Detection of Aberrant DNA Methylation Patterns in the RB1 Gene

1. Primer untuk PCR bisulfit dirancang berdasarkan DNA genom setelah konversi bisulfit.
Orang dapat memutuskan untai DNA mana akan dikonversi baik akal atau antisense, oleh
karena itu orang memiliki 4 kemungkinan dalam merancang primer untuk PCR bisulfit.
Untuk menghasilkan urutan DNA setelah konversi bisulfit, bisa digunakan perangkat
lunak online berikut: http: //biq-analyzer.bioinf.mpi-
inf.mpg.de/tools/BiConverter/index.php

2. Perangkat lunak online yang dapat digunakan untuk mendesain primer metilasi bisulfit
PCR: MethPrimer dan MethylPrimer Express.

3. Untuk bisulfite Pyrosequencing®, disarankan untuk PCR menggunakan satu primer

dengan ekor (baik primer maju atau mundur) dan primer biotinilasi universal tambahan.
Urutannya untuk tail primer adalah GGGACACCGCTGATCGTTTA diikuti dengan
urutan maju atau mundur primer. Itu urutan untuk primer biotinilasi universal adalah
GGGACACCGCTGATCGTTTA.

4. Kemungkinan untuk mengontrol kelengkapan pengobatan bisulfit adalah keuntungan

besar dari metilasi berbasis Pyrosequencing® analisis dibandingkan dengan semua
metode berbasis PCR, seperti metilasi PCR (MSP) khusus atau qMSP.

5. Kit dari pemasok lain juga diharapkan berkinerja baik. Namun, kami tidak melakukan
perbandingan komprehensif di baru-baru ini.

6. Meskipun rekomendasi dari EZ DNA Methylation ™. Manual kit adalah untuk mengelusi
akhirnya DNA dikonversi bisulfit menjadi 10 μL, kita biasanya mengelusi dalam 40 μL
sehingga per reaksi PCR, sekitar 25 ng DNA yang dikonversi bisulfit dapat digunakan.
DNA Polimerase dari vendor lain juga diharapkan berkinerja baik.

7. Kami memiliki pengalaman selama bertahun-tahun dengan PlatiniumTaq®. DNA

polimerase dan dapat merekomendasikan enzim ini. Namun, kami tidak melakukan
perbandingan komprehensif yang berbeda polimerase dari vendor yang berbeda. Karena
itu, Taq lainnya Polimerase juga bisa bekerja.

8. Langkah ekstensi akhir benar-benar meningkatkan kinerja hasil pyrosequencing.

9. Jika Anda memasukkan ujung filter dari alat penyedot terlalu dini ke dalam piring
pyrosequencinging dengan buffer anil dan pyrosequencing primer ("terlalu dini" berarti:
ketika masih ada beberapa negative tekanan), campuran reaksi akan dihisap dan
dihilangkandengan demikian hilang tanpa dapat dikembalikan.
10. Jarum melalui mana enzim, substrat, dan nukleotida yang dikeluarkan sangat sempit,
bahkan sangat kecil potongan debu dapat menyebabkan penyumbatan total. Karena itu
sangat penting untuk pipet adalah solusi "bersih" tanpa partikel yang tersisa.