Praktikum Biokimia - Identifikasi DNA
Praktikum Biokimia - Identifikasi DNA
PENDAHULUAN
1.1. Tujuan
Tujuan dari percobaan identifikasi asam nukleat ini adalah mengerti cara cara
identifikasi senyawa penyusun asam nukelat.
Asam nukleat merupakan molekul terbesar yang ditemukan dalam tubuh. Asam
nukelat pertama kali ditemukan dari inti (nukleus) sel oleh ahli biokimia Swiss Mescher.
Asam nukleat merupakan polimer dan satuan pembentuknya adalah nukleotida. Setiap
nukleotida terdri dari gugus fosfat, gula dengan lima karbon, basa yang mengandung
nitrogen ( James, 2008 ).
Terdapat dua jenis asam nukleat yaitu asam deoksiribonukleat ( DNA ) dan asam
ribonukleat ( RNA ). Asam asam ini adalah molekul yang membuat organisme hidup
dapat memproduksi komponen komponen kompleksnya dari satu generasi ke generasi
berikutnya. DNA dapat mengarahkan sintesis RNA, mengontrol sintesis protein melalui
RNA. DNA adalah materi genetik yang diwaris organisme dari orangtuanya ( Campbell,
2009 ).
DNA RNA
Sintesis protein terjadi di dalam sel. Sintesis protein berlangsung melalui dua
tahap, yaitu: transkripsi dan translasi. Transkripsi adalah proses pembentukan RNA d
oleh DNA template, proses ini berlangsung ketika enzim RNA polymerase melekat pada
nukleotida DNA sehingga pasangan DNA itu lepas dan salah satu rantai melakukan
pencetakan. Translasi adalah proses penterjemahan kode genetika dalam sintesis protein.
Proses translasi adalah dengan melekatnya RNA d ke ribosom, maka RNA t menjadi
aktif dan mengikat asam-asam amino di sekitarnya, kemudian masing-masing
membawanya ke ribosom. Bagian ujung yang melilit RNA t itu berkaitan dengan RNA d
lewat titik basa masing-masing. Titik basa RNA t yang setangkup dengan titik basa RNA
d (kodon) disebut antikodon. Jadi antokodon mengikat dan mengangkut asam amino
khusus sesuai dengan kode yang terdapat pada RNA duta (Poedjiadi, 2006).
1.3. Tinjauan Bahan
1.3.1. Ammonium Molibdat
Kalium fosfat berbentuk padatan berwarna putih dan memiliki pH 8,8 , memiliki
berat molekul 174,18 g/mol. Mudah larut di air dingin, air hangat, sedikit larut di alkohol.
Berbahaya jika terhirup, tertelan, dan dapat menyebabkan iritasi jika terkena kulit dan
mata (Sciencelab,2012).
Asam Sulfat berbentuk cair tidak bewarna dan bersifat asam , memiliki berat
molekul 98,08 g/mole, memiliki titik didih 270˚ C dan memiliki titik leleh sebesar -35˚
C. Mudah larut di air dingin, etil alkohol. Berbahaya jika terhirup, tertelan, dan dapat
menyebabkan iritasi jika terkena kulit dan mata (Sciencelab,2012).
Asam asetat glasial berbentuk cair, tidak berwana memiliki bau kecut yang khas.
Berat molekul senyawa ini adalah 60,05 gr.mol-1, ia akan mendidih pada suhu 118,1oC
dan akan melebur pada suhu 16,6oC . Mudah larut di air dingin, air hangat, dietil eter,
aseton. Berbahaya jika terhirup, tertelan, dan dapat menyebabkan iritasi jika terkena kulit
dan mata (Sciencelab,2012).
1.3.5. HNO3
Asam nitrat ( HNO3) berbentuk cair tidak bewarna hingga berwarna kuning
terang dan bersifat asam , memiliki titik didih 121˚ C dan memiliki titik leleh sebesar -
41,6˚ C. Mudah larut di air dingin, air hangat, dietil eter. Berbahaya jika terhirup, tertelan,
dan dapat menyebabkan iritasi jika terkena kulit dan mata (Sciencelab,2012).
1.3.6. Ammonia
Ammonia merupakan senyawa gas dengan formula NH3, tidak berwarna, berbau
sengit, larut dalam air dan menghasilkan larutan alkali yang mengandung NH4OH (Basri,
2005).
1.3.7. Difenilamin
Perak nitrat berbentuk padatan , tidak berwarna ,memiliki berat molekul 169,87
g/mol, memiliki titik didih 440˚ C dan memiliki titik leleh sebesar 212˚ C . Mudah larut
di air dingin,dietil eter. Berbahaya jika terhirup, tertelan, dan dapat menyebabkan iritasi
jika terkena kulit dan mata (Sciencelab,2012).
1.3.9. Orsinol
METODOLOGI
2.1.Alat
Alat yang digunakan antara lain tabung reaksi, rak tabung reaksi, pipet tetes,
pipet ukur, pipet volume, penangas air, corong pisah, botol semprot, gelas kimia.
2.2. Bahan
Bahan yang digunakan dalam percobaan ini antara lain asam sulfat , DNA,
RNA, larutan ammonium molibdat , HNO3 pekat, aquades, hidrolisa asam nukleat,
kalium fosfat, difenilamin ,asam asetat glasial, orsinol, larutan AgNO3 , ammonia
pekat.
ditambah 10 ml H2SO4 1 M
Hasil
Hasil
2.3.2. UjiFosfat
10 g ammonium molibdat
2.3.3. UjiDeoksiribosa
Hasil
2.3.4. UjiRibosa
Hasil
2.3.5. UjiBasaPurin
Hasil
BAB III
No Perlakuan Pengamatan
4. Larutan didihkan Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada
selama 3 menit perubahan perubahan perubahan perubahan
warna dan warna dan warna dan warna dan
tidak ada tidak ada tidak ada tidak ada
endapan endapan endapan endapan
3.2.Uji fosfat
No Perlakuan Pengataman
No Perlakuan Pengataman
No Perlakuan Pengataman
No Perlakuan Pengataman
PEMBAHASAN
Langkah awal yang perlu dilakukan untuk menghidrolisis asam nukleat adalah
hasil isolasi asam nukleat dimasukkan ke dalam kuvet yang kemudian dilakukan
sentrifugasi untuk memisahkan antara pelarut dengan filtratnya. Kemudian, endapan
yang terbentuk atau asam nukleat ditambah dengan larutan H2SO4 pekat 10 mL dan 30
mL aquades. Larutan H2SO4 pekat berfungsi sebagai larutan untuk membuat larutan
bersuasana asam. Sementara aquades digunakan sebagai pengencer larutan karena
H2SO4 yang digunakan terlalu pekat sehingga dapat merusak asam nukleat bila tidak
diencerkan. Selanjutnya larutan didihkan selama 3 menit untuk mempercepat reaksi
hidrolisis.karena larutan yang terbentuk tidak ada endapan, maka tidak perlu
dilakukan penyaringan. Filtrat yang terbentuk siap untuk diuji fosfat, basa purin,
ribosa dan deoksiribosa.
Hasil yang didapat dari hidrolisis asam nukleat ini adalah sebelum dilakukan
sentrifugasi kecambah kepala kecil, ekor besar dan kecil keruh dan terdapat endapan
berwarna putih,dan kecambah kepala besar kuning keruh dan terdapat endapan
kuning, namun setelah dilakukan sentrifugasi kecambah kepala kecil, ekor besar dan
kecil menjadi endapan putih, sedangkan kepala besar memilki endapan kuning
kecoklatan, ketika penambahan asam sulfat pekat dan aquades kecambah kepala kecil
menjadi coklat tua bening, kepala besar menjadi coklat muda bening, ekor kecil
menjadi kuning kehijauan dan ekor besar larutannya menjadi coklat kemerahan,
pendidihan menyebabkan larutan tidak mengalami perubahan, karena asam nukleat
larut dalam pelarut asam, sehingga memepermudah untuk proses selanjutnya.
Prinsip percobaan uji fosfat adalah menguji adanya gugus fosfat dalam sampel
asam nukleat yang dilakukan dengan cara menambahkan asam molibdat dalam larutan
hidrolisat asam nukleat yang kemudian dipanaskan selama 5 menit. gugus fosfat yang
positif dapat ditunjukkan dengan adanya edapan kuning.
Langkah awal yang dilakukan ialah mempipet larutan hasil hidrolisat asam
nukleat ke dalam tabung reaksi sebanyak 1 mL lalu ditambahkan 3 mL larutan
ammonium molibdat sebagai larutan untuk menguji keberadaan fosfat dalam larutan
hidrolisa asam nukleat. Selanjutnya, dipanaskan pada suhu 47o C untuk mempercepat
reaksi. Namun setelah 5 menit pemansan suhu dinaikkan menjadi 50o C.
Hasil yang didapat dari uji fosfat adalah hidrolisat asam nukleat sebelum
ditambahkan asam molibdat, kepala besar dan kepala kecil berwarna coklat jernih,
ekor besar berwarna merah muda jernih, ekor kecil berwarna kuning jernih, namun
setelah ditambahkan asam molibdat larutan pada masing-masing sampel menjadi
tidak berwarna dan ketika dipanaskan pun tidak mengalami perubahan warna, namun
ketika suhunya diperbesar pada kepala besar, kepala kecil dan ekor kecil terdapat
endapan kuning yang agak larut, hal ini menunjukkan bahwa terdapat gugus fosfat
didalamnya, sedangkan pada ekor besar tidak mengalami perubahan artinya tidak ada
gugus fosfat yang terkandung didalamnya. Hal ini menandakan bahwa kecambah ekor
besar merupakan nukleosida karena tidak memiliki fosfat
Langkah awal yang dilakukan untuk uji ini ialah larutan hasil hidrolisa asam
nukleat dipipet sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang
kemudian ditambahkan dengan 2 mL reagen dische. Reagen dische berfungsi sebagai
larutan yang mengindikasikan adanya gula deoksiribosa dalam larutan. Kemudian,
larutan campuran tersebut dipanaskan pada suhu 47o C selama 5 menit untuk
mempercepat reaksi. Lalu diamati warna larutan yang terbentuk.
Hasil yang didapat adalah sebelum penambahan reagen dische larutan pada
kepala besar dan kecil berwarna coklat bening, ekor besar berwarna merah muda
bening, dan ekor kecil berwarna hijau bening, ketika ditambahkan reagen dische
hidrolisat asam nukleat pada masing-masing sampel berwarna biru tua pekat, dan
pada pemanasan dengan suhu 40oC semua sampel berwarna biru pekat. Hal ini
menunjukkan bahwa semua larutan sampel baik kecambah ekor besar dan kecil
maupun kecambah kepala besar dan kecil positif terhadap uji ini. Atau semua sampel
tersebut mengandung gula deoksiribosa.
4.4. Uji ribosa
Prinsip percobaan uji ribosa adalah menguji keberadaan ribose dalam larutan
sampel dengan penambahan reagen orsinol, sebagai larutan yang mengindikasikan
adanya ribose. Selain itu, dilakukan juga pemanasan untuk mempercepat reaksi.
Apabila larutan memiliki gula ribose, maka larutan akan mengalami perubahan dari
kuning menjadi hijau sebagai hasilnya.
Langkah awal yang dilakukan untuk uji ini ialah larutan hidrolisat asam
nukleat dipipet sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian
ditambah larutan orsinol 1 mL. larutan orsinol berfungsi sebagai reagen yang
mengindikasikan adanya ribosa dalam larutan. Kemudian dilakukan pemanasan
selama 5 menit pada suhu 40o C untuk mempercepat reaksi.
Hasil yang didapat dari percobaan ini adalah sebelum penambahan reagen
orsinol larutan pada kepala besar dan kecil berwarna kuning kecoklatan, ekor besar
berwarna merah muda dan ekor kecil berwarna kuning, setelah penambahan reagen
orsinol larutan berubah warna menjadi kuning dan ketika pemanasan pada suhu 40o C,
terjadi perubahan warna menjadi kehijauan pada ekor besar dan ekor kecil sedangkan
pada kepala besar dan kepala kecil tidak mengalami perubahan artinya larutan tetap
berwarna kuning. Hal ini menunjukkan bahwa kecambah ekor besar besar dan ekor
kecil memiliki ribosa. Namun, kecambah kepala besar dan kecil tidak memiliki ribosa
karena tidak terbentuk larutan berwarna hijau sebagai hasil akhirnya. Tidak mungkin
dalam suatu asam nukleat memiliki ribosa dan deoksiribosa sekaligus. Karena,
deoksiribosa merupakan tanda bahwa larutan atau sampel tersebut merupakan DNA.
Sedangkan ribose merupakan tanda bahwa sampel tersebut merupakan RNA.namun,
pada kecambah ekor besar dan kecil, mereka memiliki baik ribosa maupun
deoksiribosa. Hal ini dikarenakan adanya kerusakan pada DNA akibat proses
pengadukan yang terlalu kencang pada proses isolasi asam nukleat serta proses
inkubasi yang kurang optimum. Sehingga berdampak pada struktur asam nukleat.
Namun yang paling parah menerima dampaknya ialah kecambah ekor besar dan ekor
kecil. Sehingga susunannya tidaklah teratur. Hal tersebutlah yang menyebabkan
kecambah ekor besar dan ekor kecil tersebut dapat bereaksi baik dengan orsinol
(reagen uji ribosa) maupun dengan dische (reagen uji deoksiribosa). Sehingga, mereka
menyatakn positif terhadap uji keduanya.
Prinip percobaan uji basa – basa purin adalah menguji keberadaan basa purin
pada kecambah atau sampel. Dimana, larutan hidrolisat asam nukleat ditambahkan
dengan ammonium dan AgNO3. Apabila sampel positif terhadap uji ini maka akan
terbentuk endapan berwarna putih.
Langkah awal yang dilakukan ialah sebanyak 0,5 mL larutan hidrolisat asam
nukleat dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan dengan
ammonium 10 tetes agar larutan bersuasana basa. Selanjutnya ditambahkan 10 tetes
AgNO3 untuk membentuk endapan putih. Namun karena 10 tetes masih kurang, maka
ditambahkan AgNO3 berlebih agar terbentuk endapan putih yang menandakan adanya
basa purin dalam sampel.
Hasil yang didapat dari uji basa – basa purin adalah sebelum penambahan
ammonium larutan pada kepala besa, kepala kecil dan ekor kecil berwarna orange
bening, ekor besar berwarna merah muda, namun ketika penambahan penambahan
ammonium 10 tetes larutan pada masing-masing sampel berwarna bening kekuningan.
Pada penmabahan Ag NO3 larutan berubah warna menjadi bening dan tidak ada
endapan putih yangg sedikit larut, hal ini menunjukan bahwa baik kecambah ekor
besar dan kecil maupun kepala besar dan kecil negatif terhadap uji basa purin. Atau
tidak mengandung senyawa basa burin dalam susunan asam nukleatnya. Hal ini
dikarenakan keadaan awal asam nukleat hasil isolasi sudah rusak. Sehingga,
mempengaruhi uji-uji yang lainnya. tidak memungkinkan suatu asam nukleat tidak
memiliki basa purin di dalamnya. Hasil uji yang negatif terhadap uji ini menunjukkan
bahwa asam nukleat yang digunakan sebagai sampel dalam keadaan rusak, yang
memungkinkan, basa purinnya hancur.
BAB V
PENUTUP
5.1. Kesimpulan
Kesimpulan dari percobaan ini ialah bahwa uji identifikasi senyawa penyusun
asam nukleat dapat dimulai dengan menghidrolisis asam nukleat terlebih dahulu untuk
memperudah identifikasi senyawa penyusunnya. Selanjutnya dapat dilakukan uji-uji
senyawa penyusunnya seperti uji ribosa, uji deoksiribosa, uji basa purin, dan uji fosfat.
Hasil dari uji ini ialah untuk uji fosfat semua menunjukkan hasil positif terkecuali
kecambah ekor besar. Untuk uji deoksiribosa, semua sampel menunjukkan hasil
positif. Uji ribose, yang menunjukkan hasil uji positif ialah kecambah ekor besar dan
kecil. Sedangkan untuk basa purin, tidak ada sampel yang menunjukkan hasil positif.
Hal ini menandakan bahwa sususan asam nukleat sudah rusak saat proses isolasi.
Karena, hasil identifikasinya tidak memberikan hasil yang sesuai.
5.2. Saran
Untuk praktikum identifikasi DNA, jangan sampai salah memilih bahan dan
praktikan harus menguasai job desknya masing-masing.
DAFTAR PUSTAKA
Campbell, Neil A et all. 2009. Biology Consepts and Connection. San Fransico : Pearson
Benjamin Cummings.
James, Joyce. 2008. Principles of Sciece for Nurses. England : Blackwell Publishing.
Sloane, Ethel, 2004. Anatomy And Phsiology . Sudbury: Jonwa and Bartlet Publisher.
Reaksi-reaksi
1. Isolasi Asam Nukleat
3. Uji Fosfat
4. Uji Deoksiribosa
5. Uji Ribosa
6. Uji Purin