Anda di halaman 1dari 9

Laporan Praktikum Hari/Tanggal : Senin/ 27 November 2017

Biokimia Waktu : 10.00 – 12.00 WIB


PJP : Ukhradiya M Safira, M.Si
Asisten : 1. Rini Kurniasih, S.Si
2. Farhan Azhwin M, S.Si

ISOLASI DNA KROMOSOM

Kelompok 3

Rizki Nasyasavitri J3L116117


Lulu Dwiana J3L216157
Tika Wulandari J3L216197
Rahma Arizka J3L216175
Lihardo Renaldi R S J3L116073

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA


DIREKTORAT PROGRAM DIPLOMA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2017
PENDAHULUAN

Polinukleotida merupakan polimer mononukleotida dan terdiri atas


dua golongan, yaitu asam deoksiribonukleat (DNA) dan asam ribonukleat (RNA)
(Wirahadikusumah 1985). Deoxyribosa Nucleic Acid (DNA) adalah asam nukleat
yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan
biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus,
mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara ketiganya adalah DNA nukleus
berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA
mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein
histon. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya
mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan
DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihatdari
organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNAeukariot. DNA
prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA
eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon (Harrow 1954).

RNA (Rybonucleic Acid) atau asam ribonukleat merupakan makromolekul


yang berfungsi sebagai penyimpan dan penyalur informasi genetik. RNA sebagai
penyimpan informasi genetik misalnya pada materi genetik virus, terutama golongan
retrovirus. RNA sebagai penyalur informasi genetik misalnya pada proses translasi
untuk sintesis protein. RNA juga dapat berfungsi sebagai enzim yang dapat
mengkalis formasi RNA-nya sendiri atau molekul RNA lain (Harper 1950).
Berdasarkan fungsi biologinya, dibedakan tiga macam RNA, yaitu mRNA sebagai
penyampai pesan, rRNA sebagai tempat molekul protein disintesis, dan tRNA
sebagai pengangkut asam amino dari satu lokasi ke rRNA untuk disintesis menjadi
molekul protein (Hawab 2003).

Beberapa perbedaan DNA dengan RNA di antaranya pada bagian pentosa


RNA adalah ribosa, sedangkan bagian pentosa DNA adalah deokiribosa, bentuk
molekul DNA adalah heliks ganda, sedangkan RNA berupa rantai tunggal yang
terlipat sehingga menyerupai rantai ganda, RNA mengandung basa adenin, guanin,
dan sitosin seperti DNA, tetapi tidak mengandung timin dan sebagai gantinya RNA
mengandung urasil, jumlah guanin dalam molekul RNA tidak perlu sama dengan
sitosin, demikian pula jumlah adenin tidak harus sama dengan urasil (Poedjiadi
1994).

Sentrifugasi merupakan salah satu metode dasar yang sangat penting dalam
studi biologi sel maupun biologi molecular. Sentrifugasi tidak hanya dapat digunakan
untuk memisahkan sel atau organel subselular, tetapi juga untuk pemisahan
molekular (Yuwono T 2008). Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan
substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal
sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang
lebih ringan akan berada di atas.

Spektrofotometri UV/VIS merupakan suatu metode analisis yang didasarkan


pada pengukuran energi cahaya tampak atau cahaya ultraviolet oleh suatu senyawa
sebagai fungsi dari panjang gelombang. Spektrofotometer UV/VIS didasarkan pada
hukum Lambert Beer yang mana apabila seberkas sinar dengan intensitas tertentu
melalui suatu materi maka sejumlah sinar akan diabsorpsi dan sebagian lain
diteruskan. Banyaknya sinar yang diabsorpsi oleh suatu senyawa tergantung dari
konsentrasi senyawa tersebut dalam contoh dan panjang jalan cahaya yang melalui
contoh (Khopkar 1990).

TUJUAN PERCOBAAN

Praktikum ini bertujuan untuk mengisolasi DNA kromosom dari umbi


bawang merah.
METODE

Waktu dan Tempat Praktikum

Praktikum ini dilakukan di kampus Gunung Gede laboratorium kimia


GGKIM 01 IPB. Waktu praktikum yaitu hari Senin 27 November 2017, pukul 10.00
sampai 12.00 WIB.

Alat dan Bahan


Alat-alat yang digunakan adalah neraca, blender, gelas piala, water bath,
corong, Erlenmeyer, kertas saring, batang pengaduk, tabung reaksi, eppendorf,
microsentrifuge, dan vortex.

Bahan-bahan yang digunakan adalah bawang merah, sodiumdodecyl sulphate


10% (SDS), garam NaCl, fenol, kloroform, etanol (EtOH), larutan lisis, dan TE
buffer/dH2O steril.

Prosedur penelitian
Umbi bawang merah yang sudah dikupas dari kulitnya di timbang sebanyak
25 gram. Bawang merah yang sudah di timbang kemudian dihaluskan menggunakan
blender. Penghalusan untuk mengambil ekstrak bawang dibantu dengan penambahan
80 ml larutan lisis dan 3 gram garam. Bawang merah yang sudah diblender kemudian
dituang ke dalam gelas piala dan ditambahkan 10 ml SDS 10% dan selanjutnya di
inkunbasi pada penangas air dengan suhu 60OC sambil sesekali diaduk selama ±20
menit. Ekstrak bawang merah yang sudah diinkubasi kemudian disaring dan
ditampung pada gelas piala yang disimpan didalam penangas es. Filtrat kemudian
ditambahkan larutan fenol dingin dan kloroform dengan perbandingan 1:1 sesuai
volume filtrat. Filtrat kemudian didiamkan di dalam lemari asam selama 15 menit dan
akan terbentuk 2 lapisan. Lapisan atas pada filtrate kemudian dipindahkan dan
ditambahkan etanol. Endapan DNA kromosom akan mengendap di atas dan
berbentuk serabut-serabut seperti benang putih. Endapan DNA pada lapisan atas
kemudian dipipet dan dipindahkan ke dalam eppendorf dan disentrifus. Supernatan
dipisahkaan dari endapan DNA kemudian ditambahkan etanol kembali dan
disentrifus kembali. Hasil larutan yang disentrifus kemudian dipindahkan ke dalam
gelas piala dan didiamkan sampai etanol menguap selama 10 menit, lalu ditambakan
TE larutan buffer sebanyak 1 ml dan diukur absorbansinya menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Prinsip isolasi DNA kromosom ialah memisahkan DNA kromosom atau DNA
genom dari komponen-komponen sel lain menggunakan teknik sentrifugasi. Sumber
DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia. Molekul DNA pada
semua macam sel terdiri atas unit-unit keempat mononukleotida utama, d-AMP, d-
GMP, d-TPM, dan d-CMP yang dihubungkan dalam suatu variasi deretan oleh ikatan
fosfodiester yang ditunjukkan oleh gambar 1 sebagai berikut :

CH2 O Basa 1
CH2 O Basa 1
H H
H H H
H H H
O H
O HO
HO P O HO P O
O O
H2C Basa 2 Basa 2
O H2C O
H H H H
H H H H
O H O OH
HO P O HO P O
O O
CH2 Basa 3 CH2 Basa 3
O O
H H H H
H H H H

O H O OH

DNA RNA

a b
Gambar 1 Struktur polinukleotida pada DNA (a) dan RNA (b); ikatan fosfodiester
menghubungkan hidroksil -3’ pada nukleotida yang satu dengan gugus
hidroksil -5’ pada nukleotida yang berikutnya (Wirahadikusumah 1985)

Isolasi DNA kromosom pada percobaan ini menggunakan umbi bawang


merah. Penggunaan umbi bawang merah sebagai sumber pengisolasian DNA
kromosom karena umbi bawang memiliki sedikit pati sehingga DNA akan terlihat
akan lebih jelas dan mudah diisolasi. Setiap percobaan manipulasi gen membutuhkan
sumber asam nukleat yang membentuk DNA atau RNA. Metode yang sesuai
merupakan hal penting dalam isolasi komponen tersebut di dalam sel. Prosedur
isolasi DNA secara umum terbagi menjadi 3 tahap yaitu pemecahan sel atau
jaringan/sel dilisis untuk membebaskan isinya, ekstrak sel diberi perlakuan untuk
menghilangkan semua komponen kecuali DNA, dan pemekatan larutan DNA yang
telah diperoleh.
Daun bawang ditambah air lisis dan garam kemudian dihaluskan dengan
blender, penghalusan dengan blender bertujuan untuk mendegradasi dan melarutkan
komponen dinding sel. Larutan lisis berfungsi untuk melisis dinding sel. Garam yang
digunakan adalah garam NaCl. NaCl dapat menyebabkan menyebabkan DNA
menjadi larut karena ion Na+ mampu membentuk ikatan dengan kutub negatif fosfat
DNA yaitu kutub yang bisa menyebabkan molekul-molekul saling tolak menolak satu
sama lain sehingga pada saat ion Na+ membentuk ikatan dengan kutub negatif fosfat
DNA. Hal ini akan menyebabkan DNA akan terkumpul (Murray 2000). Setelah itu
ditambahkan SDS 10% yang berfungsi untuk pemecahan sel dengan mengemulsi
lipid dan protein serta mengganggu interaksi polar pada membran sel. Kemudian
diinkubasi pada suhu 60° selama 20 menit bertujuan untuk menginaktifasi enzim
yang mendegradasi DNA (DNase). Kemudian larutan disaring menggunakan corong
dan diletakkan diatas es batu. Hal itu dikarenakan proses pekerjaan isolasi DNA harus
dilakukan pada suhu rendah untuk mempertahankan kromosom DNA yang tidak
tahan panas dan dapat mengalami denaturasi akibat suhu yang terlalu tinggi (Schmid
2003).
Kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan fenol dan kloroform dengan
perbandingan 1:1 yang berfungsi mendegradasi protein dan RNase yang berfungsi
untuk mendegradasi RNA, sehingga yang tersisa adalah DNA. Setelah didiamkan 20
menit, ditambahkan etanol dingin yang berfungsi dalam pengikatan strand DNA yang
telah terkumpul kerena pemekatan oleh garam sehingga DNA menjadi pekat. Hal ini
karena kerapatan alkohol lebih kecil dibandingkan kerapatan air maka alkohol akan
berada di bagian atas. Strand-strand DNA yang terikat oleh alkohol akan nampak
sebagi benang-benang putih yang terapung di atas filtrat. Benang-benang DNA
berwarna putih pada lapisan atas larutan diambil dan dimasukkan dalam tabung
eppendorf untuk disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 rpm. Sentrifugasi berfungsi
untuk memisahkan DNA kromosom dari komponen lain seperti protein ataupun
RNA. DNA kromosom yang memiliki bobot molekul lebih besar akan berada
dibagian dasar setelah disentrifugasi. Berdasarkan percobaan dapat dilihat DNA yang
berbentuk benang-benang halus, namun tidak terlihat jelas karena jumlahnya yang
sangat sedikit. Hasil tersebut dapat dilihat pada gambar berikut :

Gambar 2 Hasil isolasi DNA pada umbi bawang merah


Pengukuran secara kuantitatif DNA dilakukan dengan menggunakan
spektrofotometer UV-Vis, namun pada percobaan ini tidak dilakukan. Sehingga
hanya dilakukan secara kualitatif saja. Metode spektrofotometri digunakan untuk
melihat kemurnian dan konsentrasi DNA. DNA memiliki panjang gelombang
maksimum pada 260 nm sedangkan RNA memiliki panjang gelombang maksimum
pada 280 nm. Pemilihan panjang gelombang maksimum ini bertujuan agar diperoleh
konsentrasi DNA dan RNA lebih tepat dan teliti, karena jika pengukuran tidak
melalui panjang gelombang maksimum maka akan menyebabkan kesalahan respon
pada alat cukup besar jika terjadi sedikit perubahan yang tidak diinginkan pada
pengukuran. Berdasarkan penelitian Storms (1998), konsentrasi DNA dan RNA pada
umbi bawang merah untuk ulangan pertama masing-masing sebesar 55 µg/mL dan
119 µg/mL sedangkan untuk ulangan kedua masing-masing sebesar 115 µg/mL dan
40 µg/mL. Nilai rasio untuk DNA untai ganda murni yaitu 1,8-2,0. Nilai rasio di
bawah 1,8 menunjukkan adanya kontaminan senyawa berat molekul besar misalnya
protein. Nilai rasio di atas 2,0 menunjukkan adanya kontaminan senyawa berat
molekul kecil misalnya RNA.
Kualitas hasil isolasi DNA kromosom dapat diukur melalui keutuhan yaitu
tidak terfragmentasi dan kemurnian yaitu bebas kontaminan yang sangat penting
untuk berbagai keperluan rekayasa genetika.

SIMPULAN

Berdasarkan hasil percobaan isolasi DNA umbi bawang merah yang telah
diisolasi DNA terdapat kromosom terdapat DNA berupa benang-benang heliks
berwarna putih yang jumlahnya sangat sedikit sehingga tidak terlihat jelas.

DAFTAR PUSTAKA

Harrow. 1954. Textbook Of Biochemistry 6th Edition. U.S.A: Saunders Company.

Harper et al. 1980. Biokimia (Review of Physiological Chemistry) Edisi 17.


Jakarta(ID): EGC.
Hawab HM. 2003. Pengantar Biokimia. Malang: Bayumedia.
Khopkar SM. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Saptorahardjo A, penerjemah.
Jakarta(ID): UI Press. Terjemahan dari: Basic Concepts of Analytical
Chemistry.
Murray, Robert K. 2000. Biokimia Kedokteran. Hartono A, penerjemah. Jakarta (ID) :
Penerbit Erlangga.

Poedjiadi A. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI Press.


Schmid R. 2003. Pocket Guide to Biotechnology and Genetic Engineering. German:
Wiley-VCH.

Storms WN. 1998. Investigation of DNA extraction at the University of North


Carolina at Pembroke [tesis]. Carolina: Universitas Carolina Utara
Press.
Wirahadikusumah M. 1985. Biokimia: Metabolisme Energi, Karbohidrat, dan Lipid.
Bandung(ID): ITB Press.
Yuwono T. 2009. Biologi Molekular. Jakarta (ID): Penerbit Erlangga.

Anda mungkin juga menyukai