longitud de absorbancia
onda
400 0,263
420 0,15
450 0,115
470 0,153
480 0,221
500 0,287
520 0,325
550 0,298
570 0,2
580 0,276
600 0,228
620 0,16
640 0,091
MATERIALES
● Guantes.
● Bata.
● Gafas de laboratorio.
● Guardianes para desecho de corto-punzantes.
● Canecas de bolsa roja para el desecho de químicos y biológicos.
● Aguja sistema vacutainer.
● Camisa sistema vacutainer.
● Tubo vacutainer tapa lila.
● Torundas de Algodón.
● Torniquete.
● Toallas absorbentes.
● Tubos de 1,5 ml (microtubos) para Microcentrifuga, estériles y libres de DNasa.
● Puntas nuevas y estériles con capacidad para tomar micro-volúmenes entre 1 μl y 1000
μl.
● Columna en tubos de recolección PureLink.
● Tubos de recolección PureLink.
REACTIVOS
PROCEDIMIENTO
La muestra de ADN que se utilizo durante todo el procedimiento es sangre humana. Lo primero
que se hizo fue adicionarle 20 microlitos (20μl) de proteinasa K a 200 μl de la muestra de
sangre, para poder degradar los lipidos y las proteinas. Esta solucion se agito durante unos
breves minutos en un NO ME ACUERDO EL NOMBRE DEL APARATO, CREO QUE ES UN
VORTEX . Luego a la mezcla anterior se le adiciono 20μl de RNasa A, la cual corta el RNA del
DNA. La proteinasa K junto a la RNasa A, degradan la sangre. La solucion se mezclo en el
vortex durante 10 segundos energicamente. Luego esta, se dejo en incubacion durante 2
minutos. Cumplido el tiempo, se adiciono 200μl del reactivo Lysis/binding buffer y se paso a
mezclar en el vortex durante 10 segundos, hasta que se obtuvo una solucion homogenea. El
buffer amortiguó el pH, permitiendo que la solucion se uniera a la columna(NO ESTOY MUY
SEGURA DE ESTO). Luego de haber adicionado el buffer, se incubo la mezcla durante 10
minutos a una temperatura de 55ºC para promover la digestion. Una vez terminado el tiempo
de incubacion se le adiciono 200μl de etanol puro (96-100%), para luego mezclarlo en el vortex.
El etanol hace una lisis en el ADN, rompe los globuos rojos. Se incubo la solucion a 55ºC y se
aplico vortex ocasionalmente hasta que se completo el lisado (1-4 h).
Para la separacion de los componentes celulares no deseados y purificaicon del ADN, el
procedimiento fue::
ELECTROFORESIS
Agua destilada
EDTA dihidratado 3.72 g
Ácido Bórico 2.5 g
Tris Base 54 g
SYBR GREEN I 1μl
Dimetilsulfoxido anhidro (DMSO) 99μl
Equipos
-Cámara electroforética
-Microondas
-Balanza Analítica
-Fuente de poder 20-150V
-Cámara electroforética
-Transiluminador UV
Procedimiento
inicialmente se preparó 1L de Solución Stock 5x Buffer TBE con 3.72 g de EDTA dihidratado y
disolviendolo en 20 ml de agua destilada después de esto en un recipiente con capacidad de
1L se adiciono 2.5 g de Ácido Bórico y se mezcló con un poco de agua destilada para disolver
parcialmente.Después a esta mezcla se le adiciono 54 g de Tris Base y los 20 ml de la solución
EDTA 0.5 M, finalmente se aforó con agua destilada hasta completar 1L de solución.
para la Preparación de 1L de Solución de Trabajo TBE 0.5x se realizó una dilución 1:10
midiendo 100 ml de la solución stock en una probeta para Transferir los 100 ml de volumen a
un balón volumétrico o beaker y aforar hasta 1L con agua destilada (900 ml agua destilada).
para la Solución Stock SYBR GREEN I se realizó una solución 1:100 a partir del reactivo
original 10.000X para preparar un volumen de 100 μL y se Adiciono 1 μL de SYBR GREEN I
(Lozan) en un vial plástico de 1.5 ml para mezclarlo con 99 μL de DMSO al 100% (anhidro).
para la electroforesis se retiró la tapa SuperSafe que contiene los conectores para los cables
de los electrodos tipo barra.despues se Coloco la bandeja en la cámara electroforética en la
posición para servir el gel como se muestra en la Figura 3, asegurándose de que los empaques
de presión naranja queden contra la pared de la cámara y en posición perpendicular a los
electrodos. para la preparación se preparó 50 ml de agarosa al 2%, se pesa 1 g de agarosa se
adiciono a un Erlenmeyer y se aforó con Buffer TBE 0.5X hasta completar un volumen de 50
ml. luego se Calentó o en el microondas durante 30 segundos y se repitio este ciclo 3 o 4
veces hasta que la mezcla se disolvió completamente, evitando la formación de burbujas,
después se enfrió el gel de agarosa a 60ºC antes de servir en la bandeja, mientras que se
enfríaba la agarosa se colocó el peine de 1 mm en la bandeja como se muestra en la Figura 2,
numeral 2. para mas tarde Vaciar aproximadamente 28 ml de la solución de agarosa en el
molde para obtener un gel de 5 mm de espesor, si se usa la cámara Owl B1A. luego
seSolidificóo a temperatura ambiente durante 30-45 minutos para que se formaran ls pozos.
Una vez se solidificado el gel se retiró la bandeja de la cámara para cambiar a posición de
corrido como se muestra en la Figura 3, asegurándose que los empaques de presión queden
en posición paralela a los electrodos. para luego Llenar la cámara electroforética con TBE 0.5X
hasta cubrir el gel con aproximadamente un 1mm de solución arriba de la matriz de agarosa y
luego se retiro cuidadosamente el peine de una forma firme y rápida, y levantando lentamente
hacia arriba de la bandeja de gel para evitar daños a los pozos.
FIGURA 2
FIGURA 3
para el Marcador de Peso Molecular, se mezcló 2.5 μL de marcador con 0.5 μL de buffer de
carga 5X Green GoTaq Flexi Buffer, se Adiciono 0.5 μL de solución stock SYBR GREEN I
(1:100) y se sembraron los 3.5 μL en el pozo del gel.
Figura 4.
para las condiciones de corrido se colocó la tapa SuperSafe deslizándose sobre la cámara,
esta tapa lleva los conectores a la fuente de poder y debe estar conectada a los cables de
alimentación que tienen los electrodos tipo barra, se conecta el otro extremo de la fuente de
alimentación y se llevó a una toma eléctrica adecuada, completando el circuito. despues se
conecto la fuente de poder a 150 V, se monitorio cuidadosamente el gel para evitar que la
muestra se desvíe a otro carril, Luego se dejo correr el gel durante aproximadamente una
hora, cuando el gel haya terminado de correr y el azul de bromofenol en el buffer de carga haya
migrando la distancia requerida o hasta el final del gel, se apaga la fuente de poder y se deslizó
la tapa para desconectar de la energía.para después remover cuidadosamente la bandeja que
contiene el gel, esta bandeja permitio visualizar perfectamente el gel en un transiluminador UV
sin necesidad de remover el gel de la bandeja.
para la visualización de los amplificados se -Levantó la tapa ámbar y se coloco la bandeja con
el gel en el área de filtro, se encendió el transiluminador y se programó a una intensidad media,
para finalmente observar la formación de bandas discretas.
Elementos
PROCEDIMIENTO
Inicialmente se prepara una muestra blanco para indicar la absorbancia real de la proteina, el
blanco esta compuesto de 0.5 ml de agua, utilizado como solvente y 2 ml de reactivo biuret, en
una cubeta con el fin de que sea la muestra control. Luego la muestra tiene 0.5 ml de agua con
la proteina (albumina en polvo) y 2 ml del reactivo biuret; se espera aproximadamente 20
minutos para que …....y se procede en el espectrofotometro, a mirar la absorbancia de la
proteina a diferentes medidas de longitud de onda, con ello se mira a que longitud de onda se
da la mayor absorbancia. TABLA ….
A las tres muestras se les mide la absorbancia a la longitud de onda mayor (550 l) hallada con
la muestra inicial
va en resultados
para la primera muestra se da una absorbancia de 0.41, para la segunda muestra se da una
absorbacia de 0.087 y para la tercera de 0,175
para la muestra problema se debe considerar la concentracion, la cual se debe hallar, con una
absorbacia de 0.039 a una longitud de onda de 550
no se para que nos dan 2 concentracioñnes mas . creo no estoy segura niveles de
absorbancia ximena
x1 0,081
x2 0,004
X1= 0,081
X2= 0,004
X3= 0,039
0.41
0,087
0,175 al parecer absorbancia pero no estoy segura
1. introduccion
2. materiales y procedimiento
2.1 extraccion de ADN
2.2 electroforesis
2.3 cuantificacion de proteinas
3. resultados
4. discucion (analisis)
5. conclusion
6.referencia bibliografica,
1.INTRODUCCION
3. RESULTADOS
En la extraccion del ADN el resultado final es una solucion que contiene el ADN, esta solucion
es la que se utilizo en el gel de electroforresis. En el gel de electrorforesis por medio de las
bandas que fueron visibles a traves de luz ultravioleta, se pudo determinar la calidad y cantidad
del ADN con el que estabamos trabajando. Este resultado se puede concluir a partir de que tan
visible es la muestra en cada carril de electroforesis.
4. DISCUSION
6. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA
- PROTEINASA K: es una enzima que degrado lipidos y proteinas de las membranas celulares.
Es importante porque el RNasa separa el RNA del ADN, entonces va a permitir un mejor lisado
de la solcuion al estar esta dividida en fragamentos mas pequeños. La RNasa A ataca los
especificamente los fosfatos unidos a nucleotidos de pirimidinas en presencia de iones
monovalentes.
3. DESCRIBIR QUE ACCION TIENE CADA UNO DE LOS COMPONENTES DEL BUFFER DE
LISIS Y EL BUFFER DE ABSORCION
En este método se utiliza un buffer que contiene Proteinasa K ( Tris-HCl, pH 8.3,Tween 20, Nonidet P40,
Proteinasa K), la cual destruye las membranas nucleares, liberando a la solución los ácidos nucleicos. El
paso siguiente consiste en la precipitación de los ácidos nucleicos, ya que el DNA presente en
soluciones con alta concentración de sales acetato de sodio (AcONa) puede precipitarse mediante la
adición de alcohol etílico a dichas soluciones. [3]
Algunas de las ventajas que tiene el usar el metodo de separacion de ADN por absorcion
en matriz de silíca o columna de filtracion, son:
[1]http://www.google.com.co/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=web&cd=3&ved=0CFU
QFjAC&url=http%3A%2F%2Fiib.org.ar%2Fbajar_material.php%3Farchivo%3D120.doc&ei=E6n
GT-T3C7CI6AG2_LXoBg&usg=AFQjCNH4qlbI0AOV41sC_1dupDBWCfSPrQ&sig2=_x_EG4d2
nawEMwOOUx0vbw
[2] http://en.wikipedia.org/wiki/Phenol%E2%80%93chloroform_extraction
[3]
http://www.elportaldelasalud.com/index.php?option=com_content&task=view&id=127&Itemid=1
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