Anda di halaman 1dari 13

LAPORAN PRAKTIKUM FARMAKOLOGI TOKSIKOLOGI II

PERCOBAAN VIII
PENGUJIAN SITOTOKSIK DENGAN METODE BRINE SHRIMP
LETHALITY (BSLT)

Disusun oleh:
Kelompok 6 E
Gheavanya Azhari Tamim 10060316202
Risa Apriani Hilyah 10060316203
Miranda Dwi Putri 10060316204
Diah Rohaeni 10060316208
Dwina Syafira Arzi 10060316210

Asisten : Dina Rosdiana Sari, S.Farm.


Tanggal praktikum : Selasa, 12 Maret 2019
Tanggal pengumpulan : Selasa, 19 Maret 2019

LABORATORIUM FARMASI TERPADU UNIT D


PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS ISLAM BANDUNG
1440H / 2019 M
PERCOBAAN VIII
PENGUJIAN SITOTOKSIK DENGAN METODE BRINE SHRIMP
LETHALITY (BSLT)

I. Tujuan Percobaan
1. Memahami cara pengujian efek sitotoksik suatu zat dengan metode BSLT.
2. Melatih keterampilan dalam perhitungan LC50 24 jam (konsentrasi yang
dibutuhkan untuk menimbulkan kematian larva udang sejumlah 50% stelah
masa inkubasi 24 jam).

II. Teori Dasar


Toksisitas dari suatu senyawa secara umum dapat diartikan kepada potensi
dari suatu senyawa kimia untuk dapat menyebabkan kerusakan ketika senyawa
tersebut mengenai atau masuk kedalam tubuh manusia. Suatu senyawa kimia
dikatakan bersifat racun akut jika senyawa tersebut dapat menimbulkan efek racun
dalam jangka waktu yang singkat, dan bersifat kronis jika senyawa tersebut dapat
menimbulkan efek racun dalam jangka waktu yang panjang karena kontak yang
berulang-ulang walaupun dalam jumlah yang sedikit (Raymond, 2007).
Uji toksisitas dimaksudkan untuk memaparkan adanya efek toksik dan atau
menilai bataskeamanan dalam kaitannya dengan penggunaan suatu senyawa.
Pengukuran toksisitas dapatditentukan secara kuantitatif yang menyatakan tingkat
keamanan dan tingkat berbahaya zattersebut (Cassaret dan Doulls, 1975).
Larva udang digunakan untuk praskrining terhadap senyawa-senyawa yang
diduga berkhasiat sebagai antitumor. Dengan kata lain, uji ini mempunyai korelasi
yang positif dengan potensinya sebagai antikanker (Anderson, 1991). Artemia
salina Leach merupakan komponen dari invertebrata dari fauna pada ekosistem
perairan laut. Udang renik ini mempunyai peranan yang penting dalam aliran energi
dan rantai makanan. Spesies invertebrata ini umumnya digunakan sebagai
organisme sentinel sejati berdasarkan pada penyebaran, fasilitas sampling, dan
luasnya karakteristik ekologi dan sensifitasnya terhadap bahankimia (Calleja M.C,
Persoone G, 1992).
(BSLT) merupakan salah satumetode skrining untuk menentukan
ketoksikan suatu ekstrak ataupun senyawa. Kematian Artemia salina Leach
digunakan sebagai parameter untuk menunjukkan adanya kandungan zat
aktif tanaman yang bersifat sitotoksik (Oberlies, et.al., 1998).
Apabila harga LC50 _ 1000 g/mL ekstrak tersebut dapat dikatakan toksik.
Bila kematian sebagai responnya, maka dosis penimbul kematian pada
50% populasi dengan spesies yang sama dalam waktu spesifik dan kondisi
percobaan sesuai diistilahkan sebagai median lethal dose atau LD50. Obat yang
diberikan sebagai konsentrasi diistilahkan sebagai Median Lethal Concetration atau
LC50 (Cassaret dan Doulls, 1975).
Tingkat toksisitas dari ekstrak tanaman dapat ditentukan denganmelihat
harga LC50-nya. Apabila harga LC50 lebih kecil dari 1000 g/ml dikatakan
toksik,sebaliknya apabila harga LC50 lebih besar dari 1000 g/ml dikatakan tidak
toksik. Tingkat toksisitas tersebut akan memberi makna terhadap potensi
aktivitasnya sebagai antitumor. Semakin kecil harga LC50 semakin toksik suatu
senyawa (Meyer et al, 1982).
Obat antikanker yang memenuhi kriteria masih sangat sedikit karena harus
memiliki toksisitas selektif, yaitu dapat merusak sel kanker tanpa mengganggu sel
normal sehingga tidak ada efek samping yang ditimbulkan (Meiyanto et al. 2006).
Tumbuhan jambu biji (Psidium guajava) merupakan salah satu contoh tanaman
yang banyak dimanfaatkan sebagai antikanker. Hasil dari pengujian aktivitas
antikanker dari daun jambu biji ini menunjukkan bahwa daun jambu sangat
berpotensi sebagai obat antikanker karena dapat mencegah ataupun menghambat
pertumbuhan sel kanker. Kandungan metabolit sekunder dari daun jambu biji
diantara yaitu flavonoid, alkaloid, terpenoid, dan tannin. Senyawa tersebut diduga
menimiliki aktivitas antikanker (Rishika & Sharma 2012).
III. Alat dan Bahan
No Alat Bahan
1 Inkubator Air suling
2 Pipet tetes Ekstrak daun jambu biji
3 Pipet volume Garam
Telur udang laut ( Aertemia salina
4 Spektrofotometer UV-VIS
Leach)
5 Vial

IV. Prosedur
4.1. Uji Toksisitas dengan Metode BSLT
Metode Meyer et al. digunakan untuk memepelajari toksisitas sampel secara
umum dengan menggunakan telur udang (Artemia salina Leach).
4.2. Penetasan Artemia salina Leach
Telur udang dimasukan ke dalam wadah bening yang telah diisi air suling
berkadar garam 15 g/L. pada media digunakan aerator untuk memperoleh oksigen
melalui proses sirkulasi air. Dalam waktu 16 jam sebagian telur sudah menetas
menjadi larva. Dalam waktu 48 jam setelah telur dimasukan ke dalam media, larva
yang berenang bebas digunakan untuk uji toksisitas.
4.3. Persiapan Sediaan uji
Ekstrak daun jambu biji yang akan diuji dilarutkan dalam air steril berlkadar
garam 15 g/L. larutan uji dibuat dalam konsentrasi 1000, 100, 10 ppm. Bila sampel
tidak larut maka ditambahkan 2 tetes DMSO.
4.4. Prosedur Uji Toksisitas dengan Metode BSLT
Sebanyak 3 mL larutan uji ditambahkan 10 ekor larva udang, kemudian
dimasukkan ke dalam vial menggunakan pipet yang telah ditambahkan air garam
sampai 5 mL. Larutan diaduk sampai homongen, untuk kontrol dilakukan hal yang
sama namun tanpa penambahan larutan uji. Untuk setiap konsentrasi dilakukan 2
kali pengulangan (duplo). Larutan dibiarkan selama 24 jam, kemudian dihitung
jumlah larva yang mati dan yang masih hidup dari tiap vial.
Larva dinyatakan mati setelah beberapa detik pengamatan tidak
memeperlihatkan pergerakan sama sekali. Kemudian ditentukan nilai LC50 (Lethal
concentration 50%) dengan cara menghintung angka mati dan angka hidup. Angka
mati dihitung dengan menjumlahkan larva yang mati dalam setiap konsentrasi (2
vial). Dan angka hidup dihitung dengan menjumlahkan larva yang hidup dalam
setiap konsentrasi (2 vial).
Perhitungan akumulasi mati tiap konsentrasi dilakukan dengan cara berikut:
akumulasi mati untuk konsntrasi 10 ppm = angka mati pada konsentrasi tersebut, :
akumulasi mati untuk konsntrasi 100 ppm = angka mati pada konsentrasi 10 ppm
ditambah angka mati pada konsentrasi 100 ppm, akumulasi mati untuk konsntrasi
1000 ppm = angka mati pada konsentrasi 10 ppm ditambah angka mati pada
konsentrasi 100 ppm, ditambah angka mati pada konsentrasi 1000 ppm.
Perhitungan akumulasi hidup tiap konsentrasi dilakukan dengan cara
berikut: akumulasi mati untuk konsntrasi 10000 ppm = angka mati pada konsentrasi
tersebut, : akumulasi mati untuk konsntrasi 100 ppm = angka mati pada konsentrasi
10000 ppm ditambah angka mati pada konsentrasi 100 ppm, akumulasi mati untuk
konsntrasi 10 ppm = angka mati pada konsentrasi 1000 ppm ditambah angka mati
pada konsentrasi 100 ppm, ditambah angka mati pada konsentrasi 10 ppm.
Selanjutnya dihitung molatitas dengan cara: akumulasi mati dibagi jumlah
akumulasi hidup dan mati (total) dikali 100%. Grafik dibuat dengan log konsentrasi
sebagai sumbu x terhadap mortalitas sebagai sumbu y. Nilai LC50 merupakan
konsentrasi dimana zat yang menyebabkan kematian 50% yang diperoleh dengan
memakai persamaan regresi linier y= bx+a. suatu zat dikatakan aktif atau toksik
bila nilai LC50 <1000 ppm untuk ekstrak dan <30 ppm untuk suatu senyawa.
V. Data Pengamatan dan Perhitungan
5.1. Data pengamatan
Konsentrasi Julah Larva Akumulasi Mortalitas
(ppm) Awal Mati Hidup Mati Hidup (%)
NaCl
0 10 8 2 - - -
fisiologis

Ekstrak 10 20 20 0 20 0 100
daun 100 20 20 0 40 0 100
jambu
biji 1000 20 20 0 60 0 100

5.2. Perhitungan
5.2.1. Perhitungan Larutan Uji
Konsentrasi ekstrak dibuat 1000 ppm/ mL  1 ppm = 1 mg/L
 1000 ppm/mL  50 mL
50000/1000 = 50 mg
V1 x N1 = V2 x N2
50 mL x 1000 ppm = 1000 x N2
N2 = 50 ppm
 100 ppm
V1 x N1 = V2 x N2
V1 x 1000 ppm = 50 mL x 100 ppm
V1 = 5 mL
 10 ppm
V1 x N1 = V2 x N2
V1 x 1000 ppm = 50 mL x 10 ppm
V1 = 0,5 mL
5.2.2. Akumulasi Mati dan Akumulasi Hidup
Akumulasi mati konsentrasi 10 ppm = 20
Akumulasi mati konsentrasi 100 ppm = 20 +20 = 40
Akumulasi mati konsentrasi 1000 ppm = 20 + 20 + 20 = 60
Akumulasi hidup konsentrasi 1000 ppm = 0
Akumulasi hidup konsentrasi 100 ppm = 0 +0 = 0
Akumulasi hidup konsentrasi 10 ppm =0+0+0=0
5.2.3. Mortalitas
𝒂𝒌𝒖𝒎𝒖𝒍𝒂𝒔𝒊 𝒎𝒂𝒕𝒊
Mortalitas = 𝒂𝒌𝒖𝒎𝒖𝒍𝒂𝒔𝒊 𝒎𝒂𝒕𝒊 { 𝒂𝒌𝒖𝒎𝒖𝒍𝒂𝒔𝒊 𝒉𝒊𝒅𝒖𝒑 𝒙 𝟏𝟎𝟎%
20
Mortalitas 10 ppm = 20+0 𝑥 100% = 100%
40
Mortalitas 100 ppm = 40+0 𝑥 100% = 100%
60
Mortalitas 1000 ppm = 60+0 𝑥 100% = 100%

5.2.4. Nilai LC50 (Lethal concentration 50%)


Tabel 5.2. Kurva Kalibrasi
Log Konsentrasi (ppm) Mortalitas (%)
1 100
2 100
3 100
Persamaan regresi linier
a = 100
y = bx +a
b=0
y = 0x + 100
r=
maka LC50  y = bx +a
50 = 0x + 100
50-100 = 0x
50 = 0x
50
x = ppm
0

Nilai LC50 atau konsentarasi ekstrak daun jambu biji menyebabkan kematian
50
50% larva udang laut ( Artemia salina Leach) adalah sebesar ppm.
0
VI. Pembahasan
Pada percobaan ini dilakukam pengujian sitotoksik dengan metode Brine
Shrimp Lethality Test (BSLT). Percobaan ini bertujuan untuk mengetahui efek
toksik dari ekstrak daun jambu biji menggunakan hewan coba berupa larva udang.
Toksisitas ditentukan dengan melihat harga LC50 yang dihitung berdasarkan
analisis probit. Ekstrak ditentukan dengan melihat LC50-nya lebih kecil atau sama
dengan 1000 µg/ml (LC50< 1000 µg/ml) (Harmita dan Maksum, 2008).
Salah satu metode yang digunakan untuk menguji senyawa yang memiliki
bioaktivitas sebagai antikanker dari senyawa yang diisolasi adalah Brine Shrimp
Lethality Test (BSLT), dimana tujuan dari penggunaan metode ini adalah sebagai
uji pendahuluan yang dapat mendukung penemuan senyawa-senyawa antikanker.
Uji ini mengamati mortalitas larva udang yang di sebabkan oleh senyawa uji.
Senyawa yang aktif akan menghasilkan mortalitas yang tinggi. Uji toksisitas
dengan metode BSLT ini memiliki spectrum aktifitas farmakologi yang luas,
prosedurnya sederhana, cepat dan tidak membutuhkan biaya yang besar, serta
hasilnya dapat di percaya. Disamping itu metode ini sering dikaitkan dengan
metode penapiasan senyawa antikanker. Dengan alasan-alasan tersebut, maka uji
ini sangat tepat digunakan. Senyawa yang diduga memiliki aktivitas anti kanker,
harus diujikan terlebih dahulu pada hewan percobaan. Metode ini merupakan salah
satu metode yang banyak digunakan untuk pencarian senyawa anti kanker baru
yang berasal dari tanaman.
Hewan uji yang digunakan adalah larva udang jenis Artemia salina L.
Proses pembenihan telur udang dilakukan dalam media air laut. Hal ini dilakukan
sebagai simulasi dari habitat asli larva udang yaitu air laut. Alasan digunakannya
larva udang dalam percobaan ini adalah karena larva udang merupakan general
biossay sehingga semua zat dapat menembus masuk melalui dinding sel larva
tersebut. Penggunaan Artemia salina Leach dalam uji sitotoksis dengan metoda
BSLT ini mempunyai beberapa keuntungan, antara lain telur mudah didapat,
murah, mudah disimpan dalam selang beberapa tahun ditempat yang kering dan
tidak memerlukan kondisi aseptis yang khusus,serta memeliki sensitifitas yang
lebih tinggi terhadap senyawa toksik bila dibanding orgisme laut lainnya.
Daya toksisitas suatu senyawa dapat diketahui dengan menghitung jumlah
kematian larva Artemia salina dengan parameter Lethal Concentration 50 (LC50).
Suatu ekstrak dinyatakan bersifat toksik menurut metode BST ini jika memiliki
LC50 kurang dari 1000 µg/ml. Cara yang dilakukan yaitu dengan menghitung semua
hewan yang hidup dan hewan yang mati. Kemudian menghitung Rasio kematian
dengan membagi jumlah hewan yang mati dengan hewan yang hidup. Yang terakhir
adalah menentukan persen kematian dengan cara rasio kematian dikali 100.
Kematian larva dapat diamati setelah 24 jam, jumlah larva yang mati dalam masing-
masing vial dapat digunakan untuk menghitung LC50. Suatu senyawa dikatakan
aktif jika memiliki LC50 < 1000 ppm.
Kemudian digunakan ektrak daun jambu biji yang dilakukan dengan
konsentrasi yang berbeda yaitu konsentrasi 10, 100, dan 1000 µg/ml untuk
membandingkan toksisitas dan efek toksik yang ditimbulkan masing-masing
konsentrasi tersebut. Juga untuk melihat pada konsentrasi berapakah larva udang
mengalami LC50. Air laut sebagai kontrol dimaksudkan untuk melihat apakah
respon kematian dari sampel dan bukan dari laut.
Digunakan ekstrak daun jambu biji sebagai pengujian sitotoksik antikanker
karena menurut hasil idenfitikasi golongan kimia ekstrak etanol 70% daun jambu
biji mengandung beberapa senyawa yang berkhasiat seperti alkaloid, flavonoid,
tanin, dan triterpenoid. Senyawa fitokimia yang memberikan efek toksik yaitu
flavonoid, karena adanya flavonoid dalam sel akan menyebabkan gugus –OH pada
flavonoid berikatan dengan protein integral dalam membran sel, hal ini
menyebabkan terhalangnya transport aktif Na+ - K+. Transport aktif yang berhenti
menyebabkan pemasukan ion Na+ yang tidak terkendali di dalam sel, pecahnya
membran sel inilah yang menyebabkan kematian sel (Scheuer, 1994).
Alkaloid, triterpenoid, dan flavonoid pada kadar tertentu memiliki potensi
toksisitas akut serta dapat menyebabkan kematian larva Artemia salina L.
Mekanisme kematian larva berhubungan dengan fungsi senyawa alkaloid,
triterpenoid, dan flavonoid dalam daun jambu biji yang dapat menghambat daya
makan larva. Cara kerja senywa-senyawa tersebut adalah dengan bertindak sebagai
stomach poisoning atau racun perut. Oleh karena itu, bila senyawa senyawa ini
masuk ke dalam tubuh larva, alat pencernaannya akan terganggu. Selain itu,
senyawa ini menghambat reseptor perasa pada daerah mulut larva. Hal ini
mengakibatkan larva gagal mendapatkan stimulus rasa sehingga tidak mampu
mengenali makanannya sehingga larva mati kelaparan.
Mekanisme kerja golongan terpenoid dengan cara memblok siklus sel pada
fase M (mitosis atau pembelahan sel) dengan menstabilkan benang-benang spindel.
Benang-benang Spindel (tubulin) berfungsi untuk mempertahankan bentuk sel dan
mengatur pergerakan kromosom dalam pembelahan sel serta pergerakan organel,
sehingga ketika sel kanker berinteraksi dengan senyawa terpenoid akan
menyebabkan tahapan mitosis terhambat yang selanjutnya akan terjadi
penghambatan proliferasi sel (perkembangan sel) dan memicu terjadinya apoptosis
(kematian sel). Senyawa terpenoid juga menghambat enzim topoisomerase pada sel
mamalia (Setiawati, dkk., 2010). Senyawa tanin secara garis besar mekanisme yang
diperkirakan adalah toksisitas tanin dapat merusak membran sel bakteri dan
pembentukan suatu komplek ikatan tanin terhadap ion logam yang dapat menambah
toksisitas tanin itu sendiri (Ajizah, 2010).
Dilakukan perlakuan yang sama untuk semua konsentrasi yang telah dibuat.
Dimasukkan 10 larva udang kedalamnya. Proses pengambilan larva udang
dilakukan harus dengan cermat. Hal ini dikarenakan ukuran larva udang yang
sangat kecil sehingga diperlukan kehati-hatian dalam proses pemindahannya. Masa
inkubasi dilakukan selama 24 jam untuk melihat respon dari larva udang terhadap
masing-masing konsentrasi.
LC50 adalah konsentrasi dari suatu senyawa kimia di udara atau dalam air
yang dapat menyebabkan 50% kematian pada suatu populasi hewan uji atau
makhluk hidup tertentu. Penggunaan LC50 dimaksudkan untuk pengujian
ketoksikan dengan perlakuan terhadap hewan uji secara berkelompok yaitu pada
saat hewan uji dipaparkan suatu bahan kimia melalui udara maka hewan uji tersebut
akan menghirupnya atau percobaan toksisitas dengan media air. Nilai LC50 dapat
digunakan untuk menentukan tingkat efek toksik suatu senyawa sehingga dapat
juga untuk memprediksi potensinya sebagai antikanker.
Hasil pengamatan selama 24 jam perlakuan menunjukkan semua hewan
coba mati dan tidak ada yang bertahan hidup, untuk larva udang pada konsentrasi
10–1000 ppm mampu membunuh semua larva udang sehingga LC50 ekstak daun
50
jambu adalah sebesar ppm. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak daun jambu biji
0

tidak dapat ditentukan toksisitasnya karena nilai LC50 tidak terdefinisi. Hal ini
karena pada kontrol (larva udang dalam NaCl fisiologis) saja terdapat kematian
seharusnya pada kontrol tidak menyebabkan kematian udang. Sehingga larva udang
yang mati pada larutan uji bukan karena pengaruh senyawa yang terkandung dalam
ekstrak jambu biji melainkan bias dari adanya faktor lingkungan.
Faktor yang mempengaruhi hasil yang didapatkan pada praktikum ini dapat
disebabkan oleh beberapa hal, seperti konsentrasi/kadar garam dalam larutan air
yang digunakan sebagai pengganti air laut tempat hidup larva tidak sesuai hingga
menyebabkan banyak larva yang dijadikan blanko mati. Selain itu faktor dari larva
itu sendiri yang mungkin masih terlalu lemah atau karena kesalahan dari praktikan
yang mengambil larva tersebut tidak hati-hati juga dapat menyebabkan larva pada
blanko tidak dapat betahan hidup hingga pada saat pengamatan. Proses pembuatan
ekstrak yang digunakan juga dapat menyebabkan karena pemisahan ekstrak dengan
pelarut yang digunakan saat proses pengekstrakan dari simplisia yang tidak baik
dapat menyebabkan ekstrak masih mengandung pelarut-pelarut organik yang dapat
membunuh dari larva udang pada sample uji.
Kesimpulan
Dari hasil percobaan yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa ektrak jambu
biji tidak dapat ditentukan toksisitasnya ditunjukan dengan LC50 atau konsentrasi
untuk mematikan 50% larva udang (Artemia salina L.) ekstak biji jambu biji
50
sebesar ppm (tidak terdefinisi) dan % kematian pada seluruh konsentrasi (10,
0

100, 1000 ppm) memcapai 100%. Hasil yang diperoleh tidak dapat ditentukan
memenuhi persyaratan metode BSLT yang mengatakan zat dapat dianggap sebagai
suatu senyawa aktif atau toksik jika nilai LC50 untuk ekstrak < 1000 ppm.
Daftar Pustaka
Anderson, J. E., Goetz C.M., Mc Laughlin J.L. (1991). A Blind comparison of
Simple Bench-top Bioassay and Human Tumor Cell Cytotoxicities as
Antitumor Prescrenss, Natural Product Chemistry, Elseiver, Amsterdam.
Calleja, M.C. and Persoone, G. (1992) The Potential of Ecotoxicological Tests for
the Prediction of Acute Toxicityin Man as Evaluated on the 1st , Chemicals
on the Meic Program, ATLA-Alternatives to Laboratory Animals.
Casarett, L,J, and J, Doull, (1975), Toxycology The Basic Science of Poisons, Mac
Milla, New York.
Harmita dan Maksum, 2008, Buku Ajar Analisis Hayati Edisi III, Penerbit Buku
Kedokteran EGC, Jakarta.
Meiyanto E, Supardjan, Muhammad Da’I, Dewi A. (2006). Efek antiproliferatif
Pentagamavunon-0 terhadap sel kanker payudara T47D, J Ked Yarsi.
Meyer, B,N,N,R, Ferrigni M,L, (1982), Brine Shrimp, a convinient general
bioassay for active plant constituents, J of Plant Medical Research.
Oberlies, N.H., (1998), Cytotoxic and Insecticidal Constituents of the Unripe Fruit
of Persea Americana, J. Nat. Prod, New York.
Raymond W R. 2007. Chytotocsic Cancer Biology 4 Edition, Oxford University Pr,
Michigan (US).
Rishika D, Sharma R. (2012). An update of pharmacological activity of Psidium
guajava in the management of various disorder, Int J Pharm Sci Res.