BAB I

PEMBAHASAN

1.1 Pengertian Bakteri

Jasad hidup yang ukurannya kecil sering disebut sebagai mikroba atau mikroorganisme
atau jasad renik. Jasad renik disebut sebagai mikroba bukan hanya karena ukurannya yang kecil,
sehingga sukar dilihat dengan mata biasa, tetapi juga pengaturan kehidupannya yang lebih
sederhana dibandingkan dengan jasad tingkat tinggi. Mata biasa tidak dapat melihat jasad yang
ukurannya kurang dari 0,1 mm. Ukuran mikroba biasanya dinyatakan dalam mikron, 1 mikron
adalah 0,001 mm. Sel mikroba umumnya hanya dapat dilihat dengan alat pembesar atau
mikroskop, walaupun demikian ada mikroba yang berukuran besar sehingga dapat dilihat tanpa
alat pembesar.

A. Sel Prokariotik

Prokaryote adalah bahasa Yunani, pro artinya kuno dan karyote dari inti. Tipe sel
prokariotik mempunyai ukuran yang lebih kecil dibandingkan dengan sel eukariotik. Beberapa
sel bakteri Pseudomonas hanya berukuran 0,40,7µm diameternya dan panjangnya 2-3µm. Sel ini
tidak mempunyai organela seperti mitokondria, khloroplas dan aparat golgi. Inti sel prokariotik
tidak mempunyai membran. Bahan genetis terdapat di dalam sitoplasma, berupa untaian ganda
(double helix) DNA berbentuk lingkaran yang tertutup. “Kromosom” bakteri pada umumnya
hanya satu, tetapi juga mempunyai satu atau lebih molekul DNA yang melingkar (sirkuler) yang
disebut plasmid. Sel prokariotik tidak mengandung organel yang dikelilingi oleh membran.
Ribosom yang dimiliki sel prokariot lebih kecil yaitu berukuran 70S. Ukuran genom sel
prokariot berbeda dengan sel eukariot. Jumlah DNA penyusun pada sel prokariot berkisar antara
0,8-8.106 pasangan basa (pb) DNA. DNA pada sel eukariot mempunyai pasangan basa lebih
tinggi, sebagai contoh: Neurospora 19.106; Aspergillus niger 40.106; Jagung 7.109; dan manusia
29.109. Sel prokariotik tidak seluruhnya membutuhkan oksigen, misalnya pada bakteri anaerob.
 B. Struktur Sel

1) Membran Sel Prokariotik

Pada beberapa bakteri, membran mengelilingi sitoplasma tanpa menunjukkan adanya
lipatan. Membran pada bakteri lain mengalami pelipatan ke dalam yang disebut mesosom. Pada
bakteri fotosintetik, khlorofil tidak terdapat dalam suatu khloroplas, melainkan terdapat dalam
membran yang sangat berlipat-lipat di dalam sel, yang disebut membran tilakoid. Sistem
fotosintetik pada bakteri disamping menggunakan khlorofil, juga karotenoid. Keduanya
mengandung sistem transport elektron yang menghasilkan ATP pada proses fotosintesis.

2) Dinding Sel
Dinding sel bakteri adalah struktur yang kompleks dan agak kaku. Dinding sel bakteri
menentukan bentuk bentuk sel. Meskipun tidak mengandung enzim dan tidak bersifat
semipermeabel, namun dinding sel diperlukan agar sel bakteri dapat berfungsi secara normal.
Dinding sel yang kaku memungkinkan bakteri dapat mengatasi konsentrasi osmosis yang
berbeda-beda dan sitoplasma tidak mengembang melampaui batas dinding yang kaku itu. Sejauh
ini diketahui bahwa ketebalan dinding sel bakteri berkisar 10-35 nm. Komposisi kimiawi
dinding sel bakteri Komponen dan struktur dinding sel prokariot ini sangat unik, dan tidak
dijumpai pada sel eukariotik. Yang menyebabkan kakunya dinding sel bakteri adalah
peptidoglikan (PG). Peptidoglikan tersusun oleh: (1) N-asetilglokosamin (NAG), (2) Asam N-
Asetilmuramat (NAM), (3) Peptida yang terdiri dari asam amino: alanin, glutamat,
diaminopimelat, atau lisin dan alanin. NAG dan NAM berselang-seling membentuk tulang
punggung dinding sel, Pada NAM terdapat 4 asam amino dan -asam amino ini membentuk
ikatan silang dengan asam amino NAM lainnya.
 Peptidoglikan juga disebut mukopeptida, glikopeptida, muropeptida atau murein
peptidoglikan. Seratserat peptidoglikan membentuk anyaman yang kuat namun tidak padat (tidak
solid), sehingga tidka menghalangi masuknya air, zat-zat makanan, seperti mineral, glukosa,
asam amino atau bahkan molekul organik yang lebih besar. Penggolongan bakteri menjadi
Gram positif dan Gram negatif adalah berdasarkan perbedaan komposisi dinding sel. Bakteri
Gram positif dinding selnya terutama terdiri dari PG sehingga terbentuk dinding sel yang kaku.
Pada bagian luar PG terdapat senyawa yang disebut asam teikhoat. Bakteri Gram negatif
mengandung PG dalam jumlah yang jauh lebih sedikit, akan tetapi di bagian luar PG terdapat
membran luar (outer membrane) yang tersusun atas lipoprotein dan fosfolipid. Selain itu bakteri
jenis ini mengandung lipopolisakarida. Oleh karena perbedaan komposisi dinding sel ini, bakteri
Gram positif dan negatif memiliki ketahanan yang berbeda. Bakteri Gram positif lebih rentan
terhadap antibiotika penisilin karena antibiotika ini dapat merusak PG. Sebaliknya karena jumlah
PG yang lebih banyak, bakteri Gram positif biasanya lebih tahan terhadap kerusakan mekanis.

Tabel 3 Perbedaan Susunan Dinding Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif

No. Gram positif Gram negatif

1 Komponen terbesar adalah Terdiri dari 3 lapis :
petidoglikan → terdiri 40 lapis 1. Lapisan dalam adalah
rangka dasar murein, meliputi peptidoglikan → satu lapis
30-70% berat kering dinding rangka dasar murein
sel bakteri (diaminopemelat, dan tidak
mengandung lisin), dan
hanya meliputi + 10% dari
berat kering dinding sel
 2. Lapisan luar :
lipopolisakarida, dan
lipoprotein
2 Pada beberapa bakteri terdapat Tidak ada asam teikoat
asam teikoat
3 Peptidoglikan mengalami lisis Lisozim melunakkan dinding sel,
oleh lisozim deterjen mengadakan disorganisasi
dinding itu dengan merusak lapisan
lipida
4 Dinding sel tebal 25-30 nm Dinding sel tipis 10-15 nm
5 Lebih rentan terhadap penicilin Kurang rentan
6 Menyerap pewarna dasar (ex: Tidak begitu menyerap pewarna
Kristal violet) sehingga dasar, namun dengan pewarnaan
berwarna ungu saat diwarna safranin (merah)

Perbedaan tersebut di atas dapat pula dilihat pada gambar berikut.

 Pengaruh lisozim dan penisilin terhadap dinding sel bakteri

Lisosim adalah ensim antibakteri yang terdapat dalam putih telur dan air mata, dan dapat
dihasilkan oleh beberapa bakteri. Lisosim akan merusak ikatan antar Nasetilglukosamin dan N-
asetil asam muramat dalam murein, sehingga lisosim dapat merombak murein dalam dinding sel.
Dinding sel yangrusak akan menghasilkan sel tanpa dinding sel yang disebut spheroplas.
Spheroplas sangat rentan terhadap tekanan osmotik. Penisilin akan bekerja aktif terhadap
dinding sel gram positif yang sedang membelah. Senyawa ini mengakibatkan sel tumbuh tidak
beraturan. Dalam hal ini penisilin menghambat pembentukan dinding sel.
 3) Nukleoid
Daerah Suspensi Materi Genetik Sel-sel prokaryot tidak memiliki nukleus sebagai tempat
tersimpannya materi genetic seperti pada eukaryotik, yang ada adalah suatu daerah yang disebut
nukleoid yang tidak dilingkungi oleh membran dan tidak mengadakan mitosis dan meiosis.
Strukturnya merupakan suatu masa amorf (tak berbentuk) yang lobuler terdiri dari banyak
kromatin yang fibriler. Bagian nukleoid terdiri dari molekul DNA yang membentuk kromosom.
Molekul inilah yang mengandung informasi genetika dari sel bakteri tersebut. Selain itu bakteri
juga mungkin mengandung DNA yang membentuk lingkaran kecil yang disebut sebagai plasmid.
Plasmid berisi materi genetika yang tidak penting bagi pertumbuhan sel dan bisa hilang tanpa
mengakibatkan sel mati. Fibril-fibril yang tampak pada nukleotid merupakan DNA yang
panjang(sekitar 1400 nm) dan tipis (3 nm), fleksibel dan sirkuler. Filamen sirkuler DNA
semacam ini pada ummnya disebut kromosom bakteri.

Pada bakteri DNA ekstrakromosom yang berbentuk cincin-cincin kecil, dapat

berreplikasi secara autonom (tidak seirama dengan kromosom) dan dapat juga bertindak sebagai
determinan genetik dinamakan episom (plasmid).

4) Membran Sel
Permukaan luar lipid bilayers membran sel bersifat hidrofil, sedangkan permukaan
dalamnya bersifat hidrofob. Umumnya membran sitoplasma terdiri atas 60% protein dan 40%
lemak khususnya fosfolipid. Stabilitas membran sel disebabkan oleh kekuatan hidrofobik antara
residu asam lemak dan kekuatan elektrostatis antara ujung-ujung hidrofilik. Pada bilayer terdapat
protein yang letaknya tenggelam (di dalam) bilayer atau terdapat pada permukaannya. Pada
beberapa bakteri, membran mengelilingi sitoplasma tanpa menunjukkan adanya lipatan.
Membran pada bakteri lain mengalami pelipatan ke dalam yang disebut mesosom. Pada bakteri
fotosintetik, khlorofil tidak terdapat dalam suatu khloroplas, melainkan terdapat pada mesosom
ini, selanjutnya dalam kondisi ini mesosom disebut membran tilakoid.

5) Flagel dan Pili

Flagella (tunggal = flagellum) adalah filamen yang memanjang ke arah luar sel. Flagel
merupakan salah satu alat gerak bakteri. Bakteri yang memiliki flagella bisa bergerak atau motil,
artinya dapat bergerak dengan keinginan sendiri. Flagel mengakibatkan bakteri dapat bergerak
berputar. Penyusun flagel adalah sub unit protein yang disebut flagelin, yang mempunyai berat
molekul rendah. Ukuran flagel berdiameter 12-18 nm dan panjangnya lebih dari 20 nm.
Mekanisme bagaimana flagella dapat menggerakkan sel adalah sebagai berikut: flagella yang
agak kaku ini ini berfungsi sebagai poros yang mendorong sel dengan cara memutar searah atau
berlawanan arah dengan jarum jam.
 Pada beberapa bakteri, permukaan selnya dikelilingi oleh puluhan sampai ratusan pili,
dengan panjang 12 nm. Pili disebut juga sebagai fimbrae. Pili berukuran ebih kecil, lebih pendek,
dan ebih banyak daripada fage. Pili dapat ditemukan pada spesies bakteri motil (bergerak),
ataupun nonmotil. Umumnya bakteri berperan untuk melekatkan sel bakteri pada permukaan
(jaringan sumber nutrisinya), dalam hal ini pili dikenal sebagai fimbria. Fungsi kedua adalah
untuk transfer materi genetika melalui proses yang disebut konjugasi dan untuk kepentingan ini
disebut sebagai pili (sex pili). Pada bakteri Escherichia coli strain K-12 hanya dijumpai 2 buah
pili.

6) Kapsul atau Lendir

Beberapa bakteri mengakumulasi senyawa-senyawa yang kaya akan air, sehingga
membentuk suatu lapisan di permukaan luar selnya yang disebut sebagai kapsul atauselubung
berlendir. Kapsul contohnya terdapat pada bakteri Pneumcoccus sp. Fungsinya untuk kehidupan
bakteri berperan untuk melindungi bakteri dari lingkungan luar juga sebagai gudang makanan.
Namun kapsul menyebabkan timbulnya sifat virulen/ infeksi terhadap inangnya. Jika bakteri
kehiangan kapsul, maka ia dapat kehilangan virulensinya. Dalam pembentukan agregasitanah,
senyawa yang terkandung dalam kapsul atau lendir inilah yang sangat berperan.
 Keberadaan kapsul mudah diketahui dengan metode pengecatan negatif menggunakan
tinta cina atau nigrosin. Kapsul akan tampak transparan diantara latar belakang yang gelap. Pada
umumnya penyusun utama kapsul adalah polisakarida yang terdiri atas glukosa, gula amino,
rhamnosa, serta asam organik seperti asam piruvat dan asam asetat. Ada pula yang mengandung
peptida, seperti kapsul pada bakteri Bacillus sp. Lendir merupakan kapsul yang lebih encer.
 7) Selongsong/ Tubul
Beberapa spesies bakteri terutama yang hidup di air tawar dan laut, terbungkus oleh
selongsong. Selongsong terbuat dari senyawa logam yang larut di lingkungannya, ex: besi,
mangan oksida yang mengendap di sekeliling sel. Selongsong sesungguhnya bukanlah bagian
yang penting bagi sel bakteri.

8) Endospora
Endospora adalah bentuk istirahat dari sel bakteri yang dibentuk jika kondisi lingkungan
buruk. Endospora adalah sebuah fase dimana bakteri tertentu menebalkan dinding selnya sebagai
bentuk pertahanan diri dari kondisi lingkungan yang kurang menguntungkan, contoh pada
Bacillus dan Clostridium. Endospora memiliki dinding yang amat tebal jika dibandingkan
dengan sel vegetatif-nya, sehingga Endospora sangat sukar diwarnai dengan pewarna biasa, dan
harus menggunakan pewarna spesifik. Pewarna yang biasa digunakan adalah malachite green.

Pada tumbuhan seperti ganggang, endospora ini disebut dengan Akinet. Endospora pada
bakteri tidak mempunyai fungsi sebagai alat reproduksi. Endospora sangat tahan terhadap
kondisi lingkungan ekstrim seperti suhu yang tinggi, kekeringan (kadar air minim), senyawa
kimia beracun (disinfektan, antibiotik) dan radiasi sinar UV. Endospora dapat disebut sebagai
fase tidur dari bakteri. Endospora mampu bertahan sampai kondisi lingkungan kembali
menguntungkan.

1.2 Pewarnaan Bakteri Gram

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang
khas, termasuk bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air,
dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk melihat dan mengamati
bentuk sel bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, sehingga untuk diidentifikasi ialah dengan
metode pengecatan atau pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah
diamati. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi
dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri
ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.

Struktur di dalam sel pada tempat-tempat yang dibentuk oleh spesies ini, disebut
endospora. Endospora dapat bertahan hidup dalam keadaan kekurangan nutrien, tahan terhadap
panas, kekeringan, radiasi UV serta bahan-bahan kimia. Ketahanan tersebut disebabkan oleh
adanya selubung spora yang tebal dan keras. Sifat-sifat ini menyebabkan dibutuhkannya
perlakuan yang keras untuk mewarnainya. Hanya bila diperlukan panas yang cukup, pewarna
yang sesuai dapat menembus endospora. Tetapi sekali pewarna memasuki endospora, sukar
untuk dihilangkan. Ukuran dan letak endospora di dalam sel merupakan ciri-ciri yang digunakan
untuk membedakan spesies-spesies bakteri yang membentuknya.

Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna ,

substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah
meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus.
sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini
dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies.

Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu
pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural.
Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal
suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan
sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau
bagian-bagian sel microbe disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan
struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari
sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan
kapsul. Macam-macam pewarnaan yaitu:

a. Pewarnaan negative
 Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang
 Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta
 Cara pewarnaan negative
- Sediaan hapus → teteskan emersi → lihat dimikroskop

Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar
belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan
(tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada
pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-
bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan
sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.

b. Pewarnaan sedehana
 Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin)
 Tujuan hanya untuk melihat bentuk sel

Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai

macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan
menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam
zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena
sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk
pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif).

c. Pewarnaan Tahan Asam

 Pewarnaan ini dilakukan pada bakteri tahan asam dalam proses warna akibat Alkohol-
asam, dan penggunaan pembalik warna pada tahap akhir dari proses sehingga menghasilkan
warna merah.

d. Pewarnaan structural/khusus
Untuk mewarnai struktur khusus/tertentu dari bakteri→ kapsul, spora, flagel dll

e. Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat
sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan
air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang
berwana biru gelap.

f. Pewarnaan spora
Dinding spora relative tidak permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan cara
memanaskan preparat.

g. Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil,
sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.

h. Pewarnaan nucleoid
Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA.

i. Pewarnaan diferensial
 menggunakan lebih dari satu macam zat warna
 Tujuan untuk membedakan antar bakteri
 Contoh: Pewarnaan Gram, Pewarnaan Bakteri Tahan Asam

Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop,
memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri
seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada
bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya.

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies
bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat
kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan
Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884
untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.

Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu
bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut.
Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu,
pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel
seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus
Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua
genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya
sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang
umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti
pewarnaan sederhana atau Gram.

Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna.
Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini
berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan
memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri.
Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada
muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif,
maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red,
dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4 -, CH3COO-, COOHCOO.
Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian
sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagianbagian inti sel.
Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat,
intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pada bakteri gram positif
menunjukkan warna biru ungu dan bakteri gram negatif berwarna merah. Dalam pewarnaan
gram diperlukan empat reagen yaitu :

1. Zat warna utama (violet kristal)

Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna
utama. Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan
uantuk melunturkan zat warna utama.
2. Zat warna kedua / cat
Penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat
utama setelah perlakuan denga alcohol.

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu
pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu
gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan
Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat
semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna
untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel
mereka.

Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu :

 Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

 Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
 Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
 Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

Pada proses pewarnaan gram, harus gelas obyek yang bersih. Pembersihan ini dilakukan
supaya gelas obyek bebas lemak dan debu. Pembersihan biasanya menggunakan alkohol .
Setelah di cuci kemudian di beri satu tetes aquades pada permukaan gelas obyek. Kultur bakteri
murni diambil dan diratakan diatas kaca obyek. Pengambilan kultur bakteri tidak diambil terlalu
banyak, karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan dan apabila kultur bakteri tidak dapat
diratakan tipis-tipis maka bakteri akan tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan
bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas.
 Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api. Proses
fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca obyek sehingga olesan bakteri
tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi
adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api. Setelah dilakukan
fiksasi kemudian ditetesi dengan kristal violet dan dibiarkan. Kemudian dicuci dengan air
mengalir dan dibiarkan sampai kering (dengan cara dianginkan). Pencucian dengan air bertujuan
untuk mengurangi kelebihan zat warna dari violet kristal. Setelah kelebihan zat warna dicuci
dengan air kemudian diberi larutan iodin dan dibiarkan sehingga terbentuk suatu kompleks
antara violet kristal dan iodin. Olesan bakteri kemudian dicuci kembali dengan air mengalir.
Kemudian dicuci dengan etanol dan dicuci kembali dengan air mengalir.

Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin dan diamkan. Kemudian cuci

dengan air mengalir dan kering dianginkan, kemudian diamati dibawah mikroskop. Pemberian
kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon
terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan
komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negative
mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol
(etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga
memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan
menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri
gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya
rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk
sehingga sel berwarna ungu.

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding
selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme
gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan
pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran
tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan
peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).
 Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu
determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram
positif dan bakteri Gram negative. Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

 Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
 Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat
didalam
 lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak
mengandung asam tekoat.
 Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
 Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
 Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
 Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
 Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
 Peka terhadap streptomisin
 Toksin yang dibentuk Endotoksin

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

 Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
 Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang
sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan.
Mengandung asam tekoat.
 Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
 Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
 Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
 Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
 Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
 Tidak peka terhadap streptomisin
 Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin
 BAB II

PENUTUP

2.1 Kesimpulan

Jasad hidup yang ukurannya kecil sering disebut sebagai mikroba atau mikroorganisme
atau jasad renik. Jasad renik disebut sebagai mikroba bukan hanya karena ukurannya yang kecil,
sehingga sukar dilihat dengan mata biasa, tetapi juga pengaturan kehidupannya yang lebih
sederhana dibandingkan dengan jasad tingkat tinggi. Prokaryote adalah bahasa Yunani, pro
artinya kuno dan karyote dari inti. Tipe sel prokariotik mempunyai ukuran yang lebih kecil
dibandingkan dengan sel eukariotik.sel prokaryote terdisri dari membrane sel prokariotik,
dinding sel, nucleoid, membrane sel, flagel dan pili, kapsul dan tubul.
Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri
tersebut disuspensikan. Banyak senyawa organik berwarna (zat pewarna) digunakan untuk
mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopis.Zat warna menyerap dan
membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme dengan lingkungannya dapat
ditingkatkan. Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam
yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan
struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan
larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan
pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel
microbe atau bagian-bagian sel microbe disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan
pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-
bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan
pengecatan kapsul.
DAFAR PUSTAKA