BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Dalam bidang mikrobiologi untuk menumbuhkan dan mempelajari sifat-sifat

mikroorganisme diperlukan suatu media sebagai tempat pertumbuhan mikroorganisme.
Media pertumbuhan harus memenuhi persyaratan nutrisi yang dibutuhkan oleh suatu
mikroorganisme (Atlas, 2004). Nutrisi yang dibutuhkan mikroorganisme untuk
pertumbuhannya meliputi karbon, nitrogen, unsur non logam seperti sulfur dan fosfor, unsur
logam seperti Ca, Zn, Na, K, Cu, Mn, Mg, dan Fe, vitamin, air, dan energi (Cappucino,
2014).
NA (Nutrient Agar) merupakan suatu medium yang berbentuk padat, NA (Nutrient
Agar) dibuat dari campuran ekstrak daging dan peptone dengan menggunakan agar
sebagai pemadat, dalam hal ini media yang di gunakan di produksi oleh Oxoid.ltd.,
Basingstoke, Hampshire, England, dengan merek OXOID. kode CM0003. Komposisi NA

Kode CM0003 adalah pepton 5.0, sodium chlorida 5.0, agar 15.0, lab-lemco’ powder 1.0,

yeast extract 2.0.(tertulis dalam kemasan).

digunakan untuk mengamati penampilan atau morfologi koloni bakteri (Munandar, 2016:84).
Bagi organisme bersel tuggal, air amat penting karena merupakan komponen utama
protoplasma serta wahana bagi masuknya nutrient ke dalam sel. Dalam pembuatan medium
sebaiknya di gunakan air suling, pada medium yang mengandung pepton dan ekstrak
daging, air dengan kulitas semacam ini dapat menyebabkan terbentuknya endapat fosfat
dan magnesium fosfat.
Berdasarkan pada sumber karbon yang di gunakan, sebagaian besar bakteri
memerlukan sumber energi organik seperti glukosa atau asam-asam amino. Faktor tumbuh
juga diperlukan dikarenakan di dalam faktor tumbuh terdapat komponen seluler esensial
yang tidak dapat disintesis sendiri oleh suatu organisme dari sumber dasar karbon dan
nitrogenya.bagi banyak bakteri kebutuhan berupa faktor tumbuh sudah dapat dipenuhi oleh
ekstark daging (Hadioetomo 1990: 44-45).

1.2 Tujuan Praktikum

1. Agar Mahasiswa mengetahui cara membuat media NA
2. Agar mahasiswa dapat melakukan sterilisasi terhadap media dan alat
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Mikroorganisme adalah suatu organisme hidup yang berukuran mikroskopis. Dalam

dunia mikroorganisme terdiri dari lia kelompok organisme yaitu bakteri, virus, protozoa,
algae dan cendawan mikroskopis. Dalam mikroorganisme kita memperlajari banyak segi
mengenai jasad-jasad renik ini (dinamakan mikroba atau protista), dimana adanya, ciri-
cirinya, kekerabatan antara sem=samanya seperti juga dengan kelompok mikroorganisme
lainya, pengendalian dan peranannya dalam kesehatan dan kesejahteraan manusia
(Pelczar dan Chan, 2005).
Metode sterilisasi antara lain sterilisasi fisik, kimia dan mekanik. Sterilisasi fisik
dipakai bila selama sterilisasi dengan bahan kimia tidak akan berubah akibat temperatur
tinggi atau tekanan tinggi. Cara membunuh mikroorganisme tersebut adalah dengan panas.
Panas kering membunuh bakteri karena oksidasi komponen-komponen sel. Daya bunuh
panas kering tidak sebaik panas basah. Pemanasan basah dapata memakai autoklaf,
tyndalisasi dan pasteurisasi. Tyndalisasi merupakan metode dengan mendidihkan medium
dengan uap air beberapa menit saja. Pasteurisasi merupakan suatu cara disinfeksi dengan
pemanasan untuk mengurangi jumlah mikroorganisme tanpa merusak fisik suatu ahan.
Pemanasan kering dapat dilakukan memakai oven dan pembakaran. Selain itu dapat
dilakukan penyinaran dengan inar gelombang pendek (Waluyo, 2005).
Sterilisasi secara kimia dapat memaki antiseptik kimia. Pemilihan antiseptik terutama
tergantung pada kebutuhan daripada tujuan tertentu serta efek yang dikehendaki. Perlu juga
diperhatikan bahwa beberapa senyawa bersifat iriatif, dan kepekaan kulit sangat bervariasi.
Zat-zat kimia yang dapat dipakai untuk sterilisasi antara lai halogen (senyawa klorin,
yodium), alkohol, fenol, hidrogen peroksida, zat warna ungu kristal, derivat akridin, rosalin,
deterjen, logam-logam berat, aldehida, ETO, uap formaldehida ataupun beta-propilakton
(Volk, 1993).
Sterilisasi mekanik dapat dilakukan dengan penyaringan. Penyaringan dengan
mengalirkan gas atau cairan melalui suatu bahan penyaring yang memiliki pori-pori cukup
kecil untuk menahan mikroorganisme dengan ukuran tertentu. Saringan akan tercemar
dengankan cairan atau gas yang melaluinya akan steril (Volk, 1993).
Medium pertumbuhan mikrob adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran nutrient
yang diperlukan mikrobia untuk pertumbuhannya. Dengan menggunakan medium
pertumbuhan, aktivitas mikroba dapat dipelajari dan dengan medium tumbuh dapat
dilakuakn dengan isolasi mikrobia dengan kultur murni, perbanyakan, pengujiam sifat
fisiologis, dan perhitungan jumlah mikrobia (Dwidjoseptro, 1994). Menurut Pelczar (1986),
keragaman yang luas dalam tipe nutrisi untuk mikrobia yaitu diimbangi dengan oleh
tersedianya berbagai media yang bayak macamnya untuk kultivasinya. Media-media yang
digunakan seperti pepton, ekstrak daging, ekstrak khamir dan agar. Bahan yang paling
umum digunakan untuk membuat medium menjadi padat adalah agar.
Jenis medium sangat bervariasi bergantung kepada apa yang dijadikan dasar
penamaan. Berdasarkan kepada bentuknya dikenal tiga macam medium, yaitu medium cair,
medium semi solid dan medium padat. Beda utama ketiga macam medium, yaitu ada
tidaknya bahan pemadat. Medium cair tidak menggunakan bahan pemadat. Medium semi
solid dan medium padat menggunakan bahan pemadat. Bahan pemadat dapat berupa
amilum, gelatin, selulosa, dan agar-agar. Agar-agar paling umum digunakan. Jumlah bahan
pemadat pada medium semi solid setengahnya dari medium padat. Pada medium padat
jumlah agarnya 1,5% - 1,8%.
Berdasarkan fungsi/sifatnya beberapa macam medium, antara lain medium umum,
medium selektif dan medium diferensial. Berdasarkan komposisi kimianya, dikenal medium
alami, medium semi sintetik, dan medium sintetik.
Perlu sterilisasi terhadap medium dan alat-alat yang akan digunakan untuk kegiatan
prakatikum Mikrobiologi. Sterilisasi adalah suatu program untuk mematikan semua
organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda. Pemilihan cara sterilisasi
didasarkan pada sifat bahan yang akan disterilkan. Cara sterilisasi yang umum digunakan
secara rutin di laboratorium Mikrobiologi ialah dengan pemanasan. Bila panas digunakan
bersama-sama dengan uap air maka disebut sterilisasi panas lembab, bila tanpa
kelembaban disebut sterilisasi panas kering atau sterilisasi kering.
Autoklaf merupakan alat sterilisasi yang sering digunakan. Alat ini bekerja dengan
sistem sterilisasi basah. Secara prinsip, cara kerja alat ini adalah sterilsasi dengan
menggunakan uap air pada suhu 1210C selama 15 menit pada tekanan 1 atm. Atau lebih
tergantung ketinggian tempat terhadap permukaan air laut. Sterilisasi uap ini tergantung
pada ; (1) sifat bahan atau alat, harus dapat ditembus atau terkena uap secara merata tanpa
mengalami kerusakan agar proses sterilisasi berlangsung efektif, (2) kondisi sterilisasi harus
bebas udara (vacuum), (3) suhu yang terukur harus mencapai 1210C dan dipertahankan
selama 15 menit.
Oven bersuhu tinggi (160 - 1700C) biasa digunakan untuk sterilisasi kering.
Karakteristik sterilisasi kering adalah suhu tinggi dan waktu sterilisasi yang lama (1-3 jam).
Bahan atau alat yang akan disterilisasi kering harus tahan panas dan tidak mengalami
kerusakan pada suhu yang digunakan dan disterilkan dengan cara membungkus,
menyumbat atau meletakkannya dalam wadah tertutup untuk mencegah kontaminasi ketika
dikeluarkan dari oven.
Sterilisasi dengan Bahan Kimia. Bahan yang tidak tahan panas seperti plastik dapat
disterilsasi dengan menggunakan gas etilen oksida atau bahan kimia asam perasetat,
formaldehid, dan glutaraldehid alkalin pada suhu kamar selama 2-18 jam. Beberapa hal
yang harus diperhatikan dalam sterilisasi kimiawi ini adalah : (1) Bahan yang digunakan
sebagai sterilisator harus benar-benar dihilangkan sebelum alat digunakan dan biasanya
memerlukan waktu yang cukup lama, (2) daya bakar bahan kimia sterilisator, (3)
persyaratan peralatan dan biaya pelaksanaan.
Penyaringan merupakan teknik sterilisasi bahan cair pada suhu ruang dengan
menggunakan penyaring yang memiliki pori-pori kurang dari 0,45 atau 0,22 μm. beberapa
bahan yang umum disterilisasi dengan teknik ini adalah cairan serum, antibiotik, enzim,
toksin larutan bikarbonat dan medium sintetik tertentu.
Medium tumbuh mikroorganisme adalah bahan yang digunakan untuk
menumbuhkan mikroorganisme di atas atau di dalamnya. Komposisi medium tumbuh
bervariasi tergantung mikrorganisme target yang diinginkan untuk tumbuh. Akan tetapi,
secara umum ada kebutuhan-kebutuhan dasar yang sama yaitu air, karbon, energi, mineral
dan faktor tumbuh.
Air merupakan komponen utama karena organisme bersel tunggal membutuhkan air
sebagai penyusun utama protoplasma dan wahana bagi masuknya nutrien ke dalam sel dan
keluarnya sekresi dan eksresi dari dalam dan luar sel. Air juga membantu berlangsungnya
reaksi-reaksi enzimatik di dalam sel. Untuk media pertumbuhan air biasa digunakan adalah
air suling atau air hasil distilasi. Air sadah kaya ion kalsium dan magnesium yang dapat
mengikat ion fosfat yang terdapat pada medium yang mengandung pepeton atau ekstrak
daging.
Sumber Karbon (Carbon/C Sources) Sumber karbon untuk pertumbuhan dapat
berupa karbon organik maupun karbon dioksida. Organisme yang menggunakan karbon
dioksida sebagai sumber karbonnya disebut organisme autotrof sedangkan organisme yang
menggunakan sumber karbon organik disebut organisme heterotrof.
Sumber Nitrogen (Nitrogen/N Sources) Sumber nitrogen bagi organisme dapat dibagi
menjadi nitrogen anorganik dan nitrogen organik. Organisme autotrofik menggunakan
karbon anorganik sedangkan organisme heterotrof menggunakan karbon anorganik berupa
asam amino atau senyawa-senyawa protein intermediet seperti peptida, proteosa dan
pepton.
Micro-nutrients Organisme juga memerlukan unsur mikro berupa logam agar
pertumbuhannya normal. Beberapa logam yang diperlukan di antaranya natrium (Na),
kalium (K), magnesium (Mg), mangan (Mn), besi (Fe), seng (Zn), tembaga (Cu), fosfor (P),
dan kobalt (Co).
Derajat Keasaman (pH) Derajat keasaman media atau pH medium juga sangat
menentukan pertumbuhan mikrorganisme. Umumnya mikrorganisme hidup pada kisaran pH
netral (7) akan tetapi, mikroroganisme patogen biasanya hidup pada pH alkalin.
Medium pertumbuhan mikroorganisme dapat dibagi menjadi dua jenis, medium sintetik dan
medium komplek. Pembagian tersebut didasarkan pada komposisi kimiawi medium. Medium
sintetik dibuat dari campuran bahan kimia dengan kemurnian tinggi dan jumlah diketahui
dengan pasti. Medium kompleks dibuat dari bahan-bahan organik kompleks seperti ekstrak
daging dan pepton.
 BAB III

METEODOLOGI PRAKTIKUM

3.1 Alat Dan Bahan

3.1.1 Alat
1. Erlenmeyer 250 ml
2. Batang pengaduk
3. Hotplate
4. Cawan petri
5. Alumunuim foil
6. Kapas
7. Keranjang
8. Kertas
9. Neraca analitik
10. Autoklaf
11. Spatula
3.2 Bahan
1. Media NA 5 gram (sudah dihitung menggunakan rumus)
2. Aquades 250 ml

3.2 Cara Kerja

a) Cara kerja pembuatan media :

1. Timbang media NA sebanyak 5 gram
2. Larutkan media NA dengan aquades sebanyak 250 ml, sambil diaduk
menggunakan batang pengaduk
3. Jika media susah larut, larutkan media di atas hotplate sambil diaduk
4. Jika media sudah larut, tutup bagian atas erlenmeyer dengan menggunakan
kapas, tutup sampai kedap udara
5. Setelah itu, bagian atas erlenmeyer yang sudah ditutupi menggunakan
kapas, dilapisi lagi menggunakan kertas alumunium foil
6. Media ditaruh di atas rak, siap untuk disterilkan
b) Cara kerja Sterilisasi :
1. Cawan petri yang bersih, disatukan antara alas dan tutupnya
2. Lapisi cawan petri menggunakan kertas
3. Setelah selesai, cawan petri ditaruh didalam keranjang, siap untuk disterilkan

c) Cara kerja sterilisasi media dan peralatan menggunakan autoklaf :

1. Pertama-tama masukkan air terlebih dahulu kedalam autoklaf sampai pada
tanda batas (air yang digunakan adalah aquades).
2. Lalu pasang penyangga didalamnya.
3. Setelah itu masukkan panci diatas penyangga, lalu masukkan media dan
cawan petri yang akan di sterilisasi kedalam panci sampai tanda batas.
4. Tutup autoklaf sampai rapat dan kencang agar uap tidak jeluar.
5. Hubungkan autoklaf dengan arus listrik.
6. Nyalakan autoklaf, dan atur suhunya 1210 C, selama 15 menit.
7. Tunggu tekanan pada kompartemen (jarum penunjuk) sampai pada tanda
warna hijau.
8. Saat jarum kompartemen sampai pada tanda warna hijau, turunkan suhu pada
autoklaf
9. Saat suhu sudah turun, buka tutup autoklaf dengan hati-hati.
10. Matikan autoklaf terlebih dahulu.
11. Keluarkan media dan cawan petri yang sudah disterilisasi dari dalam autoklaf
12. Pindahkan segera media kedalam mesin pendingin dan capet kerak
penyimpanan.
3.3 Diagram Alir

DIAGRAM ALIR
PEMBUATAN MEDIA

Timbang media NA sebanyak 5 gram

Larutkan media NA dengan aquades sebanyak 250

ml, sambil diaduk menggunakan batang pengaduk

Jika media susah larut, larutkan media di atas

hotplate sambil diaduk

Jika media sudah larut, tutup bagian atas erlenmeyer

dengan menggunakan kapas, tutup sampai kedap
udara

Setelah itu, bagian atas erlenmeyer yang sudah ditutupi

menggunakan kapas, dilapisi lagi menggunakan kertas
alumunium foil

Media ditaruh di atas rak, siap untuk disterilkan

 DIAGRAM ALIR

STERILISASI CAWAN PETRI

Cawan petri yang bersih, disatukan antara alas

dan tutupnya

Lapisi cawan petri menggunakan kertas

Setelah selesai, cawan petri ditaruh didalam

keranjang, siap untuk disterilkan
 DIAGRAM ALIR

STERILISASI MEDIA & CAWAN PETRI

MENGGUNAKAN AUTOCLAP

Pertama-tama masukkan air terlebih dahulu

kedalam autoclap sampai pada tanda batas
(air yang digunakan adalah aquades).

Lalu pasang penyangga didalamnya.

Setelah itu masukkan panci diatas

penyangga, lalu masukkan media dan
cawan petri yang akan di sterilisasi
kedalam panci sampai tanda batas.

Tutup autoclap sampai rapat dan kencang

agar uap tidak jeluar.

Hubungkan autoclap dengan arus listrik.

Nyalakan autoclap, dan atur suhunya

1210 C, selama 15 menit.
 Tunggu tekanan pada kompartemen
(jarum penunjuk) sampai pada tanda
warna hijau.

Saat jarum kompartemen sampai pada

tanda warna hijau, turunkan suhu pada
autoclap.

Saat suhu sudah turun, buka tutup

autoclap deghan hati-hati.

Matikan autoclap terlebih dahulu.

Keluarkan media dan cawan petri yang

sudah disterilisasi dari dalam autoclap

Pindahkan segera media kedalam mesin

pendingin dan capet kerak penyimpanan
 BAB IV

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

Media NA dalam 250 ml ( 20 gram dalam 1 L) = 20/4 = 5 gram

a.) Cara kerja pembuatan media :

1. Timbang media NA sebanyak 5 gram

2. Larutkan media NA dengan aquades sebanyak 250 ml, sambil diaduk menggunakan batang

pengaduk

3. Jika media susah larut, larutkan media di atas hotplate sambil diaduk

4. Jika media sudah larut, tutup bagian atas erlenmeyer dengan menggunakan kapas, tutup sampai

kedap udara

5. Setelah itu, bagian atas erlenmeyer yang sudah ditutupi menggunakan kapas, dilapisi lagi

menggunakan kertas alumunium foil

6. Media ditaruh di atas rak, siap untuk disterilkan

b.) Cara kerja Sterilisasi :

1. Cawan petri yang bersih, disatukan antara alas dan tutupnya

2. Lapisi cawan petri menggunakan kertas

3. Setelah selesai, cawan petri ditaruh didalam keranjang, siap untuk disterilkan

c.) Cara kerja sterilisasi media dan peralatan menggunakan autoklaf :

1. Pertama-tama masukkan air terlebih dahulu kedalam autoklaf sampai pada tanda batas (air yang

digunakan adalah aquades).

 2. Lalu pasang penyangga didalamnya.

3. Setelah itu masukkan panci diatas penyangga, lalu masukkan media dan cawan petri yang akan di

sterilisasi kedalam panci sampai tanda batas.

4. Tutup autoklaf sampai rapat dan kencang agar uap tidak jeluar.

5. Hubungkan autoklaf dengan arus listrik.

6. Nyalakan autoklaf, dan atur suhunya 1210 C, selama 15 menit.

7. Tunggu tekanan pada kompartemen (jarum penunjuk) sampai pada tanda warna hijau.

8. Saat jarum kompartemen sampai pada tanda warna hijau, turunkan suhu pada autoklaf.

9. Saat suhu sudah turun, buka tutup autoklaf dengan hati-hati.

10. Matikan autoclap terlebih dahulu.

11. Keluarkan media dan cawan petri yang sudah disterilisasi dari dalam autoklaf

12. Pindahkan segera media kedalam mesin pendingin dan capet kerak penyimpanan.

4.2 Pembahasan

Medium adalah suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi yang dipakai untuk menumbuhkan

mikroba. Selain untuk menumbuhkan mikroba, medium dapat digunakan pula untuk isolasi,

memperbanyak, pengujian sifat-sifat fisiologi dan perhitungan mikroba.

Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat

makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Madia pertumbuhan

bakteri terdiri dari dua bentuk yaitu bentuk cair dan bentuk padat. Bakteri yang berbeda

memerlukan kebutuhan akan nutrisi yang berbeda pula, sehingga dikembangkan berbagai macam

media pertumbuhan untuk digunakan dalam diagnosa mikrobiologi.

Nutrient agar (NA) adalah suatu medium yang berbentuk padat, yang merupakan perpaduan antara

bahan alamiah dan senyawa-senyawa kimia. Pada medium NA, nutrien utama penyusunnya yakni

adalah kaldu daging. bahan yang lain adalah pepton, bacto agar dan aquades. Pepton dan daging

sebagai protein hewani, vitamin, dan karbohidrat bagi bakteri.

Dalam pembuatan media pertumbuhan mikroorganisme menggunakan bubuk NA 5 gram. Kemudian

dilarutkan dengan aquades hingga volumenya menjadi 250 mL dan dipanaskan dengan kompor (jika

listrik padam) atau dengan hotplate (jika listrik menyala). Kemudian seharusnya media disterilkan

dalam autoklaf dengan suhu 121°C dan tekanan 2 atm selama 15 menit.

faktor-faktor yang memungkinkan terjadinya kontaminasi medium adalah :

1. Sterilisasi medium yang kurang sempurna

2. Medium memenuhi semua kebutuhan nutrien

3. Proses praktikum yang tidak aseptis

4. Lingkungan laboratorium yang kurang steril

Oleh karena itu, dalam pengerjaan pembuatan medium NA, praktikan harus sebisa mungkin

meminimalisasi terjadinya kontaminasi.

 BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Media adalah suatu bahan yang terdiri dari beberapa macam zat yang berfungsi untuk tempat
tumbuh mikroba. Media merupakan bahan yang terdiri atas campuran nutrisi dan makanan yang
dibutuhkan oleh mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Berdasarkan konsistensinya media dibagi
menjadi media cair, media semi padat dan media padat. Nutrien Agar (NA) merupakan medium yang
memiliki sumber nitrogen yang cukup sehingga baik untuk pertumbuhan bakteri. Dalam membuat
medium, kita harus melakukan upaya sebisa mungkin untuk meminimalisasi terjadinya kontaminasi
pada media.

5.2 Saran

Saat melakukan adalah praktikum pada pembuatan media NA, harus sesuai prosedur kerja agar
media yang dihasilkan bagus. Dan praktikan harus cermat dan teliti pada proses sterilisasi agar hasil
media tidak terkontaminasi.
 DAFTAR PUSTAKA

Syah kurniawan sunan insan. 2016 . PENENTUAN TINGKAT JAMINAN STERILISASI

PADA AUTOKLAF DENGAN INDIKATOR BIOLOGI SPRE STRIP . Fakultas Farmasi
Universitas Padjajaran. 14(1) . Hal 59-60

Idafi Mahfuz . 2009 . STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIUM MIKROBA . Universitas

Lambung Mangkurat Banjarmasin
 LAMPIRAN

( Media
Sebelum dilarutkan ) (
Media Ketika
dilarutkan )
 ( Media Sudah larut dan volume ( Mulut erlenmeyer sudah ditutupi dengan plastik dan
alumunium foil )

larutan 250 ml )