Prosedur Pemeriksaan Pesisida Dalam Urine
Prosedur Pemeriksaan Pesisida Dalam Urine
Prosedur Pemeriksaan Pesisida Dalam Urine
2. Persiapan sampel
a. 2 mL aquades menggunakan pipet dicampurkan ke urin yang sudah disiapkan
b. 25 µL isotropical memberikan lonjakan 25 ng/mL kosentrasi standar dari urin
c. Tambahkan 1,6 m β-glucuronidase/sulfur di 1,5 mL dari 0,2 M asetat buffer ke masing-
masing sampel
d. Inkubasi di oven pada suhu 370C selama 17 jam
e. Siapkan catridge vakum oasis SPE
f. Kondisikan catridge oasis SPE dengan 1 mL metanol dari 1 mL asetat acid 1%
g. Tuntaskan hidrolisis urin dari catridge
h. Cuci catridge untuk selama 30 detik menggunakan vakum
i. Elusi catridge SPE dengan 1,5 mL metanol
j. Tambahkan 2 mL acetonitrit kedalam metanol
k. Keringkan uap menggunakan turbo vap LV pada suhu 400C dan 10 psi nitrogen
l. Ulangi kembali risidu pada 50 µL acetatnitrit
m. Ekstrasi dari 10 dan 40 µL untuk analisis menggunakan HPLC dengan turbo ionspray
tekanan amtospher ionzation (TSI)-MS/MS dan HPCL dengan tekanan atmosphere
chimical ionzation (APCI)-MS/MS
3. Prosedur pemeriksaan
a. 2 mL urin kedalam 15 mL tabung catridge
b. Tambahkan alkohol dengan 10 µL dari ISTD dan campurkan untuk menjadikan
konsentrasi urin dari 80 µL masing-masing analisis
c. Tempatkan di lyophizer sistem
d. Nyalakan lyophizer : sampel beku selama 4 jam pada -350C dan tekanan atmospher.
Gunakan vakum untuk 25-5 mTorr pada suhu -340C selama 4 jam. Sampel diambil
sampai suhu -200C selama 2 jam dan berakhir pada suhu 200C selama 1 jam
e. Tambahkan 2 mL asetatnitrit dan 2 mL diethyl ether kedalam residu campur untuk 1 min
f. Tuangkan supernatants kedalam 15 mL tabung catridge untuk memisahkan residu
unddisolved
g. Bilas tabung menggunakan residu unddisolved dengan 1 mL asetatnitrit kemudian
tambahkan ke supernatant
h. Uapan supernatant dengan approx 1 mL menggunakan turbo vap LP suhu 300C dan 10
psi nitrogen
i. Tuangkan kedalam 15 mL tubes mengandung beberapa butiran carbonat
j. Tambahkan 50 ug CIP dan aduk
k. Tempatkan di alat pengering pada suhu 600C selama 3 jam
l. Pindahkan supernatants untuk membersihkan tabung dan uapkan untuk mengeringkan
menggunakan turbo vap
m. Ulangi susunan sampel pada 75 ug ion untuk analisis menggunakan GC-MS/MS
Pengukuran serum PON1 dilakukan menggunakan darah vena pada sampel dan kelompok
kontrol yang sebelumnya telah menjalani puasa 10 jam. Darah vena tanpa pemberian anti
koagulan dibiarkan pada suhu kamar selama 2 jam sampai terbentuk bekuan darah. Serum
dipisahkan melalui sentrifugasi 1000x g selama 15 menit lalu serum dipindahkan kedalam
tabung polypropylene dengan menggunakan pipet pasteur. Disimpan pada suhu -200C. kadar
serum PON1 ditentukan dengan mengukur absorbsi 4-nitrophenol pada 412nm, dimana 4-
nitrophenol merupakan hasil degradasi oleh PON1.
Inkubasi pertama dilakukan pada 100 µL sampel yang telah ditambahkan dengan antibodi
spesifik selama 90 menit padasuhu 370C. tambahkan 100 µL pendeteksi biotinylated antibodi
spesifik PON1 kemudian dilakukan inkubasi kedua selama 90 menit pada 370C. aspirasi dan cuci
sebanyak 3 kali. Tambahkan 100 µL konjugat Avidin-Horseradish Peroxidase (HRP) kemudian
dilakukan inkubasi ketiga selama 30 menit pada 370C. aspirasi dan cuci sebanyak 5 kali.
Tambahkan 90 µL solusi substart kemudian lakukan inkubasi keempat selama 15 menit pada
370C hanya yang mengandung PON1, antibodi biotinylated, dan konjugat Avidin-HRP yang
akan muncul sebagai warna biru. Reaksi enzim-substart diterminasi dengan menambhakan 50µL
solusi asam sulfat dan mengubah warna menjadi kuning. Densitas optik (OD) diukur segera
secara spektrofotometrik pada panjang gelombang 450 nm ± 2 nm. Nilai OD kemudian dihitung
secara proporsional sesuai konsentrasi PON1 dengan membandingkan OD sampel dengan
standard curve.