

mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik

ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada

pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau

perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka

terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang

sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat.

Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. Cara

kerja pewarnaan negatif, yaitu ambil dua object glass,

 teteskan nigrosin atau tinta cina di ujung kanan salah satu

object glass. biakan diambil lalu diulaskan atau diteteskan

dalam tetesan nigrosin tadi, lalu dicampurkan Tempelkan sisi

object glass yang lain kemudian gesekkan ke samping kiri

Biarkan preparat mengering di udara, jangan difiksasi atau

dipanaskan di atas api.

2. Pewarnaan Diferensial (Gram)

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris

untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar,

yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan

fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan

penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938)

yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk

membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella

pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak

mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan

Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil

ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-

negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal

(counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat

semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah

muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe

bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen.

Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini,

yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini

berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen

pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna

ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan

pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar

tergantung pada komposisi dinding sel, bilakomponen dinding sel

kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan

bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka

warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding,

bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat,

yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar. Jadi bahan zat

warna yang di pakai dalam pewarnaan gram, yaitu kristal violet,

larutan iodin, alkohol 90 %, dan larutan safranin. Sifat bakteri

terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk

membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat

yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram

negatif.

Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu :

a. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna

ungu.

b. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan

JKJ.

c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

 Hasil:

- Bakteri Gram negatif

Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang tidak

mempertahankan zat warna metil ungu pada metode

pewarnaan Gram.

- Bakteri gram-positif akan mempertahankan warna ungu

gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri

gram-negatif tidak.

Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal

(counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat

semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau

merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan

kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding

sel mereka. Banyak spesies bakteri gram-negatif yang bersifat

patogen, yang berarti mereka berbahaya bagi organisme inang.

Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu

pada dinding sel gram-negatif, terutama lapisan lipopolisakarida

(dikenal juga dengan LPS atau endotoksin).