Pengaruh Variasi Konsentrasi Enzim dan Substrat Terhadap

Sakarifikasi Limbah Pengolahan Kertas Menggunakan

Enzim Selulase dari Bacillus sp. BPPT CC RK2

Skripsi

Diajukan untuk memenuhi syarat gelar sarjana farmasi (S.Far)

AAM AMELIA
NIM : 108102000061

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
1433 H/ 2012
 1

LEMBAR PERNYATAAN

DENGAN INI SAYA MENYATAKAN BAHWA SKRIPSI INI BENAR -

BENAR KARYA SENDIRI DAN BELUM PERNAH DIAJUKAN SEBAGAI

SKRIPSI ATAU KARYA ILMIAH PADA PERGURUAN TINGGI ATAU

PADA LEMBAGA MANAPUN.

Jakarta, 25 November 2012

Aam Amelia
 2

KATA PENGANTAR

Puji syukur kepada Allah Azza wa Jalla, yang oleh karena pertolongan
dan kasih sayang-Nya penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi ini. Makalah
skripsi yang berjudul ―Pengaruh Variasi Konsentrasi Enzim dan Substrat
Terhadap Sakarifikasi Limbah Pengolahan Kertas Menggunakan Enzim Selulase
dari Bacillus sp. BPPT CC RK2” dibuat untuk memenuhi tugas mata kuliah
Skripsi, salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Farmasi Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Pada penulisan ini, penulis juga ingin mengucapkan penghargaan dan

terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:

(1) Ofa Suzanti Betha Msi, Apt dan Dr. Siswa Setyahadi, M.Sc selaku dosen
pembimbing yang telah menyediakan waktu, tenaga, dan pikiran dalam
menuntun penulis dalam penyusunan skripsi ini.
(2) Zilhadia M.Si, Apt selaku dosen pembimbing akademik selama pendidikan.
(3) Drs. Umar Mansur M.Sc selaku kaprodi Farmasi UIN Syarif Hidayatullah
Jakarta.
(4) Para dosen Farmasi UIN yang telah memberikan ilmu, pengalaman dan
wawasannya.
(5) Kak Ruby, Kak Wina, seluruh karyawan dan staf LAPTIAB BPPT
PUSPIPTEK Serpong yang telah memberikan bantuan, ilmu, dan pengalaman
selama penelitian kepada penulis. Juga teman satu leb Bioseparasi Oki dan
Sarah.
(6) Kementrian Agama dan CSS Mora yang telah memberikan dukungan moril
dan materil selama pendidikan. Ucapan beribu terimakasih, semoga ilmu
yang saya terima dapat bermanfaat.
(7) Orangtua, Uu, Aa, Atatan, Aenyang, Aujang, Ababang, Dede, Abi, teteh-
teteh, dan keluarga besar yang selalu memberi dukungan, semangat dan doa .
Love you all.
(8) Rekan penelitian Siti Mardiyanti Said yang telah bersama dalam suka dan
duka. Sahabat-sahabat Emak, Memyu, Zikri, Endah, yang telah memberikan
 3

dukungan dan keceriaan sehingga saya bersemangat dan bisa menyelesaikan

tugas akhir ini.
(9) Teman-teman Matriks 2008 khususnya teman farmasi Imam, Roni, Pei,
Doni, Labib, Jidin, Ukon, Fafa, Fani, Eva, dan Teguh. Asiknya rame rame.
(10) Teman-teman seangkatan Farmasi 2008 yang telah menempuh pendidikan
bersama selama empat tahun, Semoga semangat dan kesuksesan bersama-
sama dengan kita semua.
(11) Semua pihak yang tak bisa disebutkan satu persatu yang telah membantu
kelancaran pembuatan skripsi, Saya ucapkan terimakasih.

Saya menyadari bahwa dalam makalah skripsi ini masih terdapat banyak
kekurangan. Oleh karena itu, saya mengharapkan kritik dan saran yang
membangun sehingga dapat menyempurnakan skripsi ini dan melaksanakan
perbaikan di masa yang akan datang. Semoga tulisan ini dapat bermanfaat bagi
para pembaca dan bagi dunia pendidikan dan ilmu pengetahuan.

Ciputat, 10 Oktober 2012

Aam Amelia
 4

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL
LEMBAR PERSETUJUAN
LEMBAR PENGESAHAN
LEMBAR PERNYATAAN ............................................................................................... i
KATA PENGANTAR ........................................................................................................ ii
DAFTAR ISI ........................................................................................................................ iv
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................................... vi
DAFTAR TABEL ............................................................................................................... viii
DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................................... ix
ABSTRAK .......................................................................................................................... x
ABSTRACT ........................................................................................................................ xi

BAB I PENDAHULUAN .................................................................................................. 1

1.1 Latar Belakang .................................................................................................... 1
1.2 Pembatasan Masalah ........................................................................................... 3
1.3 Perumusan Masalah ........................................................................................... 3
1.4 Hipotesa .............................................................................................................. 4
1.5 Tujuan Penelitian ................................................................................................ 4
1.6 Manfaat Penelitian .............................................................................................. 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA......................................................................................... 5

2.1 Selulosa ............................................................................................................... 5
2.2 Enzim Selulase .................................................................................................... 7
2.3 Bacillus sp ........................................................................................................... 10
2.4 Fermentasi ........................................................................................................... 11
2.5 Glukosa ............................................................................................................... 13
2.6 Analisa Sakarifikasi Limbah Kertas.................................................................... 15
2.6.1 Kromatografi Lapis Tipis ................................................................................. 15

BAB III KERANGKA KONSEP ....................................................................................... 16

BAB IV METODOLOGI PENELITIAN ......................................................................... 17

4.1 Tempat dan Waktu Penelitian ............................................................................. 17
4.2 Bahan .................................................................................................................. 17
4.3 Alat ...................................................................................................................... 17
4.4 Metoda ................................................................................................................ 18
 5

4.4.1 Produksi Enzim Selulase dari Bacillus sp BPPT CC RK2 .............................. 18

4.4.2 Proses Sakarifikasi Limbah Pengolahan Kertas ............................................... 18
4.4.2.1 Variasi Perlakuan Awal Substrat Limbah Pengolahan
Kertas dan Waktu Inkubasi ....................................................................................... 18
4.4.2.2 Uji Sakarifikasi Limbah pengolahan Kertas dengan Variasi
Konsentrasi Enzim .................................................................................................... 19
4.4.2.3 Uji Sakarifikasi Limbah pengolahan Kertas dengan Variasi
Konsentrasi Substrat ................................................................................................. 19
4.4.2.4 Uji Sakarifikasi Pembanding......................................................................... 20
4.4.2.5 Analisa Produk Akhir Sakarifikasi ............................................................... 20

BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................................................. 21

BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN

6.1 Kesimpulan ......................................................................................................... 30
6.2 Saran ................................................................................................................... 30

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................................... 31

LAMPIRAN ......................................................................................................................... 37
GAMBAR ........................................................................................................................... 58
 6

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Struktur Selulosa ................................................................................................ 5

Gambar 2. Jalur Reaksi Selulosa Menjadi Glukosa .............................................................. 8

Gambar 3. Bacillus sp .......................................................................................................... 10

Gambar 4. Struktur Glukosa ................................................................................................. 13

Gambar 5. Reaksi antara Gula Reduksi dengan Reagen DNS .............................................. 14

Gambar 6. Kurva hubungan waktu inkubasi dan perlakuan awal substrat

terhadap persen sakarifikasi .................................................................................................. 22

Gambar 7. Kurva hubungan konsentrasi substrat terhadap persen

sakarifikasi ............................................................................................................................ 24

Gambar 8. Kurva hubungan antara konsentrasi enzim terhadap persen

sakarifikasi ............................................................................................................................ 24

Gambar 9. Analisa produk akhir sakarifikasi dengan KLT ................................................. 28

Gambar 10. Autoklaf ............................................................................................................. 59

Gambar 11. Refrigerated Sentrifuge ..................................................................................... 59

Gambar 12. Termomixer ....................................................................................................... 59

Gambar 13. pHmeter ............................................................................................................. 59

Gambar 14. Timbangan Analitik .......................................................................................... 59

Gambar 15. Spektrofotometer UV VIS ................................................................................. 59

Gambar 16. Substrat limbah pengolahan kertas awal ........................................................... 60

Gambar 17. Perendaman Substrat dengan NaOH ................................................................. 60

Gambar 18. Substrat limbah pengolahan kertas hasil pretreatment ...................................... 60

Gambar 19. Enzim selulase Bacillus sp BPPT CC RK2 ....................................................... 60

 7

Gambar 20. Analit berwarna kecoklatan hasil uji aktivitas selulase dengan

larutan DNS ........................................................................................................................... 61

Gambar 21. Analit berwarna biru hasil analisa kadar protein ............................................... 61

Gambar 22. Substrat limbah pengolahan kertas+enzim selulase Bacillus sp

BPPT CC RK2 ...................................................................................................................... 61

Gambar 23. Pengembangan sampel dan pembanding pada kromatografi lapis

tipis.............61
 8

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Kandungan selulosa, hemiselulosa, lignin dalam berbagai

lignoselulosa.......................................................................................................................... 7

Tabel 2. Persen (%) sakarifikasi berbagai waktu inkubasi dan perlakuan

awal substrat .......................................................................................................................... 22

Tabel 3. Perbandingan kadar gula reduksi dan persen sakarifikasi

keseluruhan ........................................................................................................................... 26
 9

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Cara pembuatan reagen .................................................................................... 40

Lampiran 2. Pembuatan medium .......................................................................................... 41

Lampiran 3. Pembuatan kurva standar glukosa dan kurva standar BSA .............................. 43

Lampiran 4. Kurva standar Glukosa ..................................................................................... 44

Lampiran 5. Kurva standar BSA ........................................................................................... 45

Lampiran 6. Metoda pengujian aktivitas enzim selulase dan kadar protein ......................... 46

Lampiran 7. Perhitungan uji aktivitas selulase ..................................................................... 48

Lampiran 8. Perhitungan kadar protein ................................................................................. 49

Lampiran 9. Aktivitas enzim selulase yang digunakan ......................................................... 50

Lampiran 10. Penentuan persen sakarifikasi limbah pengolahan kertas............................... 51

Lampiran 11. Metoda perlakuan awal substrat limbah pengolahan kertas ........................... 52

Lampiran 12. Hasil uji pendahuluan perlakuan awal substrat .............................................. 53

Lampiran 13. Perhitungan uji variasi konsentrasi substrat ................................................... 55

Lampiran 14. Perhitungan uji variasi konsentrasi enzim ...................................................... 57

Lampiran 15. Analisa produk akhir sakarifikasi dengan kromatografi lapis

tipis ........................................................................................................................................ 58

Lampiran 16. Data pembanding ............................................................................................ 59

 10

ABSTRAK
Judul : Pengaruh Variasi Konsentrasi Enzim dan Substrat Terhadap Sakarifikasi
Limbah Pengolahan Kertas Menggunakan Enzim Selulase dari Bacillus sp. BPPT
CC RK

Selulosa merupakan polimer yang paling banyak ditemukan di alam dan

dapat dilakukan proses sakarifikasi dengan cara enzimatis. Penelitian ini bertujuan
untuk melihat pengaruh konsentrasi enzim dan substrat terhadap sakarifikasi
limbah pengolahan kertas menggunakan enzim selulase dari Bacillus sp BPPT CC
RK2. Nilai aktivitas spesifik enzim selulase adalah 15,04 U/mg. Proses
sakarifikasi substrat limbah pengolahan kertas dilakukan dengan variasi
konsentrasi enzim dengan aktivitas 6,12,18 Unit serta dilakukan variasi
konsentrasi substrat 25,50,100, 150 dan 200 mg. Hasil terbaik didapat dari
konsentrasi enzim dengan aktivitas 12 unit dengan nilai persen (%) sakarifikasi
sebanyak 1,80% dan substrat 100 mg dengan persen (%) sakarifikasi sebanyak
1,01%. Analisa produk akhir sakarifikasi diidentifikasi dengan kromatografi lapis
tipis. Kromatogram dan nilai Rf menunjukkan produk akhir sakarifikasi adalah
Maltosa.

Kata kunci:
Sakarifikasi, Selulase, Bacillus sp. BPPT CC RK2, KLT
 11

ABSTRACT

Title : Effect of Concentration Enzymes and Substrates Variation for Paper Sludge
Saccharification Using Cellulase Enzyme From Bacillus sp. BPPT CC RK2

Cellulose is the most abundant polymer in nature and can be converted

into sugar molecules with enzymatic reaction. The aim of this study is to know
about effect of variation concentration of enzymes and substrates on
saccharification of paper sludge uses cellulase enzymes from Bacillus sp BPPT
CC RK2. The result of spesific enzyme activity is 15,04 U/mg. Yhe process of
paper sludge saccharification is done by variation of the concentration of the
enzyme with activity unit 6,12,18 unit and variation of the concentration of
substrate 25,50,100,150 and 200 mg. The best results were obtained from the
concentration of the enzyme activity 12 unit with 1.80% saccharification and
substrate as 100 mg with 1.01% saccharification. Analysis of the final product
saccharification identified by thin layer chromatography. Rf value indicates the
end product of sacharification is Maltose.

Keyword:
Saccharification, Cellulase, Bacillus sp. BPPT CC RK2, TLC
 12

BAB I.
PENDAHULUAN

1.1 LATAR BELAKANG

Produksi biomassa lignoselulosa dari tanaman di dunia mencapai jumlah

sekitar 200 x 109 ton per tahun. Sebanyak 8-20 x 109 ton dari biomassa tersebut

berpotensi untuk diolah lebih lanjut (Lin dan Tanaka, 2006). Indonesia merupakan

negara penghasil biomassa yang cukup melimpah, baik yang berasal dari bahan

kayu, jerami, rumput-rumputan, limbah pertanian, hutan, limbah industri (kayu,

kertas) dan bahan berserat lainnya, sehingga sangat memungkinkan untuk

pemanfaatan biomassa lignoselulosa yang sampai saat ini belum dikembangkan

secara optimal (Octavia et al, 2011).

Limbah kertas dilaporkan memiliki kandungan selulosa sebanyak 60-

70%, hemiselulosa 10-20 %, dan lignin 5-10% (Sun dan Cheng 2002). Dalam

penelitian ini material lignoselulosa yang digunakan adalah limbah kertas yang

merupakan residu pengolahan pabrik kertas.

Lignoselulosa adalah komponen organik di alam yang berlimpah dan

terdiri dari tiga tipe polimer, yaitu selulosa, hemiselulosa dan lignin. Komponen

ini merupakan sumber penting untuk menghasilkan produk bermanfaat seperti

glukosa dari proses fermentasi, bahan kimia dan bahan bakar cair (Anindyawati,

2009).

Selulosa merupakan polimer yang paling banyak ditemukan pada

tumbuhan dan merupakan target utama biokonversi ( D.J Mukesh Kumar et al,

2012). Proses biokonversi polisakarida menjadi komponen gula dinamakan

 13

Sakarifikasi (Karmakar dan Ray, 2011). Glukosa merupakan produk utama dari

proses pemecahan selulosa (Kristensen, 2009). Pada penelitian ini yang menjadi

fokus perhatian adalah sakarifikasi selulosa menjadi glukosa.

Proses sakarifikasi dapat dilakukan dengan cara fisika, kimia dan biologi

(Laser et al, 1996 dalam Thakur dan Nakagoshi, 2011). Metoda fisika dilakukan

dengan penggilingan dan radiasi untuk menurunkan ukuran partikel, luas

permukaan dan derajat polimerasi. Metoda kimia melibatkan reagen asam, basa,

amoniak, tekanan uap, dan hipoklorit untuk memisahkan lignin. Namun, kedua

metoda diatas menghasilkan kualitas produk yang rendah karena terjadi degradasi

molekul glukosa. Metoda biologi atau secara enzimatik memiliki keuntungan

yaitu menghasilkan produk dengan kualitas yang baik karena reaksi spesifik dari

enzim-substrat. Struktur kristal dan porositas selulosa pun tidak mengalami

degradasi sehingga produk biokonversi yang dihasilkan berkualitas lebih baik

(Thakur dan Nakagoshi, 2011). Metode yang digunakan untuk menghidrolisis

selulosa adalah dengan menggunakan enzim, contohnya selulase(Galbe dan

Zacchi, 2002).

Enzim selulase dapat dihasilkan oleh jamur, bakteri dan actinomycetes.

Bakteri Bacillus sp. diketahui merupakan salah satu mikroorganisme yang dapat

menghasilkan enzim selulase. Meskipun produksi enzim selulase oleh bakteri ini

tidak sebanyak produksi enzim selulase oleh jamur (con. Trichoderma reesei),

namun produksi enzim selulase menggunakan bakteri mendatangkan beberapa

keuntungan, antara lain yaitu bakteri memiliki laju pertumbuhan yang lebih tinggi

dibandingkan jamur dan lebih mudah beradaptasi pada lingkungan yang ekstrim

(Maki, 2009), bakteri lebih mudah direkayasa genetika, enzim selulase yang
 14

dihasilkan merupakan katalis yang lebih efektif dan kurang terinhibisi oleh

material yang telah terhidrolisis (Ariffin et al, 2006). Pada penelitian ini bakteri

yang digunakan adalah Bacillus sp. BPPT CC RK2 yang merupakan koleksi

BPPT. Enzim selulase yang dihasilkan oleh Bacillus sp. BPPT CC RK2 mencapai

kondisi optimum pada pH 7,0 dan temperatur 37° C dengan menggunakan media

produksi dedak padi 40 % dan air kelapa 20 % (Bakti, 2011; Marssada, 2011).

Menurut Thakur dan Nakagoshi (2011), terdapat beberapa faktor yang

mempengaruhi hasil dan laju hidrolisis enzim yaitu konsentrasi substrat, aktivitas

selulase, dan kondisi reaksi seperti pH dan temperatur. Pada penelitian ini akan

dilakukan pengamatan terhadap kemampuan enzim selulase yang dihasilkan dari

fermentasi Bacillus sp. BPPT CC RK2 dalam mengkonversi selulosa dari limbah

pengolahan kertas menjadi glukosa. Selanjutnya juga akan diamati pengaruh

jumlah enzim dan substrat terhadap konsentrasi glukosa yang dihasilkan.

1.2 PEMBATASAN MASALAH

Penelitian ini dibatasi pada analisa produksi glukosa dari limbah

pengolahan kertas secara enzimatis menggunakan enzim selulase yang dihasilkan

Bacillus sp. BPPT CC RK2 dengan variasi konsentrasi enzim dan substrat.

1.3 PERUMUSAN MASALAH

1. Apakah limbah pengolahan kertas dapat dikonversi menjadi glukosa melalui

proses sakarifikasi dengan menggunakan enzim selulase yang dihasilkan bakteri

Bacillus sp. BPPT CC ?

 15

2. Bagaimana pengaruh variasi konsentrasi enzim selulase dan substrat terhadap

proses sakarifikasi?

1.4 HIPOTESA

Limbah pengolahan kertas merupakan limbah akhir pabrik kertas yang

mengandung selulosa. Enzim selulase dari Bacillus sp BPPT CC RK2 dapat

menghidrolisis selulosa dan menghasilkan glukosa. Konsentrasi glukosa yang

dihasilkan akan mencapai optimum pada jumlah enzim dan substrat tertentu.

1.5 TUJUAN PENELITIAN.

1. Mengetahui potensi limbah pengolahan kertas untuk menghasilkan molekul

glukosa melalui proses sakarifikasi dengan menggunakan enzim selulase dari

Bacillus sp. BPPT CC RK2

2. Mengetahui pengaruh konsentrasi enzim selulase dan substrat terhadap proses

sakarifikasi.

1.6 MANFAAT PENELITIAN

1. Memanfaatkan limbah pengolahan kertas untuk dapat menghasilkan molekul

glukosa.

2. Menjaga kelestarian lingkungan dengan memanfaatkan limbah pengolahan

kertas.
 16

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Selulosa

Selulosa merupakan molekul sederhana dengan unit selubiosa yang

berulang yang tersusun atas unit-unit glukosa-1,4 anhidrat yang dihubungkan oleh

ikatan β 1,4-glikosidik. Ikatan rantai saling berinteraksi melalui ikatan hidrogen

intramolekul dan intermolekul; dan ikatan van der walls (O'Sullivan, 1997 dikutip

dari Saxena dan Brown, 2007).

Gambar 1. Struktur Selulosa (P. Singh nee’ Nigam et al, 2009)

Selulosa merupakan polimorfisme, dan perbedaan bentuk biasanya

terdefinisi oleh bentuk kristal dan amorf. Bentuk kristal merupakan bentuk

selulosa terbanyak, sedangkan bentuk amorf memiliki persentase yang sedikit

(Kondo, 2004 dikutip dari Saxena dan Brown, 2007).

Selulosa berasal dari biopolimer yang disintesis oleh tumbuhan, alga,

beberapa jenis bakteri termasuk golongan sianobakteri, dan jamur ( Brown, 1996).

Selulosa merupakan bagian dari lignoselulosa. Lignoselulosa terdiri dari

tiga komponen utama yaitu: Selulosa, Hemiselulosa dan Lignin. Ketiganya

membentuk suatu ikatan kimia kompleks yang menjadi bahan dasar dinding sel

tumbuhan. Selulosa berjumlah sekitar 30-60% dari total keseluruhan

lignoselulosa.
 17

Hemiselulosa merupakan istilah umum bagi polisakarida yang larut dalam

alkali. Hemiselulosa berjumlah sekitar 20-40% dari total keseluruhan

lignoselulosa. Hemiselulosa sangat dekat asosiasinya dengan selulosa dalam

dinding sel tanaman (Fengel dan Wegener, 1984 dalam Hermiati et al, 2010).

Lima gula netral, yaitu glukosa, mannosa, dan galaktosa (heksosan) serta xilosa

dan arabinosa (pentosan) merupakan konstituen utama hemiselulosa (Fengel dan

Wegener, 1984 dalam Hermiati et al, 2010). Berbeda dari selulosa yang

merupakan homopolisakarida dengan monomer glukosa dan derajat polimerisasi

yang tinggi (10.000– 14.000 unit), rantai utama hemiselulosa dapat terdiri atas

hanya satu jenis monomer (homopolimer), seperti xilan, atau terdiri atas dua jenis

atau lebih monomer (heteropolimer), seperti glukomannan. Rantai molekul

hemiselulosa pun lebih pendek daripada selulosa.

Lignin mempunyai struktur molekul yang sangat berbeda dengan

polisakarida karena terdiri atas sistem aromatik yang tersusun atas unit-unit fenil

propana. Lignin berjumlah sekitar 15-25% dari total keseluruhan lignoselulosa

(Fengel dan Wegener, 1984 dalam Hermiati et al, 2010).

Peran ketiga komponen kimia ini dalam dinding sel dapat dianalogkan

seperti bahan konstruksi yang terbuat dari reinforced concrete, di mana selulosa,

hemiselulosa,dan lignin berperan sebagai rangka besi, semen, dan bahan penguat

yang memperbaiki ikatan di antara mereka.

 18

Tabel 1. Kandungan selulosa, hemiselulosa, lignin dalam berbagai lignoselulosa

( Kumar et al, 2009)

Material Lignoselulosa Selulosa (%) Hemiselulosa (%) Lignin (%)

Batang Kayu ( keras) 40 – 55 24 – 40 18 – 25
Batang Kayu ( lunak) 45 – 50 25 – 35 25 – 35
Kulit Kacang 25 – 30 25 – 30 30 – 40
Tongkol Jagung 45 35 15
Rumput 25 – 40 35 – 50 10 – 30
Kertas 85 – 99 0 0 – 15
Jerami Gandum 30 50 15
Sampah (sortiran) 60 20 20
Daun 15 – 20 80 – 85 0
Kapas 80 – 95 5 – 20 0
Koran 40 – 55 25 – 40 18 – 30
Limbah Kertas (Residu Pabrik) 60 – 70 10 – 20 5 – 10
Limbah air (padatan) 8 – 15 Tdk diketahui Tdk diketahui
Pupuk Hasil Ternak 1,6 – 4,7 1,4 – 3,3 2,7 -5,7
Kotoran Babi 6,0 28 Tdk diketahui

Kandungan utama limbah kertas adalah selulosa yang merupakan

homopolisakarida terdiri dari β –D- glukosa. Limbah kertas dapat digunakan

untuk produksi glukosa setelah hidrolisis selulosa dengan enzim selulase (Vynios

et al, 2009).

Adapun karakteristik limbah pengolahan kertas yang dipakai dalam

penelitian ini adalah limbah akhir sisa pembuangan pabrik kertas yang didapatkan

dari sebuah pabrik pembuatan kertas di wilayah Tangerang.

2.2 Enzim Selulase

Enzim merupakan suatu protein yang bersifat sebagai katalis, yang

meningkatkan kecepatan reaksi perubahan substrat menjadi produk sementara

enzim itu sendiri tidak mengalami perubahan (Adhiyanto, 2006). Enzim selulase

merupakan enzim yang mengkatalis proses selulolisis (hidrolisis selulosa) dan

menghasilkan glukosa, selobiosa dan selooligosakarida (Sukumaran et al, 2005).

 19

Untuk dapat menghidrolisis selulosa menjadi glukosa , enzim selulase

dibagi menjadi tiga tipe, yaitu exoglucanase, endoglucanase, dan β-glucosidase.

Endoglucanase (1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase, EC 3.2.1.4) bersifat lebih

aktif memecah daerah dengan sifat kekristalan yang rendah dan menciptakan

ujung rantai yang bebas. Exoglucanase (1,4-β-D-glucancellobiohydrolase, EC

3.2.1.91) biasanya aktif pada bentuk kristal selulosa dan memecah bagian selulosa

yang tidak tereduksi menjadi unit selobiosa. β-Glucosidase (EC 3.2.1.21)

memecah selobiosa menjadi glukosa (Mussatto dan Teixeira, 2010).

Gambar 2. Jalur reaksi selulosa menjadi glukosa (Demers, 2009).

Produksi enzim selulase dilaporkan berasal dari berbagai jenis bakteri dan

jamur. Enzim selulase yang dihasilkan oleh jamur seperti Aspergillus dan

Trichoderma spp lebih banyak digunakan karena menghasilkan produk enzim

selulase yang lebih tinggi dibandingkan jenis bakteri dan yeast (Mrudula dan

Murugamal, 2011). Pada saat ini, enzim selulase yang berasal dari bakteri mulai

dikembangkan karena laju pertumbuhan bakteri yang lebih cepat dibandingkan

jamur, bakteri lebih mudah direkayasa genetika , kurang terinhibisi oleh material
 20

yang telah terhidrolisis dan dapat beradaptasi dalam lingkungan yang ekstrim

(Ariffin et al, 2006; Maki et al, 2009 ).

Enzim selulase memiliki aplikasi yang luas di bidang pangan, detergen,

tekstil, bahan bakar, kimia, dan pengolahan limbah. Terlepas dari aplikasi umum

selulase tersebut, kini mulai dikembangkan aplikasi enzim selulase dalam

pengembangan protoplast, antibakteri chitooligosakarida, immunomodulator, dan

agen antitumor (Begum et al, 2012).

Penentuan konsentrasi enzim adalah dengan cara menentukan aktivitas

katalitiknya. Pada tahun 1961, komisi enzim menetapkan Unit Enzim (U), yang

dikenal dengan International Unit (IU), sebagai jumlah enzim yang digunakan

untuk mengubah 1mol substrat permenit dibawah kondisi ideal (Adhiyanto et al,

2006).

Pengujian aktivitas selulase dilakukan dengan dua pendekatan, yaitu

mengukur selulase individu (endoglukanase, eksoglukanase, dan β-glukosidase)

dan aktivitas total selulase (Zhang et al, 2006). Aktivitas endoglukanase atau

CMCase dapat diukur berdasarkan reduksi viskositas substrat dan peningkatan

ujung akhir rantai yang direduksi berdasarkan pengujian gula reduksi. Aktivitas

eksoglukanase diukur menggunakan substrat Avicel, dan aktivitas β-glukosidase

diukur menggunakan selobiosa yang tidak dihidrolisis oleh endoglukanase dan

eksoglukanase dan menggunakan siklodekstrin rantai panjang yang dihidrolisis

oleh endoglukanase dan eksoglukanase (Ghose, 1987).

Aktivitas total selulase terdiri dari endoglukanase, eksoglukanase, dan β-

glukosidase yang keseluruhannya bekerja secara sinergis menghidrolisis kristal

selulosa. Pada umumnya, pengujian aktivitas total selulase dilakukan dengan

 21

menggunakan filter paper assay (FPA) menggunakan kertas saring whatman no.1

sebagai substrat sebagaimana dipublikasikan oleh IUPAC (The International

Union of Pure and Applied Chemistry) ( Ghose, 1987).

2.3 Bacillus sp

Gambar 3. Bakteri Bacillus sp

(Sumber : www. Invivo.flocruz.br/cell/oficina.htm)

Klasifikasi bakteri Bacillus sp adalah sebagai berikut: (cohn, dikutip dari wikipedia.com)

Kingdom : Bacteria

Phylum : Firmicutes

Kelas : Bacilli

Ordo : Bacillales

Famili : Bacilaceae

Genus : Bacillus

Species : Bacillus sp.

Golongan Bacillus merupakan bakteri Gram positif, berbentuk batang,

bersifat aerob dan merupakan bakteri endospora. Pada umumnya, golongan

Bacillus bersifat mesofil yang dapat hidup pada temperatur 30-45˚ C

(Oppenheimer dan Zobell, 1952 dalam Kalimutho et al, 2011). Namun dilaporkan

beberapa spesies memiliki kemampuan bertahan di lingkungan yang ekstrim,

seperti padang pasir, kedalaman bawah laut dan mata air panas Arctic. Bakteri ini
 22

termasuk golongan thermofilik, asidofilik, alkalifilik, halotoleran, dan halofilik

yang memiliki kemampuan tumbuh pada temperatur, pH dan konsentrasi garam

yang ekstrim (Turnbull,1996).

Bacillus banyak ditemukan di alam seperti pada tanah, air, debu, beberapa

spesies bahkan ditemukan sebagai flora normal pada usus manusia. Ketika

ditumbuhkan pada media agar darah, Bacillus membentuk pola yang besar,

tersebar, berwarna putih keabu-abuan dengan tepi yang tidak beraturan.

Karakteristik unik dari bakteri ini adalah kemampuannya untuk membentuk

endospora pada kondisi lingkungan yang ekstrim ( El safey, 2006).

Bacillus banyak digunakan dalam mikrobiologi industri karena laju

pertumbuhannya yang cepat pada proses fermentasi, kemampuan mengsekresikan

protein ke medium ekstraselular dan status keamanannya yang GRAS ( generally

regarded as safe), seperti B. subtilis dan B. licheniformis (Schallmey et al, 2004).

Pada umumnya, Bacillus alkalifilik mampu memproduksi berbagai enzim

yaitu protease, amilase, xilanase, pullulase dan selulase (Schallmey et al, 2004).

Beberapa Bacillus yang telah diteliti menghasilkan enzim selulase adalah Bacillus

subtilis (Yin et al, 2010), Bacillus pumilus (Ariffin et al, 2006), Bacillus

licheniformis (Aygan et al, 2011), Bacillus sp (Aygan dan Arikan, 2008).

Pada penelitian ini, diamati kemampuan Bacillus sp BPPT CC RK 2 dalam

menghasilkan enzim selulase untuk selanjutnya diamati kemampuan sakarifikasi

limbah kertas.

2.4 Fermentasi

Istilah fermentasi berasal dari bahasa latin yaitu fervere yang berarti

mendidih. Istilah ini pertama kali digunakan untuk menerangkan terjadinya

 23

penggelembungan atau pendidihan pada ekstrak buah karena adanya gas CO2 saat

ditumbuhi mikroba atau yeast. Dalam mikrobiologi, fermentasi mengarah pada

segala proses yang melibatkan produksi biomassa/bioproduk dengan

menggunakan mikroba (Tewari, 2007). Dalam mikrobiologi industri, fermentasi

dapat didefinisikan sebagai perubahan gradual oleh enzim beberapa bakteri,

khamir, dan kapang. Beberapa contoh perubahan kimia dari fermentasi meliputi

pengasaman susu, dekomposisi pati dan gula menjadi alkohol dan karbon

dioksida, dan oksidasi senyawa nitrogen organik (Hidayat dan Suhartini, 2010).

Fermentasi dalam arti luas adalah proses perubahan kimia dari senyawa-senyawa

organik (karbohidrat, protein, lemak dan bahan organik lain) melalui kerja enzim

yang dihasilkan mikroba (Gandjar, 1977 dikutip Abun 2006).

Mikroorganisme yang umum digunakan dalam fermentasi adalah bakteri,

jamur dan khamir (Yeast). Kelompok bakteri yaitu Acetobacter, Streptococcus,

Lactococcus,Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacillus, Propionibacterium,

Brevibacterium, Bacillus, Micrococcus, dan Staphylococcus. Kelompok yeast

yaitu Saccharomyces, Candida, Torulopsis, dan Hansenula. Kelompok jamur

yaitu Aspergillus, Penicillum, Rhizopus, Mucor, Monascus, dan Actinomucor

(Chojnacka, 2004).

Menurut jenis mediumnya, proses fermentasi dibagi menjadi dua yaitu

fermentasi substrat padat dan fermentasi substrat cair. Pada fermentasi substrat

padat, mikrooorganisme tumbuh pada media substrat yang sedikit atau sama

sekali bebas kandungan air , walaupun kapiler air tetap masih ada. Keuntungan

fermentasi substrat padat antara lain prosesnya sangat sederhana, tidak diperlukan
 24

alat yang rumit, berkurangnya persoalan kontaminasi oleh mikroorganisme lain

(Chisti, 1999).

Fermentasi substrat cair adalah proses fermentasi yang substratnya larut

atau tersuspensi dalam fase cair. Keuntungannya antara lain jumlah inokulum

yang digunakan lebih sedikit, penanganan suhu dan kelembaban selama

fermentasi lebih mudah untuk dikontrol (Chisti, 1999).

Proses fermentasi dipengaruhi beberapa faktor, yaitu temperatur, pH,

lingkungan dan komposisi medium,kandungan O2 dan CO2 , dan kondisi

operasional fermentor (Chisti, 1999).

2.5 Glukosa

Gambar 4. Struktur Glukosa ( Sumber: Handbook of Pharmaceutical Exipients)

Glukosa atau dikenal dengan dekstrosa (karena mempunyai sifat dapat

memutar cahaya terpolarisasi kearah kanan), merupakan molekul

pentahidroksihexana dan termasuk golongan aldoheksosa (Vollhard dan Schore,

2009). Pemerian glukosa yaitu tak berbau, rasanya manis, berbentuk kristal atau

serbuk putih halus (Handbook of Pharmaceutical Exipients ed 5th).

Glukosa memiliki banyak manfaat dalam bidang farmasi, pangan, industri

permen dan bahan kimia. Dalam bidang farmasi, glukosa digunakan sebagai

pemanis, pengisi tablet dan kapsul, agen tonisitas, dan nutrisi dalam sediaan

parenteral (Handbook of Pharmaceutical Exipients ed 5th).

 25

Analisa glukosa dari enzim selulase dapat dilakukan dengan menghitung

kadar gula reduksi menggunakan metoda DNS (Miller, 1959) dan Nelson

Somogyi dikarenakan kemampuan metoda diatas yang tinggi dalam mendeteksi

kadar gula yang tidak memerlukan pengenceran sampel dan interfensi yang

rendah dari selulase karena tidak memerlukan adanya pemindahan protein (Zhang

et al, 2006). Metoda DNS sepuluh kali lebih sensitif dibanding metode Nelson

Somogyi (Gusakov et al, 2011).

Metoda DNS digunakan untuk mengukur gula pereduksi dengan teknik

kolorimetri (Dashtban et al, 2010). Analisis ini dilakukan dengan menggunakan

asam 3,5-dinitrosalisilat atau 3,5-Dinitrosalicylic acid (DNS) yang merupakan

senyawa aromatik yang bereaksi dengan cara mengurangi kadar glukosa

membentuk asam 3-amino-5-nitrosalisilat, yang menyerap gelombang cahaya 540

nm (Miller, 1959)

(Toledo et al, 2012)

Gambar 5. Reaksi antara gula reduksi dengan reagen DNS

 26

2.6 Analisa Sakarifikasi Limbah Kertas

2.6.1 Kromatografi Lapis Tipis ( KLT)

Kromatografi lapis tipis adalah metoda pemisahan fisikokimia, dimana

lapisan pemisah yaitu fase diam ditempatkan pada penyangga berupa pelat gelas,

logam, atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisahkan berupa larutan

ditotolkan berupa bercak atau pita. Setelah pelat atau lapisan ditaruh didalam

bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak),

pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (pengembangan). Selanjutnya

senyawa yang tidak berwarna harus ditampakkan.

Fase diam yang biasa digunakan yaitu silika gel, alumunium oksida,

kieselgur, selulosa dan turunannya, poliamida dan lain-lain. Fase gerak adalah

medium pembawa dan terdiri dari satu atau beberapa pelarut. Fase gerak bergerak

dalam fasa diam dengan adanya gaya kapiler.

Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan

dengan angka Rf atau hRf, yaitu :

Rf = Jarak titik pusat bercak dari titik awal

Jarak garis depan dari titik awal

Deteksi senyawa yang dipisahkan dapat dilakukan dengan berbagai cara,

yaitu deteksi dengan lampu UV; deteksi dengan pelarut semprot; dan deteksi

biologi (Stahl, 1985).

 27

BAB III

KERANGKA KONSEP

Bacillus sp BPPT CC RK 2

Pembuatan media
Pembuatan stok kultur

Variasi Perlakuan Awal

Limbah Pengolahan Kertas
Pembuatan Starter Bakteri

Pretreatment Limbah Untreatment Limbah

Pengolahan Kertas Pengolahan Kertas
Produksi enzim selulase

Analisa kadar enzim selulase Analisa kadar protein

Sakarifikasi

Sakarifikasi Enzim selulase + Limbah Pengolahan Pembanding

Kertas

Variasi Konsentrasi Enzim Variasi Konsentrasi Substrat

Enzim Komersil Primafast 200 Limbah Pengolahan

Kertas+ Buffer

Analisa Produk Sakarifikasi

Analisa kandungan glukosa secara Analisa Persen (%) Sakarifikasi dengan

kualitatif dengan Kromatografi Lapis Spektrofotometer UV Visible
Tipis ( KLT )
 28

BAB IV

METODOLOGI PENELITIAN

4.1 TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Teknologi Bioindustri,

LAPTIAB – BPPT PUSPIPTEK, Serpong, Tangerang, Banten dengan waktu

penelitian selama lima bulan dari Mei- September 2012.

4.2 BAHAN

Limbah pengolahan kertas, Bacillus sp. BPPT CC RK2. Bahan kimia yang

digunakan antara lain : medium Luria Bertani (LB), dedak padi, air kelapa,

ekstrak khamir (Scharlau), pepton (Pronadisa), NaCl (Merck), pereaksi

Dinitrosalisilat acid (DNS), Bouvine Serum Albumin (Sigma-Aldrich), pereaksi

Bradford, agar Bacto, CMC (Pronadisa), Na2HPO4.2H2O (Merck), NaHPO4

(Merck), NaOH (Merck), H2SO4 , metanol, butanol, asam asetat, glukosa (Sigma),

maltosa (Sigma), sukrosa (Sigma), galaktosa (Sigma), arabinosa (Sigma), ddH2O

(Milipore), akuades, enzim selulase komersil Primafast 200 (Genencor).

4.3 ALAT

Spektrofotometer UV Vis (Genesis), Lempeng KLT, Shaker Inkubator

(Kuhner), Shaker Inkubator GLF, Static Incubator (Memmert), Laminar Air

Flow (Babcock BF), Refrigerated Centrifuge (Gyrozen), Sentrifuge (Sigma),

pHmeter (Inolab), Waterbath, Termomixer (Eppendorf), Timbangan analitik

(Radwag), Autoklaf (Hitachi) , Hot plate magnetic stirrer (Heindolph) , Oven,

 29

Pipet mikro (Thermo), Mikrotube (Eppendorf), cawan petri, dan alat-alat gelas

(Pyrex).

4.4 METODA

4.4 .1 Produksi Enzim Selulase dari Bacillus sp. BPPT CC RK2

Media starter dibuat dengan menginokulasikan sebanyak 1-2 ose isolat

Bacillus sp. BPPT CC RK2 ke dalam media LB steril (10% media produksi),

kemudian diinkubasi pada suhu 37oC , agitasi 150 rpm selama 6 jam. Produksi

enzim dilakukan dengan menginokulasikan media starter ke dalam media

produksi, dan diinkubasi pada suhu 37oC , agitasi 150 rpm selama 24 jam.

Setelah 24 jam, enzim dipanen dengan cara sentrifugasi dengan agitasi 6000 rpm

menggunakan Refrigerated Centrifuge (Zyrogen) selama 15 menit pada suhu

4oC, kemudian supernatannya diambil sebagai fraksi enzim kasar, kemudian

enzim kasar tersebut dianalisis aktivitas enzim dan kadar protein.

4.4.2. Proses Sakarifikasi Limbah Pengolahan Kertas

4.4.2.1 Variasi Perlakuan Awal Substrat Limbah Pengolahan Kertas dan

Waktu Inkubasi

a. Pretreatment substrat

Sebanyak 5 gram substrat limbah pengolahan kertas ditambah 100 ml

NaOH 1N dalam erlenmeyer dibiarkan selama 6, 12, dan 24 jam. Kemudian

larutan disaring menggunakan kain nilon dan dicuci dengan air yang mengalir

hingga pH netral, setelah itu substrat hasil pretreatment dikeringkan semalaman

dalam oven suhu 80˚ C. Dari hasil perlakuan, diambil sebanyak 100 mg substrat

limbah pengolahan kertas kemudian dicampur dengan 1 ml larutan buffer phosfat

0,05 M pH 7 lalu ditambahkan enzim selulase kasar dengan variasi konsentrasi

 30

enzim dengan aktivitas 6,12,18 unit kemudian diinkubasi selama 24,48,72,96, dan

120 jam pada suhu 50˚ C. Kadar gula reduksi dihitung dengan menggunakan

metoda DNS (Miller, 1959) dan persen (%) sakarifikasi (Begum dan Alimon

2011).

b. Perlakuan substrat tanpa pretreatment

Sebanyak 5 gram substrat limbah pengolahan kertas basah dikeringkan 12

jam dalam oven suhu 80˚C. Dari hasil perlakuan, diambil sebanyak 100 mg

substrat limbah kertas kemudian dicampur dengan 1 ml larutan buffer phosfat

0,05 M pH 7 lalu ditambahkan enzim selulase kasar dengan variasi konsentrasi

enzim dengan aktivitas 6,12,18 unit kemudian diinkubasi selama 24,48,72,96, dan

120 jam pada suhu 50˚ C. Dihitung kadar gula reduksi dengan metoda DNS

(Miller, 1959) dan persen (%) sakarifikasi (Begum dan Alimon 2011).

4.4.2.2 Uji Sakarifikasi Limbah pengolahan Kertas dengan Variasi

Konsentrasi Enzim

Sebanyak 100 mg substrat limbah pengolahan kertas dicampur dengan 1

ml larutan buffer phosfat 0,05 M pH 5,5 lalu ditambahkan enzim selulase kasar

dengan variasi konsentrasi enzim dengan aktivitas 6,12,18 Unit kemudian

diinkubasi selama 96 jam pada suhu 37˚ C. Kadar gula reduksi dihitung dengan

menggunakan metoda DNS (Miller, 1959) dan persen (%) sakarifikasi (Begum

dan Alimon 2011).

4.4.2.3 Uji Sakarifikasi Limbah pengolahan Kertas dengan Variasi Substrat

Seperti prosedur 4.4.2.1 diatas dengan variasi substrat sebanyak 25 ,50,

100, 150, 200 mg ditambah enzim selulase kasar sebanyak 12 unit.

 31

4.4.2.4 Uji Sakarifikasi Pembanding

a. Sakarifikasi limbah pengolahan kertas dengan Enzim Selulase Komersial

Enzim komersil yang digunakan yaitu enzim Primafast 200, dengan

kondisi optimum sakarifikasi pada pH 5,5 dengan temperatur inkubasi 60° C.

Sakarifikasi dilakukan selama 96 jam, dan setiap 24 jam supernatan diambil untuk

dihitung kadar gula reduksi dan persen (%) sakarifikasi.

b. Blangko

Blangko yaitu sebanyak 100 mg substrat hasil pretreatment 24 jam

ditambah buffer sitrat pH 5,5 kemudian diinkubasi pada suhu 37°C. Kadar gula

reduksi dan persen (%) sakarifikasi diukur setiap 24 jam. Sebagai kontrol yaitu

larutan buffer sitrat pH 5,5 diinkubasi pada suhu 37°C.

4.4.2.4 Analisa Produk Akhir Sakarifikasi

a) Analisa Produk Dengan Menggunakan Kromatografi Lapis Tipis

Analisa glukosa dilakukan secara kualitatif menggunakan kromatografi

lapis tipis dengan larutan pengembang butanol: asam asetat:air ( 3:3:1). Sampel

ditotolkan dalam pelat silika gel, dan dibiarkan hingga pelarut bergerak menuju

keatas dari pelat. Visualisasi kromatogram dilakukan dengan penampak bercak

H2SO4 10 % dalam metanol kemudian dikeringkan dalam oven suhu 110 ˚C

selama 5 menit (Karmakar dan Ray, 2011). Sebagai pembanding digunakan

berbagai standar gula, yaitu glukosa, xylosa, arabinosa, galaktosa, sukrosa dan

maltosa dengan konsentrasi 5 mg/ml.

 32

BAB V

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini dilakukan untuk melihat pengaruh variasi konsentrasi enzim

dan substrat limbah pengolahan kertas untuk mencapai hasil sakarifikasi optimum

dengan menggunakan enzim selulase dari Bacillus sp. BPPT CC RK2. Media

produksi enzim yang digunakan adalah media Luria Bertani ditambah dengan

dedak beras 40 % sebagai sumber karbon dan air kelapa 20 % sebagai sumber

nitrogen. Enzim selulase yang dihasilkan memiliki aktivitas spesifik 15,04

unit/mg dengan data terlampir.

Konsentrasi enzim dan substrat berpengaruh terhadap produk yang

dihasilkan dari proses sakarifikasi. Analisa produk ditinjau dari besarnya persen

(%) sakarifikasi dan jenis gula yang dihasilkan.

Untuk mengetahui nilai persen sakarifikasi, terlebih dahulu harus

diketahui kadar gula reduksi sampel. Pengukuran kadar gula reduksi dilakukan

dengan metoda DNS (Miller, 1959). 3,5- asam dinitrosalisilat (DNS) merupakan

senyawa aromatik yang bereaksi dengan gula reduksi sampel yang memiliki

gugus aldehid atau keton bebas membentuk kompleks warna 3-amino-5 dinitro

asam salisilat yang dapat dideteksi dengan spektrometer UV vis pada panjang

gelombang 540 nm (Toledo et al, 2012).

Pada uji variasi perlakuan awal substrat dilakukan perbandingan antara

substrat yang diberi perlakuan (pretreatment) dan substrat tanpa perlakuan

(untreatment). Proses pretreatment dilakukan untuk mengkondisikan bahan-bahan

lignoselulosa baik dari segi struktur dan ukuran dengan memecah dan

menghilangkan kandungan lignin dan hemisellulosa, merusak struktur kristal dari

 33

selulosa serta meningkatkan porositas bahan (Sun dan Cheng, 2002). Rusaknya

struktur kristal selulosa akan mempermudah terurainya selulosa menjadi glukosa.

Selain itu, hemiselulosa akan turut terurai menjadi senyawa gula sederhana:

glukosa, galaktosa, manosa, heksosa, pentosa, xilosa dan arabinosa (Mosier et al,

2005). Proses pretreatment dilakukan dengan cara basa menggunakan NaOH.

Tabel 2. Persen (%) sakarifikasi berbagai waktu inkubasi dan perlakuan awal substrat

WaktuInkubasi 24 jam 48 jam 72 jam 96 jam 120 jam

Sample % Sakarifikasi

Untreatment 0 0,8154 0,6762 0,2138 0

Pretreatment 6 jam 0,358 0,4325 0,5817 1,1783 1,1783
Pretreatment 12 jam 0,6265 0,7458 0,8353 1,1932 0,9546
Pretreatment 24 jam 1,1485 1,2678 1,417 1,76 1,3722
Pretreatment 36 jam 1,0292 1,1783 1,2976 1,6258 1,3126

Persen Sakarifikasi Pada Perlakuan Awal Substrat Limbah Pengolahan

Kertas dan Waktu Inkubasi
2
1,8
1,6
% Sakarifikasi

1,4
1,2 Untreatment
1 Pre treatment 6 jam
0,8
0,6 Pre treatment 12 jam
0,4 Pre treatment 24 jam
0,2
0 Pre treatment 36 jam

24 48 72 96 120
Waktu Inkubasi (jam)

Gambar 6 .

Kurva hubungan waktu inkubasi dan perlakuan awal substrat terhadap persen sakarifikasi

Dari hasil dapat terihat nilai persen (%) sakarifikasi lebih tinggi pada

substrat dengan pretreatment dibandingkan substrat tanpa proses pretreatment.

 34

Hal ini dikarenakan penggunaan reagen basa seperti NaOH dapat

menyebabkan pemutusan ikatan ester dan glikosidik dan pemecahan lignin dan

meningkatkan daya tembus enzim masuk ke selulosa dan hemiselulosa (Brodeur

et al, 2011). Sehingga mempermudah reaksi antara enzim dan substrat yang

mengakibatkan persen sakarifikasi yang dihasilkan lebih besar. Persentase

sakarifikasi terbesar didapatkan pada sampel yang dilakukan pretreatment selama

24 jam yaitu sebanyak 1,79 % dengan waktu inkubasi 96 jam.

Dari kurva diatas terlihat penambahan waktu inkubasi mengakibatkan

penurunan nilai persen sakarifikasi, hal ini disebabkan karena kemungkinan gula

yang dihasilkan bisa berubah menjadi produk lain dikarenakan enzim selulase

yang digunakan dalam proses sakarifikasi belum murni, sehingga dapat terjadi

reaksi lain yang tidak diketahui. Salah satu produk lanjutan yang bisa terbentuk

adalah etanol (Prasetyo et al, 2010).

Pada tahap penelitian dilakukan proses sakarifikasi dengan variasi

konsentrasi substrat sebesar 25, 50, 100, 150, dan 200 mg dan variasi konsentrasi

enzim dengan volume 2,4, dan 6 ml dengan inkubasi pada kondisi optimum yang

telah didapat dari tahapan uji pendahuluan yaitu menggunakan substrat hasil

pretreatment 24 jam, waktu inkubasi 96 jam dan suhu 37˚ C, pH 5,5.

Pada uji pengaruh variasi konsentrasi substrat didapatkan hasil persen

sakarifikasi tertinggi sebesar 1,01 %. Dari hasil dapat terlihat bahwa persen

sakarifikasi meningkat mulai dari konsentrasi substrat terendah 25 mg dan

mencapai nilai tertinggi pada konsentrasi 100 mg. Setelah titik optimum, nilai

persen sakarifikasi mengalami penurunan. Hal ini karena jika konsentrasi substrat

divariasikan, reaksi pada awal meningkat hingga mencapai maksimum dan

 35

akhirnya mengalami penurunan (Haldane, 1930). Dengan semakin bertambahnya

konsentrasi substrat dapat terlihat penurunan pada grafik sakarifikasi, hal ini

karena jumlah enzim yang semakin terbatas (Ghose dan Ray, 2010).

Hubungan konsentrasi substrat terhadap persen sakarifikasi

1,2000
1,0000 1,0143
Sakarifikasi (%)

0,8000
0,6000 0,5701
0,4000
0,2486 0,2660
0,2000
0,1392
0,0000
25 50 75 100 125 150 175 200
Substrat (mg)

Gambar 7.
Kurva hubungan antara variasi konsentrasi substrat terhadap persen sakarifikasi

Pada uji pengaruh variasi konsentrasi enzim, didapatkan hasil persen

sakarifikasi tertinggi sebesar 1,80 % pada aktivitas enzim12 Unit.

Hubungan variasi konsentrasi enzim terhadap persen sakarifikasi

2,0000
1,8097
sakarifikasi (%)

1,5000 1,5104

1,0000
0,7637
0,5000

0,0000
6 12 18
enzim (U)

Gambar 8.
Kurva hubungan antara variasi konsentrasi enzim terhadap persen sakarifikasi
 36

Enzim merupakan katalisator yang dapat mempercepat laju reaksi tanpa

ikut serta dalam reaksi tersebut. Laju reaksi enzim dipengaruh berbagai faktor

seperti konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pH, temperatur, dan inhibitor.

Konsentrasi substrat mempengaruhi laju reaksi, karena semakin banyak substrat

yang ada maka semakin banyak pula ikatan yang terjadi antara enzim dan substrat

(Chen dan Ramos, 2010).

Produk yang dihasilkan dari reaksi antara substrat dan enzim dipengaruhi

oleh kondisi dari konsentrasi enzim maupun substrat. Pada keadaan konsentrasi

enzim meningkat sedangkan konsentrasi substrat tetap, konsentrasi atau jumlah

molekul enzim lebih rendah dibandingkan jumlah molekul substrat yang akan

dikatalisis, maka produk yang dihasilkan akan sebanding dengan jumlah substrat

yang diubah oleh enzim menjadi produk. Bila jumlah enzim ditingkatkan makin

banyak substrat yang ada akan diubah menjadi produk hingga suatu ketika jumlah

enzim berlebih namun substrat habis. Akibatnya penambahan jumlah enzim tidak

akan mengubah grafik kecepatan reaksi vs konsentrasi enzim (Adhiyanto et al,

2006).

Hubungan antara konsentrasi enzim dan produk yang dihasilkan dapat

menghasilkan kurva yang tidak linear, hal ini dikarenakan bisa jadi enzim tidak

dalam keadaan murni sehingga masih terdapat senyawa-senyawa penghambat

reaksi dalam jumlah yang sangat kecil (Sadikin, 2002).

Proses sakarifikasi limbah pengolahan kertas juga menggunakan enzim

komersial Primafast 200 dan blangko ( substrat limbah pengolahan kertas tanpa

penambahan enzim selulase Bacillus sp BPPT CC RK2).

 37

Enzim komersil Primafast 200 memiliki kondisi optimum pada pH 4,5

hingga 5,5, dan temperatur 55 hingga 60° C. Proses sakarifikasi mengikuti kondisi

optimum dari enzim tersebut, yaitu pH 5,5 dan suhu 60° C. Substrat yang

digunakan adalah sebanyak 100 mg limbah hasil pretreatment dengan NaOH

selama 24 jam, dan konsentrasi enzim yang digunakan sebanyak 15,04 Unit/mg.

Pada proses sakarifikasi blangko, sebanyak 100 mg substrat hasil pretreatment

dengan NaOH selama 24 jam ditambah buffer sitrat pH 5,5 kemudian diinkubasi

pada suhu 37° C.

Dari hasil terlihat bahwa kadar gula reduksi dan persen sakarifikasi

tertinggi didapatkan dari proses sakarifikasi limbah pengolahan kertas

menggunakan enzim selulase Bacillus sp BPPT CC RK2 . Hal ini menunjukan

bahwa nilai persen sakarifikasi dengan menggunakan enzim selulase yang

diproduksi dari Bacillus sp. BPPT CC RK2 jauh lebih tinggi dibandingkan enzim

komersil dan blangko.

Kadar Gula Reduksi (mg/ml) Sakarifikasi (%)

Enzim selulase Bacillus sp 0,4022 1,80

BPPT CC RK2

Enzim Komersil Primafast 200 0,0033 0,0033

Blangko 0 0

Tabel 3. Perbandingan kadar gula reduksi dan persen sakarifikasi keseluruhan

Nilai persen sakarifikasi nol pada blangko menunjukkan bahwa tanpa ada

bantuan hidrolisis dari enzim selulase maka proses sakarifikasi tidak terjadi.
 38

Setelah mengetahui nilai persen sakarifikasi, selanjutnya dilakukan

identifikasi jenis gula menggunakan kromatografi lapis tipis dengan standar gula

pembanding menggunakan Glukosa, Xylosa, Arabinosa, Galaktosa, Maltosa, dan

Sukrosa dengan konsentrasi 5 mg/ml. Karena jenis gula dari proses sakarifikasi

awalnya tidak diketahui, maka ditotolkan berbagai standar gula pembanding untuk

mengidentifikasi jenis gula yang dihasilkan dari proses sakarifikasi.

Bercak pemisahan pada KLT umumnya merupakan bercak yang tidak

berwarna. Pada penelitian ini, untuk menampakkan bercak maka lempeng KLT

disemprot dengan reagen campuran asam sulfat dan metanol lalu dipanaskan

untuk mengoksidasi solut-solut organik yang nampak sebagai bercak hitam atau

kecoklatan (Gandjar dan Rohman, 2007).

KLT dapat digunakan untuk uji identifikasi senyawa baku. Parameter pada

KLT yang digunakan untuk identifikasi adalah Rf. Dua senyawa dikatakan identik

jika mempunyai nilai Rf yang sama jika diukur pada kondisi KLT yang sama.

Penotolan nomor satu sampai enam pada lempeng kromatografi lapis tipis

menunjukkan jenis gula standar sebagai baku pembanding. Penotolan nomor tujuh

menunjukkan sampel produk sakarifikasi limbah pengolahan kertas menggunakan

enzim selulase dari Bacillus sp BPPT CC RK2. Penotolan nomor delapan

menunjukkan blangko, yaitu substrat limbah pengolahan kertas ditambah buffer

sitrat pH 5,5 tanpa penambahan enzim selulase.

Dari perbandingan nilai Rf antara sampel dan baku pembanding gula yang

ditotolkan terlihat bahwa nilai Rf sampel adalah 0,32 cm, mendekati nilai Rf
 39

maltosa yaitu 0,33 cm, sehingga berdasarkan analisa kromatografi lapis tipis,

produk akhir sakarifikasi diperkirakan mengandung Maltosa.

Rf Xilosa 3,5/8
Jarak rambat
= 0,56 cm
pelarut 8 cm

Rf Arabinosa Rf Glukosa
3,9/8 = 0,48 cm 3,5/8 = 0,43 cm
Rf Galaktosa
3,5/8 = 0,43cm
Rf Sukrosa Rf Sampel
3,1/8 = 0,38 cm 2,6/8 = 0,32 cm

Rf Maltosa
2,7/8 = 0,33 cm

1 2 3 4 5 6 7 8
( Ket: 1= Sukrosa; 2= Arabinosa; 3= Galaktosa; 4= Xilosa; 5= Maltosa;
6=Glukosa; 7= Sampel; 8= Blangko {limbah pengolahan kertas + buffer, tanpa
enzim selulase} )
Gambar 9. Analisa produk akhir sakarifikasi dengan KLT
Namun, berdasarkan literatur, seharusnya jenis gula terbanyak yang

dihasilkan dari proses sakarifikasi selulosa adalah glukosa (Sukumaran et al,

2005). Maltosa (C12H22O11) merupakan gabungan 2 unit glukosa yang terhubung

dengan ikatan 1,4 glikosidik. Hal ini menunjukkan bahwa proses sakarifikasi yang

terjadi belum sempurna, sehingga masih diperlukan hidrolisis kembali untuk

memecah maltosa menjadi glukosa.Ini dapat disebabkan karena aktivitas enzim

yang dihasilkan sangatlah kecil, sehingga hidrolisis selulosa menjadi glukosa

belum sempurna.
 40

Pada penotolan blangko dapat terlihat tidak ditemukan bercak, hal ini

menunjukkan bahwa pada limbah pengolahan kertas tanpa penambahan enzim

selulase tidak terjadi proses sakarifikasi menjadi molekul gula dikarenakan tidak

adanya interaksi antara enzim dan substrat untuk menghasilkan produk.

 41

BAB VI

KESIMPULAN DAN SARAN

6.1 Kesimpulan

1. Enzim selulase yang dihasillkan Bacillus sp. BPPT CC RK2 dapat

melakukan sakarifikasi limbah pengolahan kertas. Konsentrasi enzim dan

substrat mempengaruhi persen sakarifikasi. Persen sakarifikasi tidak

berbanding lurus dengan peningkatan konsentrasi enzim dan substrat.

2. Berdasarkan analisa dengan kromatografi lapis tipis, jenis gula yang

dihasilkan dari proses sakarifikasi limbah pengolahan kertas dengan

menggunakan enzim selulase dari Bacillus sp BPPT CC RK2 diperkirakan

adalah maltosa.

6.2 Saran

1. Perlu dilakukan optimasi konsentrasi enzim dan substrat untuk

menghasilkan persen sakarifikasi yang maksimum.

2. Perlu dilakukan optimasi waktu sakarifikasi untuk menghasilkan persen

sakarifikasi yang maksimum.

3. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengkarakterisasi produk

yang dihasilkan.
 42

DAFTAR PUSTAKA

Abun. 2006. Bioproses Limbah Udang Windu Melalui Tahapan Deproteinasi Dan
Demineralisasi Terhadap Protein Dan Mineral Terlarut. Fakultas Peternakan
Universitas Padjajaran: Bandung

Adhiyanto,C. 2006. Pemanfaatan Tentang Enzim dan Manfaatnya dalam Bidang

Biomedik. UIN Jakarta Press : Jakarta hal 1, hal 115-120.

Anindyawati, Trisanti. 2010. Potensi selulase dalam Mendegradasi Lignoselulosa

Limbah Pertanian untuk Pupuk Organik. Berita Selulosa, Vol. 45, No. 2,
Desember : 70 – 77

Ariffin, H., Abdullah, N., Kalsom, M.S., Shirai,Y and Hassan, M.A. 2006.
Production and Characterisation of Cellulase by Bacillus Pumilus Eb3.
International Journal of Engineering, 3(1), pp.47-53.

Bakti, C. P. 2011. Optimasi Produksi Enzim Selulase Dari Bacillus sp. BPPT CC RK2
dengan Variasi pH dan Suhu Menggunakan Response Surface Methodology.
Universitas Indonesia: Depok

Begum S.F., Savitha, C., Jaison, J.P. 2012. Utilization of Banana Waste for
Effective Production of Cellulase by Rhizopus Sp. Research Journal of
Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. Volume 3 issue 1.p 674-
683

Bradford, M. 1976. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of

Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye
Binding. Analytical Biochemistry (72), p 248-254

Brodeur, G., Yau, E., Badal, K., Collier, J., Ramachandran, K.B and
Ramakhrisnan, S. 2011. Chemical and Physicochemical Pretreatment of
Lignocellulosic Biomass: A Review. SAGE - Hindawi Access to Research
Enzyme Research. p 1-17

Brown, R.M. Jr. 1996. The biosynthesis of cellulose. J. Macromol. Sci. Pure Appl.
Chem. A33. P 1345-1373. In Saxena, I.M and Brown, R.M.Jr. 2008.
Biochemistry and Molecular Biology of Cellulose Biosynthesis in Plants:
Prospects for Genetic Engineering. Advances in Plant Biochemistry and
molecular Biology, Volume 1. Elsevier

Chen, T and Ramos, J. 2010. Enzyme Kinetics [application of uv-vis

spectrometry].

Cheng, C. Sung, C. Hsieh, P.H. 2010. On-line desalting and carbohydrate

analysis for immobilized enzyme hydrolysis of waste cellulosic biomass by
 43

column-switching high-performance liquid chromatography. Journal of

Chromatography A, 1217 (2010) P. 2104–2110

Chisti, Y. 1999. Fermentation (Industrial) Basic Consideration.p 663-674 dalam

Encyclopedia of Food Microbiology, Robinson, R, Batt dan Patal, P.
Academic Press: London

Chojnacka, K. 2006. Fermentation Product. Chemical Engineering and Chemical

Process Technology Vol V dalam Encyclopedia of Life Support Systems
(EOLSS).

Dashtban, M., Maki, M., Leung, Kam Tin., Mao, C., Qin, W.2010. Cellulase
Activities in Biomass Convertion: Measurement Methods and Comparison.
Critical Reviews in Biotechnology.Informa Health Care. P 1-8

Demers, A., Doane, R., Guzman, S., Pagano, R. 2009. Enzymatic Hydrolysis of
Cellulosic Biomass for the Production of Second Generation
Biofuels.Worcester Polytechnic Institute. P 1-29

Bai, S. Kumar, M.R. Kumar, D.J. Mukesh. Balashanmugam, P. Balakumaran,

M.D. Kalaichelvan, P.T. 2012. Cellulase Production by Bacillus subtilis
isolated from Cow Dung. Archives of Applied Science Research, 2012, 4
(1):269-279

El-Safey. M. 2006. Introduction to Bacterial taxonomy.

Fengel, D. and G. Wegener. 1984. Wood: Chemistry, Ultrastructure, Reactions.

Walter de Gruyter & Co., Berlin dalam Hermiati, E. 2010. Pemanfaatan
biomassa lignoselulosa ampas tebu untuk produksi bioetanol. Jurnal Litbang
Pertanian, 29(4), Hal 121-130

Galbe, M and Zacchi, G. 2002. A Review of the Production of Ethanol from

Softwood. Appl Microbiol Biotechnol (2002) 59:618–628

Ghose, T.K. 1987. Measurement of Cellulase Activities. Pure & Appl. Chem.,
Vol. 59, No. 2, P. 257—268

Ghosh, B and Ray, R.R. 2010. Saccharification of Raw Native Starches by

Extracellular Isoamylase of Rhyzopus Oryzae. Biotechnology:9 (2) P 224-
228.

Gusakov, A.V., Kondratyeva, E.G., Sinitsyn, A.P. 2011. Comparison of Two

Methods for Assaying Reducing Sugars in the Determination of
Carbohydrase Activities. Hindawi Publishing Corporation International
Journal of Analytical Chemistry. Volume 2011

Haldane, J.B.S. 1930. Enzymes. University College: London

 44

Handbook of Pharmaceutical Excipients.–5th ed. 2006. edited by Raymond C.

Rowe, Paul J. Sheskey, Siaˆn C. Owen. Pharmaceutical Press. American
Pharmacists Association. P 744

Hidayat, N dan Suhartini S. 2010. Mikrobiologi Industri. Jurusan Teknologi

Industri Pertanian. Universitas Brawijaya Malang

Gandjar, I.G dan Rohman, A . 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta:

Pustaka Pelajar. Hal 378-388

Karmakar, M and Ray, R.R. 2011. Saccharification of agro wastes by the

Endoglucanase of Rhizopus oryzae. Annals of Biological Research, 2011, 2
(1) : P 201-208

Kondo T., Kasai, W., and Brown, R. M. Jr. 2004. Formation of Nematic Ordered
Cellulose and Chitin. Cellulose (11), P 463- 474 in Saxena, I.M and Brown,
R.M.Jr. 2008. Biochemistry and Molecular Biology of Cellulose Biosynthesis
in Plants: Prospects for Genetic Engineering. Advances in Plant
Biochemistry and molecular Biology, Volume 1. Elsevier

Kristensen, JB. 2009. Enzymatic hydrolysis of lignocellulose Substrate

interactions and high solids loadings. Forest and Landscape Research

Kumar, P., Barret, D.M., Delwiche, M.J and Stroeve,P. 2009. Methods for
Pretreatment of Lignocellulosic Biomass for Efficient Hydrolysis and Biofuel
Production. Ind. Eng. Chem. Res., Vol. xxx, No. xx, XXXX

Laser, M., Schulman, D., Allen, S., Lichwa, J., Antal, M., and Lynd, L. 2002. A
Comparison of Liquid Hot Water and Steam Pretreatment of Sugarcane
Bagasse for Bioconversion to Ethanol. Bioresource Technology, 81. 33-44. In
Thakur, I,S. and Nakagoshi, N. 2011. Production of Biofuels from
Lignocellulosic Biomass in Pulp and Paper Mill Effluent for Low Carbon
Society. Journal of International Development and Cooperation, Vol 18,No.
I.P 1-12

Lin,Y and Tanaka, S. 2006. Ethanol fermentation from biomass resources:

current state and prospects. Applied Microbiology and Biotechnology.
69(6):627-642 in Abdel-Rahman, M.A. Tashiro, Y. Sonomoto, K. 2011.
Lactic acid production from lignocellulose-derived sugars using lactic acid
bacteria: Overview and limits. Journal of Biotechnology 156 (2011) pp 286–
301

Lo, Yun-Chung., Saratale, G.D., Chen, Wen-Ming., Bai, Ming-Der., Chang, Jo-
Shu. 2009. Isolation of cellulose-hydrolytic bacteria and applications of the
cellulolytic enzymes for cellulosic biohydrogen production. Enzyme and
Microbial Technology 44 (2009) 417–425
 45

Maki,M., Leung K,T., Qin, W. 2009. The prospects of cellulase-producing

bacteria for the bioconversion of lignocellulosic biomass. International
Journal of Biological Sciences 2009; 5(5):500-516

Marssada, Agung. 2011. Optimasi Produksi Selulase Dari Bacillus sp. Bppt CC RK 2
Menggunakan Metode Respon Permukaan dengan Variasi Rasio C/N Dan Waktu
Fermentasi. Universitas Indonesia.

Miller, G.L., 1959. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of

Reducing Sugar. Analytical Chemistry, 31(3), pp.426-428.

Mosier, N., Wyman, C., Dale, B., Elander, R., Lee, Y.Y., Holtzapple and Ladisch,
M. 2005. Features of promising technologies for pretreatment of
lignocellulosic biomass. Bioresource Technology 96 (2005) P 673–686

Mrudula, S and Murugammal, R. 2011. Production of cellulase by Aspergillus

niger under submerged and solid state fermentation using coir waste as a
substrate. Brazilian Journal of Microbiology.2011. 42. P 1119-1127

Mussatto, S.I. and Teixeira, J.A., 2010. Lignocellulose as raw material in

fermentation processes. Applied Microbiology and Microbial Biotechnology,
P.897-907.

Nigam,P.S., Gupta, N., Anthwal, A. 2009. Pre-treatment of Agro-Industrial

Residues in Biotechnology for Agro-Industrial Residues Utilisation. Springer.
P.16

Octavia, S. Soerawidjaja, T.H., Purwadi, R., Putrawan, I.D.G Arsa. 2011.

Pengolahan Awal Lignoselulosa Menggunakan Amoniak untuk Meningkatkan
Perolehan Gula Fermentasi. Prosiding Seminar Nasional Teknik Kimia,
“Pengembangan Teknologi Kimia untuk Pengolahan Sumber Daya Alam
Indonesia”. Yogyakarta. ISSN 1693-4393

O'Sullivan, A. C. 1997. Cellulose: The Structure Slowly Unravels. Cellulose ,4.

173-207. In Saxena, I.M and Brown, R.M. Jr. 2008. Biochemistry and
Molecular Biology of Cellulose Biosynthesis in Plants: Prospects for Genetic
Engineering. Advances in Plant Biochemistry and molecular Biology,
Volume 1. Elsevier

Prasetyo, J., Kato, T., and Park Enoch.Y. 2010 Efficient Cellulase-Catalyzed
Saccharification of Untreated Paper Sludge Targeting for Biorefinery.
Biomass and Bioenergy 34 (2010). P 1906-1913

Ramanathan, T., Ahmad, A., Ahmad, A.S., Kalimutho, M. 2011. Taxonomical

Identity and Polysaccharide Produced by Bacillus Species Isolated From Old
Aged Medicinal Decoctions. Journal of Sustainability Science and
Management Volume 6 Number 1, June 2011: P 2-9
 46

Sadikin, Mohamad. 2002. Biokimia Enzim. Widya Medika: Jakarta

Schallmey, M., Singh, A., Ward.O,P. 2004. Development in the Use of Bacillus
spesies for Industrial Production. Can. J. Microbiol. Vol 50 p 1-17

Scopes, Robert. 2002. Enzyme Activity and Assays. Encyclopedia of Life Sciences

Stahl, Egon. 1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopis.

Terjemahan dari :Drug Analysis by Chromatography and Microscopy : a
Practical Supplement to Pharmacopoias. Kosasih Padmawinata dan Iwang
Sudiro. Penerbit ITB Bandung

Sukumaran, R.K., Singhania, R.R. and Pandey, A. 2005. Microbial Cellulases -

Production, Applications and Challenges. Journal Scientific & Industrial
Research, 64 (November), pp.832-844.

Sun,Ye and Cheng, Jiayang. 2002. Hydrolysis of Lignocellulosic Materials for

Ethanol Production : a Review. Bioresource Technology (83) p 1-11

Tewari, Rupinder. 2007. Food and Industrial Microbiology. Department of

Biotechnology Panjab University

Thakur, I.S. and Nakagoshi, N. 2011. Production of Biofuels from Lignocellulosic

Biomass in Pulp and Paper Mill Effluent for Low Carbon Society. Journal of
International Development and Cooperation, Vol 18,No. I.P 1-12

Toledo,V.D.A.A.D., Takasusuki, M.C.C.R., Oliveira, A.J.B.D., Chambo, E.D and

Lopes, S.M.S. 2012. Spectrophotometry as a Tool for Dosage Sugars in
Nectar of Crops Pollinated by Honeybees. Dalam Macro To Nano
Spectroscopy Edited by Dr. Jamal Uddin. Intech. p 269-290

Vollhardt, P and Schore, N. 2009. Organic chemistry : structure and function ,6th
ed. W. H. Freeman and Company: USA. P 1117

Vynios, D.H., Papaioannon, D.A., Filos,G., Karigiannis, G., Tziala, T., Lagios, G.
2009. Enzymatic Production of Glucose From Waste Paper. Bioresources 4
(2) p 509-521

Yin, L.-J. et al., 2010. Purification and Characterization of a Cellulase from

Bacillus subtilis YJ1. Journal of Marine Science and Technology, Vol. 18,
No. 3, pp. 466-471 (2010)

Zhang , P.Y.H., Himmel M.E., and Mielenz J.R. 2006. Outlook for cellulase
improvement: Screening and selection strategies. Biotechnology Advances
24 (2006) 452–481

http:// invivo.flocruz.br/cell/oficina.htm . Gambar bakteri Bacillus sp. Diunduh

pada tanggal 15 September 2012
 47

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK7699/bacillus. Turnbull, Peter CB. 1996.

Medical Microbiology. 4th edition. Editor Baron S, Galveston (TX):
University of Texas Medical Branch at Galveston diunduh pada tanggal 15
September 2012
 48

LAMPIRAN
 49

Cara pembuatan reagen
No. Nama Reagen dan buffer
1. Natrium Hidroksida 1 N
2. Natrium Hidroksida 5 N
3. Buffer Phosfat 0,1 M pH 7
Lampiran 1
Cara pembuatan
Sebanyak 4 gram natrium hidroksida
dilarutkan dalam aquades hingga tepat 100 mL
Sebanyak 20 gram natrium hidroksida
dilarutkan dalam aquades hingga tepat 100
mL.
Larutan A= Sebanyak 2,78 gram NaHPO4
dilarutkan dalam aquades hingga tepat 100
mL.
Larutan B = Sebanyak 3,56 gram
Na2HPO4.2H2O dilarutkan dalam aquades
hingga tepat 100 mL.

19,5 ml Larutan A dicampurkan dengan 30,5

ml larutan B dilarutkan dalam aquades hingga
tepat 100 mL. pH 7
4. Buffer Phosfat 0,05 M pH Sebanyak 50 ml Buffer Phosfat 0,1 M dipipet
7 kemudian ditambahkan aquadest hingga tepat
100 ml
5. CMC 1% dalam Buffer Sebanyak 1 gram CMC dilarutkan dalam 10
Phosfat 0,05 M pH 7 ml Buffer Phosfat 0,05 M pH 7
6. Pereaksi DNS Larutan A = Sebanyak 10 gram dinitrosalisilat
acid ditambah 10 gram natrium hidroksida dan
2 gram fenol kemudian dilarutkan dalam
MiliQ hingga tepat 250 mL.
Larutan B= Sebanyak 200 g Natrium Kalium
Tartrat ditambahkan 0,5 gram natrium sulfit
kemudian dilarutkan dalam MiliQ hingga
tepat 250 mL.

Larutan A dicampurkan dengan larutan B

kemudian ditambahkan miliQ hingga tepat
1000 ml
7. Asam sulfat 0,005 N Sebanyak 0,140 mL asam sulfat dicampurkan
dalam aquades hingga tepat 1000 mL.
8. Asam sulfat 10% dalam Sebanyak 2 ml asam sulfat ditambahkan 18 ml
metanol metanol hingga tepat 20 ml
9. Pereaksi Bradford Sebanyak 100 mg Coomassie Blue G-250
dilarutkan dalam 50 ml ethanol 95%. Larutan
ini kemudian dicampurkan dengan 100 ml
asam fosfat 85% dan diencerkan sampai
volume 1 L dengan aquadest. Konsentrasi
akhir reagent ini 0.01% Coomassie Brilliant
Blue G-250, 4.7% ethanol, dan 8.5% asam
fosfat
 50

Lampiran 2.

Pembuatan medium

No. Nama medium Cara Pembuatan

1. Medium Luria Bertani Sebanyak 0,5 gram natrium klorida, 0,5
yeast extract dan 1 gram pepton dilarutkan
dalam volume tertentu aquades, diatur pH
sampai 7,0, lalu dicukupkan hingga tepat
100 mL.
2. Medium Luria Bertani Sebanyak 0,5 gram natrium klorida, 0,5
agar yeast extract dan 1 gram pepton dilarutkan
dalam volume tertentu aquades, diatur pH
sampai 7,0,ditambahkan 2 gram agar,
diaduk hingga homogen, lalu dicukupkan
hingga tepat 100 mL.
3. Medium Luria Sebanyak 2,5 gram natrium klorida, 100 ml
Bertani+Dedak Padi 40 % air kelapa, 5 gram pepton, dan 200 gram
+ Air kelapa 20 % dedak padi dilarutkan dalam volume
tertentu aquades, diatur pH sampai 7,0,
diaduk hingga homogen, lalu dicukupkan
hingga tepat 500 mL

Pembuatan Media

Pembuatan Media Kultivasi Bakteri

Media kultivasi yang digunakan adalah Luria Bertani (LB) cair dengan

komposisi per liter yaitu, 10g pepton, 5g ekstrak khamir, dan 5g NaCl. LB

ditambahkan dengan 1% Selulosa. Media dilarutkan dengan akuades. Kemudian

media disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121oC dan tekanan 1,2 atm selama

15 menit.

Proses Penyiapan Stok Kultur

Isolat Bacillus sp. BPPT CC RK2 diinokulasikan sebanyak 1-2 ose ke

dalam media LB agar dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Isolat ini

digunakan sebagai stok kultur penelitian.

 51

Pembuatan Media Produksi Enzim

Media produksi dibuat sebanyak 500 ml. Media produksi mengandung

40% dedak beras sebagai sumber karbon dan air kelapa 20 % sebagai sumber

nitrogen. Media dilarutkan dengan volum tertentu akuades, diatur pH sampai 7,0.

Ditambahkan hingga volume akuades tepat 500 mL. Kemudian media disterilisasi

dalam autoklaf pada suhu 121°C dan tekanan 1,2 atm selama 15 menit

(Marsadda, 2011).

Pembuatan Starter

Media starter dibuat dengan menginokulasikan sebanyak 1-2 ose isolat

Bacillus sp.ke dalam media LB standar (10% media produksi), kemudian

diinkubasi pada suhu 37oC selama 6 jam dengan agitasi 150 rpm.

Produksi Enzim Selulase

Produksi enzim selulase dilakukan dengan menginokulasikan media starter

ke dalam media produksi, dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam dengan

agitasi 150 rpm. Setelah 24 jam, enzim disentrifugasi pada agitasi 6000 rpm

selama 15 menit pada suhu 4oC. Kemudian diambil supernatannya sebagai fraksi

enzim selulase kasar. Enzim selulase kasar tersebut kemudian dianalisis kadar

protein dan aktivitas enzimnya

 52

Lampiran 3

Pembuatan Kurva Standar Glukosa dan Kurva Standar BSA

Pembuatan Kurva Standar Glukosa

Pembuatan kurva standar glukosa dilakukan dengan membuat variasi

konsentrasi standar glukosa sebagai berikut: 0; 0,04; 0,08; 0,12; 0,16; 0,20; 0,20;

0,24; 0,28; 0,32 mg/ml

Glukosa tersebut dilarutkan dalam larutan buffer fosfat 0,05 M, pH 7.0.

Kandungan glukosa dalam larutan tersebut diuji dengan metode DNS

(Miller,1959). Kurva standar glukosa adalah grafik hubungan konsentrasi glukosa

dengan nilai absorbansi pada panjang gelombang 540 nm.

Pembuatan Kurva Standar BSA

Pembuatan kurva standar BSA dilakukan dengan membuat variasi

konsentrasi standar BSA sebagai berikut : 0; 0,03; 0,06; 0,09; 0,12; 0,15; 0,18;

0,21; 0,24 mg/ml.

BSA dilarutkan dalam mili-Q-water (ddH2O). Kandungan protein pada

larutan yang dibuat diuji dengan metode Bradford. .Konsentrasi analit berfungsi

sebagai sumbu X pada grafik dan absorbansi sebagai sumbu Y, sehingga akan

diperoleh suatu garis linear dengan gradien tertentu.

Bouvine Serum Albumin (BSA) mengandung 1mg/mL protein dalam

buffer phosfat 0,05 M pH 7.0.

 53

Lampiran 4

Kurva Standar Glukosa

C(mg/ml) Absorbansi
0 0
0,04 0,1465
0,08 0,297
0,12 0,4475
0,16 0,4965
0,2 0,6455
0,24 0,6775
0,28 0,808
0,32 0,951

Kurva Standar Glukosa

1,2

1 y = 3,0178x
R² = 0,9782
0,8
absorbansi

0,6

0,4

0,2

0
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3
konsentrasi (mg/ml)
 54

Lampiran 5

Kurva Standar BSA

C(mg/ml) Absorbansi
0 0
0,03 0,156
0,06 0,3185
0,09 0,37
0,12 0,5415
0,15 0,6505
0,18 0,728
0,21 0,8865
0,24 0,965

Kurva Standar BSA

1,2
y = 4,1855x
1 R² = 0,9886

0,8
Absorbansi

0,6

0,4

0,2

0
0 0,05 0,1 0,15 0,2
Kadar protein (mg/ml)
 55

Lampiran 6

Metoda Pengujian Aktivitas Enzim Selulase dan Kadar Protein

a. Pengujian Aktivitas Selulase

Pengujian aktivitas selulase yang dilakukan pada percobaan ini adalah

melakukan pengujian terhadap endo β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4) atau yang biasa

disebut sebagai CMCase. Aktivitas CMCase diukur dengan menggunakan metode

yang dilakukan oleh Yin et al (2010), yaitu dengan mereaksikan sampel dalam

larutan 1 mL CMC 1%, buffer fosfat 0,05 M (pH 7.0) di mana volume sampel

enzim 100 μl, dan volume pelarut 900 μl. Reaksi berlangsung selama 30 menit

dan diinkubasi pada suhu 500C. Gula turunan yang dihasilkan dari reaksi tersebut

ditentukan dengan metode DNS (Miller, 1959) yaitu dilakukan penambahan

larutan DNS sebanyak 3 mL pada tabung reaksi. Tabung reaksi berisi larutan

dipanaskan didalam waterbath selama 5 menit agar terjadi reaksi antara glukosa

dengan DNS. Tabung reaksi didinginkan kemudian dikocok agar bercampur.

Sebagai kontrol yaitu 900 μl CMC 1%, buffer fosfat 0,05 M (pH 7.0) diinkubasi

pada suhu 500C selama 30 menit baru kemudian ditambahkan 100 μl enzim lalu

ditambahkan 3ml DNS dan dipanaskan didalam waterbath selama 5 menit .

Perlakuan sampel dan kontrol dilakukan dalam waktu yang bersamaan.

Absorbansi diukur pada panjang gelombang 540 nm menggunakan

spektrofotometer UV Visible.

Harga absorbansi yang diperoleh dari sampel dan kontrol, diplotkan pada

kurva standar glukosa untuk mengetahui konsentrasi gula reduksi. Konsentrasi

gula reduksi diperoleh dari selisih plot absorbansi (sampel- kontrol) pada kurva

standar glukosa.
 56

Aktivitas selulase dihitung menurut persamaan

mg glukosa ×1000
Aktivitas ( U ml)=
Mr glukosa ×30 menit ×0.1 ml

b. Penentuan Kadar Protein

Kadar protein diukur menggunakan metode yang dilakukan oleh Y.C Lo et

al 2009 dengan metoda Bradford. Pengukuran kadar protein dilakukan dengan

modifikasi, yaitu sebanyak 30 µl sample dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu

ditambahkan 1,5 ml pereaksi Bradford. Kemudian larutan diaduk dengan vortex

perlahan untuk mencegah terbentuknya busa, analit diinkubasi selama 20 menit

pada suhu ruang. Blangko menggunakan ddH2O sebanyak 30µl. Absorbansi

diukur pada panjang gelombang 595 nm menggunakan spektrofotometer UV

Visible.
 57

Lampiran 7

a. Perhitungan Uji Aktivitas Selulase

Nama zat Absorbansi Rata-rata absorbansi

Sampel 0,674 0,691 0,690 0,685

Kontrol 0,129 0,179 0,099 0,136

Faktor pengenceran (Fp) = 10

Kadar gula reduksi sample => y = 3,017 x

0,685 = 3,017 x

x = 0,2270 mg

Kadar gula reduksi kontrol => y = 3,017 x

0,136 = 2,9576 x

x = 0,0450 mg

Konsentrasi gula reduksi = 0,2270 – 0,0450 = 0,1821 mg

mg glukosa ×1000
Aktivitas ( U ml) = x Fp
Mr glukosa ×30 menit ×0.1 ml

0,1821 ×1000
= x 10 = 0,337 x 10
180 ×30 menit ×0.1 ml

= 3,37 U/ml
 58

Lampiran 8

Perhitungan Uji Kadar Protein

Nama zat Absorbansi Rata-rata absorbansi

Sampel 0,934 1,284 1,038 1,161

Kontrol 0,221 0,220 0,219 0,220

Y = 4,185 x

( 1,161 – 0,220 ) = 4,185 x

0,941 = 4,185 x

X = 0,2248 mg/ml
 59

Lampiran 9

Aktivitas Enzim Selulase yang Digunakan:

Aktivitas Enzim (U/ml) Volume Aktivitas Total

Enzim (ml) (aktivitas enzim x volume )

2 6 Unit (pembulatan)

3,37 U/ml 4 12 Unit (pembulatan)

6 18 Unit (pembulatan)

Aktivitas Spesifik

Aktivitas spesifik (U/mg) = Aktivitas Selulase

Kadar Protein
= 3,37/0,224
= 15,04 U/mg
 60

Lampiran 10

Penentuan Persen Sakarifikasi Limbah Pengolahan Kertas

Untuk menentukan persen sakarifikasi , harus terlebih dahulu diketahui

kadar gula reduksi (dari kurva standar). Pengukuran kadar gula reduksi ditentukan

berdasarkan metode DNS, yaitu dengan mengambil 1 ml sampel (dari total

volume 5 ml) dari campuran 100 mg limbah pengolahan kertas ,12 U enzim

selulase (4 ml) dan 1 ml buffer sitrat 5,5 yang kemudian ditambahkan ke dalam 3

ml DNS, selanjutnya dipanaskan didalam waterbath selama 5 menit. Setelah itu

didinginkan pada suhu ruangan, Sebagai kontrol yaitu buffer sitrat pH 5,5

ditambah 12 U enzim selulase ( 4 ml) lalu ditambahkan 3ml DNS dan dipanaskan

didalam waterbath selama 5 menit . Perlakuan sampel dan kontrol dilakukan

dalam waktu yang bersamaan. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 540

nm menggunakan spektrofotometer UV Visible (Miller, 1959).

Harga absorbansi yang diperoleh dari sampel dan kontrol, diplotkan pada

kurva standar glukosa untuk mengetahui konsentrasi gula reduksi. Konsentrasi

gula reduksi diperoleh dari selisih plot absorbansi (sampel- kontrol) pada kurva

standar glukosa.

Untuk menentukan persen sakarifikasi dapat dihitung dengan rumus

(Begum& Alimon, 2011) :

Sakarifikasi (%) = Jumlah gula reduksi (mg/ml) x 0,9 x 100

Substrat (mg/ml)
 61

Lampiran 11

Metoda Perlakuan Awal Substrat Limbah Pengolahan Kertas

a. Pretreatment substrat

Sebanyak 5 gram substrat limbah pengolahan kertas ditambah 100 ml

NaOH 1N dalam erlenmeyer dibiarkan selama 6, 12, dan 24 jam. Kemudian

larutan disaring menggunakan kain nilon dan dicuci dengan air yang mengalir

hingga pH netral, setelah itu substrat hasil pretreatment dikeringkan selama 12

jam dalam oven suhu 80˚ C. Dari hasil perlakuan, diambil sebanyak 100 mg

substrat limbah pengolahan kertas kemudian dicampur dengan 1 ml larutan buffer

phosfat 0,05 M pH 7 lalu ditambahkan enzim selulase kasar dengan variasi

konsentrasi enzim dengan aktivitas 6,12,18 unit kemudian diinkubasi selama 96

jam pada suhu 50˚ C. Kadar gula reduksi dihitung dengan menggunakan metoda

DNS (Miller, 1959) dan persen (%) sakarifikasi (Begum dan Alimon 2011).

b. Perlakuan substrat tanpa pretreatment

Sebanyak 5 gram substrat limbah pengolahan kertas basah dikeringkan 12

jam dalam oven suhu 80˚C. Dari hasil perlakuan, diambil sebanyak 100 mg

substrat limbah kertas kemudian dicampur dengan 1 ml larutan buffer phosfat

0,05 M pH 7 lalu ditambahkan enzim selulase kasar dengan variasi konsentrasi

enzim dengan aktivitas 6,12,18 unit kemudian diinkubasi selama 96 jam pada

suhu 50˚ C. Kadar gula reduksi dihitung dengan metoda DNS (Miller, 1959) dan

persen (%) sakarifikasi (Begum dan Alimon 2011).

 62

Lampiran 12

 Hasil uji pendahuluan perlakuan awal subtrat (waktu inkubasi 96 jam, pH 7 suhu

50˚ C):

Substrat ∑ Abs ∑ Abs Konsentrasi Konsentrasi Kadar gula reduksi

sampel kontrol sampel kontrol (sampel –kontrol)

A 0,685 0,670 0,2269 0,2222 0,0475

B 0,671 0,592 0,2224 0,1962 0,2618
C 0,712 0,632 0,2360 0,2095 0,2652
D 0,79 0,672 0,2618 0,2227 0,3911
E 0,801 0,692 0,2655 0,2294 0,3613
Ket :
A= Untreatment (tanpa penambahan NaOH);
B= Pretreatment 6 jam dengan NaOH;
C= Pretreatment 12 jam dengan NaOH;
D= Pretreatment 24 jam dengan NaOH;
E= Pretreatment 36 jam dengan NaOH

Perlakuan Substrat Persen Sakarifikasi (%)

Untreatment (tanpa penambahan NaOH) 0,2138

Pretreatment 6 jam dengan NaOH 1,1783

Pretreatment 12 jam dengan NaOH 1,1932

Pretreatment 24 jam dengan NaOH 1,76

Pretreatment 36 jam dengan NaOH 1,6258

 63

Lampiran 13

Perhitungan Uji Variasi Konsentrasi Substrat

 Tabel kadar gula reduksi dan persen (%) sakarifikasi pada uji variasi konsentrasi

substrat (waktu inkubasi 96 jam, pH 5,5 suhu 37˚ C dengan jumlah 4 ml enzim

ditambah 1 ml buffer (Begum dan Alimon, 2011 dengan modifikasi ):

Substrat (mg) ∑ Abs ∑ Abs Konsentrasi Konsentrasi Kadar gula reduksi

sampel kontrol Sampel Kontrol (sampel –kontrol)

25 0,682 0,680 0,2262 0,2254 0,0077

50 0,687 0,678 0,2276 0,2248 0,0276
100 0,726 0,658 0,2406 0,2181 0,2254
150 0,717 0,659 0,2375 0,2185 0,1900
200 0,696 0,660 0,2306 0,2188 0,1182

Substrat Kadar Gula Reduksi % Sakarifikasi

(mg)

25 0,0077 0,1392
50 0,0276 0,2486
100 0,2254 1,0143
150 0,1900 0,5701
200 0,1182 0,2660
 64

Hubungan Konsentrasi substrat terhadap % Sakarifikasi

1,2000

1,0000 1,0143
% Sakarifikasi
0,8000

0,6000 0,5701
0,4000
0,2486 0,2660
0,2000
0,1392
0,0000
25 50 75 100 125 150 175 200
Substrat (mg)

Gambar .Kurva hubungan antara variasi konsentrasi substrat terhadap persen sakarifikasi
 65

Lampiran 14
Perhitungan Uji Variasi Konsentrasi Enzim

 Tabel kadar gula reduksi dan persen (%) sakarifikasi pada uji variasi konsentrasi

enzim dengan waktu inkubasi 96 jam, pH 5,5 suhu 37˚ C, substrat 100 mg

(Begum dan Alimon, 2011 dengan modifikasi ):

Enzim (ml) ∑ Abs ∑ Abs Konsentrasi Konsentrasi Kadar gula reduksi

sampel kontrol Sampel kontrol (sampel –kontrol)

2 0,746 0,661 0,2474 0,2191 0,2828

4 0,795 0,673 0,2634 0,2232 0,4022
6 0,700 0,627 0,2319 0,2079 0,2398

Enzim (ml) Kadar Gula % Sakarifikasi

Reduksi

2 0,2828 0,7637
4 0,4022 1,8097
6 0,2398 1,5104

Hubungan variasi konsentrasi enzim terhadap persen

sakarifikasi

2,0000
1,8097
sakarifikasi (%)

1,5000 1,5104

1,0000
0,7637
0,5000

0,0000
6 12 18
enzim (U)

Gambar. Kurva hubungan antara variasi konsentrasi enzim terhadap persen sakarifikasi
 66

Lampiran 15

Analisa produk akhir sakarifikasi dengan kromatografi lapis tipis

Perhitungan :

Rf = Jarak titik pusat bercak dari titik awal

Jarak garis depan dari titik awal

Hasil :

 Rf Galaktosa = 3,5/8

= 0,43

 Rf Sukrosa = 3,1/8

= 0,38

 Rf Arabinosa = 3,9/8

= 0,48

 Rf Xilosa = 3,5/8

= 0,56

 Rf Glukosa = 3,7/8

= 0,46

 Rf Maltosa = 2,7/8

= 0,33

 Rf Sampel = 2,6/8

= 0,32
 67

Lampiran 16

Data Pembanding
1. Sakarifikasi Limbah Pengolahan Kertas dengan Enzim Komersial
 Nama : Primafast 200
 Aktivitas enzim : 6200 U/ml
 Kondisi optimum : pH 4,5-5,5 Temperatur 55-60° C

Waktu ∑ Abs ∑ Abs Konsentrasi Konsentrasi Kadar gula reduksi

(jam) sampel kontrol sampel kontrol (sampel –kontrol)

0 jam 0,730 0,7 0,242 0,232 0,0983

24 jam 0,706 0,643 0,234 0,213 0,2088
48 jam 0,732 0,704 0,243 0,233 0,0934
72 jam 0,704 0,684 0,233 0,227 0,0679
96 jam 0,705 0,704 0,234 0,233 0,0033

Waktu Kadar Gula Reduksi (mg/ml) % Sakarifikasi

(jam)

0 0,0983 0,0973
24 0,2088 0,2067
48 0,0934 0,0924
72 0,0679 0,0673
96 0,0033 0,0033
 68

% Sakarifikasi Enzim Komersil Primafast 200

0,3
% Sakarifikasi 0,2 0,207
0,2
0,1 0,097 0,092
0,067
0,1
0,0 0,003
0 24 48 72 96
Waktu (Jam)

2. Blangko (Substrat + Buffer sitrat pH 5,5)

Waktu (jam) Kadar Gula Reduksi (mg/ml) % Sakarifikasi

0 0 0
24 0 0
 69

GAMBAR
 70

Gambar 10. Autoklaf Gambar 11. Refrigerated Centrifuge

Gambar 13. pHmeter

Gambar 12. Termomixer

Gambar 14. Timbangan Analitik Gambar 15. Spektrofotometer UV

Vis
 71

Gambar 16.
Gambar 17.
Substrat limbah pengolahan kertas awal
perendaman substrat dengan NaOH

Gambar 18. Gambar 19.

Substrat limbah pengolahan kertas hasil Enzim selulase Bacillus sp.BPPT CC
pretreatment RK2
 72

Gambar 20. Gambar 21.

Analit berwarna kecoklatan hasil uji Analit berwarna biru hasil analisa

aktivitas selulase dengan larutan DNS kadar protein

Gambar 22. Gambar 23.

Substrat limbah pengolahan kertas+Enzim Pengembangan sampel dan
selulase Bacillus sp.BPPT pembanding pada kromatografi lapis
tipis