AISLAMIENTO DE CLOROPLASTOS

⦁Se utilizó Elodea canadensis (Elodea) debido a la gran cantidad de cloroplastos

presentes en su parénquima clorofílica, esto nos permite facilitar la observación
del organelo y facilitar su aislamiento, al igual que se usó Spinacia oleracea
(Espinaca) aprovechando la intensidad de sus pigmentos y la facilidad para su
extracción.
⦁Se observó al microscopio unos fragmentos de las hojas de elodea y visualizado
a 10x se detalló la estructura de la hoja, nervaduras, su parénquima clorofílico y
paredes celulares que contienen los organelos encargados de la fotosíntesis,
difícilmente se podían observar a esta escala visual de 10x (DIBUJO).

⦁Al detallar más la parénquima de la Elodea a (40x), se pueden observar los

pequeños cloroplastos que se identificaron como óvalos verdes que se
encuentran al interior de unas celdas, estas componen la parénquima clorofílica
y permiten el movimiento de los cloroplastos según la orientación de la luz y su
intensidad.
⦁ Luego de discriminar la morfología de un cloroplasto y el tejido vegetal, se trituró
con un mortero las hojas de elodea y espinaca, así se logró el rompimiento de
las paredes celulares y la salida de los cloroplastos que se querían aislar,
posteriormente, se utilizó papel filtro para separar líquidos de sólidos y se
recuperaron 10ml de ambas muestras, también se agregó buffer fosfato para
mantener su pH y la isotonicidad del organelo.
⦁ La separación de organelos está basada en el tamaño y la densidad, donde las
partículas más grandes y densas son precipitadas según la viscosidad de la
solución donde se separan y la fuerza centrífuga. Los fragmentos más pequeños
de las células y los orgánulos permanecen en el líquido sobrenadante y requieren
más fuerza centrífuga y más tiempo para precipitarse.
⦁ Al someter ambas muestras a un primer centrifugado a 1000g por 5 minutos,
se les dio tiempo suficiente para que se depositaran los organelos de mayor
tamaño en el fondo y los restos estructurales de la células de menor tamaño se
situaran en la porción superior, esta porción superior de sobrenadante se
descartó y solo se recuperó el PELLET el cual contenía los cloroplastos y los
núcleos.
⦁ En el PELLET recuperado se precipitaron núcleos y cloroplastos, esta fracción
obtenida era una mezcla de organelos que fue luego separada, mezclándose
con 10ml de buffer fosfato y centrifugando a 200g por otros 5 minutos más
(DIBUJO)
⦁El método utilizado en esta práctica fue el de separación de fragmentos
celulares también conocida como centrifugación por gradiente isopícnico es un
tipo de centrifugación muy usado en el campo biológico para separar moléculas
basado en su punto isopícnico o equilibrios entre la densidad interna del organelo
y la densidad externa del medio , somentiendo los fragmentos resultados de la
lisis celular a altas fuerzas G por largos periodos de tiempo en soluciones que
contienen cantidades variadas de una molécula viscosa. Por ejemplo, un
gradiente de concentración por etapas de 0.8Molaridad/1.2M de sacarosa o un
gradiente lineal de sacarosa al 20-50%.
⦁El sobrenadante recuperado se deposita en la parte superior del tubo de
centrifugado sin agitar ni causar turbiedad sobre la solución que contiene
concentraciones distintas de sacarosa al (10%, 15%, 20%, 40%, 60%) que se
aprovecharon para separar los fragmentos celulares de acuerdo con su peso y
densidad. Esta disolución se centrifugo por 500g por 15 minutos para facilitar la
sedimentación de los fragmentos y se extrajo una banda de sobrenadante que
se considera que contiene cloroplastos.
⦁Se transfirió a un tubo Eppenderf de 1.5ml y se agregó 1ml de buffer fosfato
este se centrifugo a 3200g descartando el sobrenadante y re suspendiendo el
pellet, se repite el proceso con la finalidad de aislar solamente los cloroplastos y
retirar cualquier resto celular.
Cuestionario
¿En qué consiste el ciclo de Calvin en la fotosíntesis?
En la fase oscura de la fotosíntesis ocurre el ciclo de Calvin que constituye una
serie de reacciones químicas cíclicas que permiten fijar el CO2 atmosférico
aprovechando la energía obtenida en la fase luminosa de la fotosíntesis en
donde ocurre la captación de fotones que generan electrones necesarios para la
formación de ATP.
En la mayoría de los organismos fotosintéticos este ciclo energético tiene como
característica convertir elementos inorgánicos como el CO2 en Oxigeno
aportando este gas primordial para el mantenimiento de la vida y también de
producir cadenas complejas de carbono para la supervivencia de la planta como
la fructosa, glucosa y almidón; Este ciclo se puede dividir en 3 pasos donde
apreciamos procesos claros y evidentes:
PRIMER PASO - FIJACION DE CO2 (CARBOXILACION)
La primera etapa de carboxilación comprende la reacción de carboxilación y es
catalizada por la Rubisco. Esta es la enzima más abundante del cloroplasto y
probablemente la enzima más abundante de la biosfera.
Se activa por el choque de un fotón con el grupo carbamilo presente en núcleo
de la molécula de clorofila , El grupo carbamilo une inmediatamente una
molécula de magnesio, formando un carbamilato de magnesio y quedando así la
enzima lista para recibir ahora a los dos sustratos CO y 1,5 RuBP en su sito
activo, estos electrones se utilizan como fuente primaria de energia para exitar
la enzima RubisCO tomando los dos sustratos, 1,5 RuBP y CO2 , los que une
formando un compuesto inestable de 6 átomos de carbono que es el 2'-carboxi-
3-keto-d-arabinitol-1,5-bifosfato. Como es inestable, el intermediario se desdobla
inmediatamente en dos moléculas de 3-PGA y requiere 1 molecula de H2O

SEGUNDO PASO - REDUCCION / FOSFORILACION

En esta etapa de reducción del ciclo de Calvin se necesita ATP y NADPH que
se produce durante la fase luminosa de la fotosintesus, para convertir el 3-PGA
(3-fosfoglicerato) en 1,3-PGA (1,3 bifosfoglicerato) . Este proceso ocurre en dos
pasos principales:
En primer lugar, cada molécula de 3-PGA recibe un grupo fosfato del ATP y se
convierte en una molécula con doble fosforilación llamada 1,3-bisfosfoglicerato,
deja al ADP como subproducto

En segundo lugar, las moléculas de 1,3-bisfosfoglicerato se reducen (ganan

electrones). Cada molécula recibe dos electrones de la NADPH y pierde uno de
sus grupos fosfato para convertirse en un azúcar de tres carbonos llamado
gliceraldehído 3-fosfato (G3P). Este paso produce NADPH+

Así, parte del ATP y el NADPH sintetizados en la reacciones de transformación

de la luz en energía de enlace químico son gastados en las dos primeras
reacciones.
Para que un G3P salga del ciclo (y se dirija a la síntesis de glucosa), tres
moléculas de CO2 deben entrar en el ciclo, lo que resulta en tres nuevos átomos
de carbono fijo. Cuando tres moléculas de CO2 entran en el ciclo, se producen
seis moléculas de G3P. Una sale del ciclo y se utiliza para formar glucosa,
mientras que las otras cinco deben reciclarse para regenerar tres moléculas del
aceptor RuBP.

PASO TRES - RECUPERACION /REGENERACION

A esta reacción le sigue la isomerización de parte de las moléculas de 3-GAP
sintetizadas a dihidroxiacetona fosfato (DHAP).

En la próxima reacción una molécula de 3-GAP y una de DHAP se condensan

por acción de una aldolasa para entregar el primer compuesto de 6 carbonos
que es la fructosa 1,6 difosfato (1,6-FruDP).

Esta se defosforila por acción de una fosfatasa para dar una molécula fructosa 6
fosfato (6-FruP). Si en el ciclo entran 6 moléculas de 1,5-RuBP y 6 moléculas de
CO se formarán 3 moléculas de 1,6-FruBP y subsecuentemente 3 moléculas de
6-FruP. Sin embargo, la ganancia en Fru-6P que va a la síntesis de sacarosa es
sólo de una molécula. Los otras dos Fru-6P siguen el ciclo y van a recuperar a
la 1,5- RuBP (Fig. 6).
¿Qué tipos de fotosíntesis se conoce y en que se diferencian?