Universidad Autónoma de Yucatán.

Facultad de Ingeniería Química.

Microbiología

ADA 3. Análisis de artículo científico.

Equipo 9:
Castillo Noh Jonathan Emir
Ochoa Álvarez Alejandro
Puc Kantún Luis Enrique
Soto Broca Alejandro
Uc Hau Roger Abraham

Fecha de entrega: 26 de febrero de 2019

 *** Dejaré esta hoja como rubrica luego la eliminamos comenzaremos en la
siguiente hoja ***

Introducción. Objetivo del ejercicio de análisis del tema (NO del artículo),
información general que lleve al lector a comprender la importancia o aportación de la
publicación. Objetivo breve y claro del artículo.
(20 puntos): Pertinencia de la información, declaración de la importancia o aportación
del artículo, diferenciación entre el objetivo de este ejercicio y el objetivo del artículo
seleccionado.

Desarrollo Explicación del trabajo reportado (Qué se hizo, cómo se hizo y

resultados). Enfocar la explicación al objetivo de este ejercicio de análisis. Deberá
incluir al menos la clasificación de los medios de cultivo reportados, composición de los
medios de cultivo, identificación de los ingredientes que cubren los requerimientos
nutricionales de los microorganismos, condiciones físicas utilizadas, estrategias de
evaluación del crecimiento microbiano. Pueden utilizar cuadros o figuras de los artículos
o elaboración propia. Conclusión del artículo.
(40 puntos): Análisis fundamentado del artículo, aportaciones a la comprensión del
artículo, integración de información general con el ejemplo en el artículo analizado,
aportaciones propias en la presentación sintetizada de resultados. Profundidad en el
análisis.

Conclusión del ejercicio de análisis. (No de la publicación) Listado de referencias

(incluir la referencia del artículo seleccionado) Anexo. Diapositivas preparadas para
presentar el avance del análisis (4 diapositivas por página) El documento deberá tener
entre cinco y seis cuartillas escritas en letra arial 10 con interlineado 1.15
(incluyendo el listado de referencias y el anexo de la presentación). Recuerden incluir y
referenciar la bibliografía consultada en el texto. Para la asignación del puntaje se
considerará el buen uso del idioma (redacción y ortografía).
(10 puntos): Cierre del análisis vinculando al objetivo del análisis del tema (No al
objetivo del artículo analizado).

Estructura (15 puntos): De acuerdo a las instrucciones

Presentación PP(15 puntos): Estructura, organización de la información, calidad de la
presentación.
 Introducción
La importancia del análisis de un medio de cultivo va más allá de solo saber los componentes que tiene
en si el medio y para qué microorganismos aplica; la importancia real radica en saber relacionar todos
estos valores para optimizar el cultivo de microorganismos en el medio. La optimización de estos medios
puede ser mediante modificaciones en las condiciones físico-químicas y en los requerimientos
nutricionales del propio medio. Todo dependerá del objetivo general que planteemos hacer con nuestro
cultivo y microorganismos.
La detección del VIH/SIDA en una persona se puede hacer por medio de tres tipos de pruebas hoy
existentes: pruebas de anticuerpos, pruebas de antígenos y anticuerpos, así como pruebas de ácido
nucleico (NAT por sus siglas en inglés). El primero, examina si hay anticuerpos contra el VIH en la
sangre o en las secreciones bucales. El segundo, como su nombre lo menciona, pueden detectar
antígenos (una parte del virus), como la proteína gp41 y anticuerpos contra el VIH en la sangre. Y
finalmente, el NAT examina directamente la presencia del VIH en la sangre.
El artículo describe el proceso de optimización en la composición del medio de cultivo así como sus
condiciones físico-químicas para la producción de la glucoproteína 41 (gp41), en una cepa de E. coli, a
través de métodos estadísticos. El objetivo de éste análisis es identificar y clasificar los componentes del
medio usado en el artículo, así como la importancia de la elección del medio.
Desarrollo
El desarrollo del estudio se realizó mediante dos experimentos, en los cuales se buscó optimizar la
producción y expresión de la proteína gp41. Los experimentos se realizaron mediante la técnica de
cultivo “feed-batch” o suministro por lotes, que consiste en el suministro de nutrientes periódicamente, y
los resultados fueron analizados mediante el método de respuesta de superficie (MRS). Cabe señalar,
que debido a que el objetivo es la producción de la proteína gp41, en ambos experimentos el tiempo y
temperatura de inducción y otras condiciones físico-químicas fueron cruciales y estas se analizaron en el
primer experimento para posteriormente ser utilizadas en la optimización de los medios de cultivo. Para
el desarrollo de los experimentos se usó una variante de E. coli llamada “BL21 (DE3)” con un genotipo
especifico. Esta bacteria fue hospedadora del plásmido pMAL-c5X, de 5677 pares de bases, al cual se le
insertó el gen de la proteína H1V1 GP41.

Optimización de condiciones físico-químicas

El primer experimento buscó la optimización de la producción y expresión mediante el análisis de los
resultados obtenidos al estudiar 5 factores físico-químicos a través del método de diseño experimental
Box-Behnken. Los factores se muestran a continuación: OD600, concentraciones de Isopropil-β-D-1-
tiogalactopiranósido (IPTG, utilizado en la inducción), pH inicial, tiempos de inducción y temperatura de
inducción. Cada factor constaba de tres niveles (-1, 0, +1), tal y como se muestra en el cuadro 1.

Cuadro 1. Condiciones del medio y la relación con el crecimiento en cada nivel.

Condiciones de cultivo. Mínimo Medio Máximo

-1 0 +1
Crecimiento OD600 0.5 0.8 1.1
Concentración IPTG (mM) 0.1 0.5 0.9
pH inicial 6 7 8
Tiempo de inducción (h) 2 5 8
Temperatura de inducción (°C) 20 28 36

Debido a la metodología de los diseños experimentales Box-Behnken, al utilizar un total de 5 factores, el

número de ensayos que se deben realizar son 41 ensayos, sin embargo, en la investigación se
realizaron 40 ensayos más 4 más de control. (Brandao, 2007). Para tener el diseño de los ensayos, se
hizo una combinación de los factores, donde se fijó un factor en su nivel central mientras combinaciones
de los otros se realizaban en los niveles laterales. P. ej. OD600: 0.8, IPTG: 0.5, pH: 6, Tiempo: 5,
Temperatura: 20.
Los cultivos se llevaron a cabo en un fermentador de 5 L con un volumen inicial de R-medium al cual se
le fue añadido 75 ml de un cultivo inoculado en un medio LB o Luria-Bertani, el cual es el medio de
crecimiento más utilizado para E. coli, pues promueve un rápido crecimiento (Lessard, 2013).

Optimización del medio de cultivo

En cuanto a la optimización del medio de cultivo se realizó un diseño experimental denominado 3k

factorial. Este es un diseño simple que tiene tres niveles para cada factor, al igual que en el método Box-
Behnken, codificados por los valores (-1, 0, +1), para los valores bajo, medio y alto de los factores
estudiados. Para este experimento se utilizaron 6 factores: peptona, glucosa, NaCl, betaína y ampicilina.
En el cuadro 2, se pueden observar estos factores con sus correspondientes niveles.

Cuadro 2. Concentración de los nutrientes resultado del diseño experimental 3k factorial.

Nutrientes -1 0 +1
Extracto de levadura 2 g/l 7 g/l 12 g/
Peptona 2 g/l 7 g/l 12 g/l
Glucosa 0.5 g/l 5 g/l 9.5 g/l
NaCl 5 g/l 25 g/l 45 g/l
Betaína 1 mM 10 mM 19 mM
Ampicilina 10 µg/ml 80 µg/ml 150 µg/ml

En este experimento, las condiciones a las que el IPTG fue inducido, se basaron en los resultados de
expresión máxima del experimento previo de Box-Behnken, cuyas condiciones son OD: 0.473, pH inicial:
7.65, IPTG: 0.729 mM, tiempo de incubación, antes de la inducción: 4.6 h, temperatura de inducción:
32.4°C. El medio en el que fueron estudiadas las variables, fue un medio LB en forma líquida.

Clasificación de los medios de cultivo

Para la realización de los experimentos se utilizaron dos medios de cultivo: El medio R-medium
modificado, y el LB broth medium, o caldo LB. Cabe mencionar que en todos los medios, al ser
analizados en sus respectivos experimentos, se les fue agregado después de cierto tiempo (tiempo de
inducción, variable analizada en el primer experimento) una molécula llamada isopropil-β-D-1-
tiogalactopiranósido, cuya función principal es la de inducir a la E. coli a una mayor producción de
proteínas recombinantes. En cuanto a la solución de nutrientes suministrada por los lotes, esta estaba
compuesta por glucosa, extracto de levadura, peptona, MgSO4*7H2O, ácido cítrico, KH2PO4 ,
(NH4)2SO4, Na2HPO4*12H2O, MgCl2 y NH4Cl.

Cuadro 3. Comparación de medios y sus componentes.

R-medium (modificado)
Compon  Ácido cítrico –3,
entes  KH2PO4 –6.75,
(g/L)  (NH4)2SO4 –5,
Medios utilizados
Nutrientes suministrados
LB- medium
por lote (fed batch)
 Peptona -10.0 g  Ácido cítrico –3
 Extracto de levadura  KH2PO4 –6.75,
-5.0 g  (NH4)2SO4 –5,
  Na2HPO4•H2O –3,  NaCl -10.0 g  Na2HPO4•12H2O –3,
 MgCl2 –1.5, MgCl2 –5,
 NH4Cl –0.1,  NH4Cl –0.1,
 Glucosa –20,  Glucosa –750,
 Extracto de levadura  Extracto de levadura
–20, –50,
 Peptona –30,  Peptona –75,
 y 6 ml de solución  MgCl2 –5,
de metal traza.  MgSO4•7H2O –20

 Fuentes de 
 Fuentes de Fuentes de Carbono:
Carbono: Glucosa Glucosa
Carbono: Glucosa
Macron  Fuentes de N: 
utriente  Fuentes de N: Fuentes de N:
Peptona, (NH4) Peptona, (NH4) 2SO4,
s Peptona
2SO4, NH4Cl.
NH4Cl.

 Minerales: Na, K, Mg 
Micronu  Minerales: Na, Cl Minerales: Na, K,
KH2PO4, MgCl2. Mg, KH2PO4, MgCl2.
trientes

 Vitaminas: Extracto  Vitaminas: Extracto  Vitaminas: Extracto

de levadura de levadura de levadura
 Aminoácidos:  Aminoácidos:  Aminoácidos:
Agentes Peptonas, que son Peptonas, que son Peptonas, que son
de fuentes de fuentes de fuentes de
crecimie aminoácidos aminoácidos aminoácidos
nto resultantes de la resultantes de la resultantes de la
descomposición de descomposición de descomposición de
proteínas. proteínas. proteínas.

Factore
s
Ninguno Ampicillina Ninguno
selectiv
os

R-medium

Debido a que el medio carece de Agar o un agente gelificante y a que este está diseñado para cultivar a
la E. coli en agitación, es que se deduce que es un medio líquido y es un medio general debido a la
ausencia de agentes selectivos. Su composición es no definida ya que posee peptona y extracto de
levadura.

Cuadro 4. Clasificación del medio de cultivo.

Criterio. Clasificación
Estado físico. Líquido.
Función. No selectivo.
Composición. No definido
Broth LB medium
El artículo reporta que el medio fue comprado a la compañía Difco (USA), por lo que se consultaron las
especificaciones de tal producto. Este medio líquido cuenta con peptona y extracto de levadura que
promueven el crecimiento y ayudan a disminuir la acumulación de acetato, además, el medio LB
contiene NaCl para la captación intracelular de osmolitos por presión osmótica (Sekar et al., 2018) y
adicionalmente se le ha agregado 50 micro-gramos/litro de ampicilina, un antibiótico el cual es soportado
en pequeñas cantidades por la E. coli (Zhanel G, pp 2, 2006).
Por lo que la clasificación del medio LB fue el siguiente
Cuadro 5. Clasificación del medio de cultivo.

Criterio. Clasificación
Estado físico. Líquido.
Función. Selectivo.
Composición. No definido

 El medio es líquido porque no contiene Agar en su composición un agente gelificante.

 Es de función selectiva porque contiene ampicilina y no todas las bacterias logran soportar la
concentración especificada en el medio. (Zhanel G, pp 2, 2006)

 Es de composición no definido al contener extracto de levadura, que es una fuente de nutrientes

con composición variable no cuantificada. (Merck, 2019)

Broth LB medium (modificado)

En el segundo experimento, se buscó optimizar un medio de cultivo mediante la adición de los 6 factores
antes mencionados (cuadro 4). El medio LB contiene de por sí: peptona, extracto de levadura y cloruro
de sólido, sin embargo, para encontrar un medio de cultivo óptimo se modificó este en cuanto a las
concentraciones de los componentes propios del medio (NaCl, extracto de levadura y peptona) y además
se le añadieron componentes extra: betaina y glucosa. La función de la glucosa esencialmente es actuar
como fuente de carbono. La betaina tuvo dos funciones: actuar como osmolito y actuar como chaperona
al estabilizar a las proteínas recombinantes cuando estas se estén desnaturalizando (Fernández, 2012; p
45).

Resultados
Los resultados de la producción y expresión de proteínas se dan como una medida relativa a la
producción y expresión obtenida de los ensayos de control realizados respectivamente en cada
experimento.

Resultado de condiciones de cultivo

El máximo nivel de producción de proteína fue de 2.609 y se obtuvo a 0.5, 0.5, 7, 5, 36, para el OD,
IPTG, tiempo de inducción, pH y temperatura, respectivamente. También se encontró que el nivel
máximo de expresión en los ensayos ocurre a 0.5, 0.9, 5, 7 y 28 con una expresión de 4.39.
Al tomar los valores de expresion y produccion de proteina y analizarse con el metodo de respuesta de
superficie, se encontró que no existía un máximo por lo que se procedió a realizar un análisis RIDGE
para encontrar el punto óptimo. Finalmente los puntos optimos fueron OD: 0.5, IPTG: 0.75 mM, pH: 7.6,
tiempo de inducccion: 4.6 h y temperatura de induccion: 32°C.

Resultados del diseño de medio de cultivo

Los mejores resultados ante los cambios en las concentraciones de los factores, fueron una producción
de 1.022±0.024 y 1.30±0.137 de la expresión de la gp41, obteniéndose la mejor producción a los 2g/L de
extracto de levadura, 12 g/L de peptona, 0.5g/L de glucosa, 25/g/L de NaCl, betaína a 10 Mm y
ampicilina a 80 µg/ml.
Se trató de optimizar la composición mediante un analisis de respuesta de superficie pero se encontró
que los resultados mostraban un aumentó en todas direcciones. El análisis RIDGE se realizó para el
punto óptimo utilizando la media de los resultados, la producción y expresión máxima. Los resultados
óptimos fueron: Extracto de levadura (7,51 g/l), peptona (7,26 g/l), glucosa (2,45 g/l), NaCl (20,40 g/l),
betaína (10,41 mM), ampicilina (71,23 mg/ml).
Conclusión
La búsqueda, selección y análisis de un artículo nos brindó una noción del objetivo del diseño de un
medio, el cual, es optimizar la producción de un determinado producto, en esta caso la proteína gp41
producida de manera natural por el VIH, mismo que para lograrlo es necesario el empleo de la tecnología
del ADN recombinante y herramientas como softwares a los cuales es necesario la proporción de valores
experimentales, de manera que permitan conocer el comportamiento de la producción ante la variación
en las concentraciones tanto de los componentes del medio (extracto de levadura, glucosa, betina, NaCl,
ampicilina y peptona) como de las condiciones físico-químicas (OD 600, pH inicial, concentraciones de
IPTG, tiempo de inducción, temperatura de inducción) y así poder conocer las condiciones óptimas; por
otra parte el análisis permitió la mejor comprensión de la teoría al investigar cada componente del medio
y así poder clasificar a este.

Referencias

 Sekar, et al., Statistical optimization of culture medium to produce recombinant viral protein by
Escherichia coli host for diagnostic kit to detect human immunodeficiency virus (HIV) infection,
Biochemical and Biophysical Research Communications (2018),
https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2018.08.133
 Lessard, J. C. (2013). Growth Media for E. coli. Laboratory Methods in Enzymology: Cell, Lipid
and Carbohydrate, 181–189. doi:10.1016/b978-0-12-420067-8.00011-8
 PanReac AppliChem ITW Reagents. (22/02/2019). Triptona. URL:
https://www.itwreagents.com/italy/es/product/m_ingredientestriptona+%28ingrediente%29+para+
microbiolog%C3%ADa/403682
 Merck. (22/02/2019). Extracto de levadura. URL:
https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/y1625?lang=es&region=MX
 Zhanel G, Hisanaga T, Laing N. (2006). Determinan el índice de resistencia de Escherichia coli
frente a diversos antibióticos. Febrero 2019, de International Journal of Antimicrobial Agents.
Sitio web: http://www.sld.cu/galerias/pdf/sitios/apua-cuba/r18-
determinan_el_indice_de_resistencia_de_escherichia_coli_frente_a_diversos_antibioticos.pdf
 Brandao G.C., Bruns, R. E., da Silva, E.G.P., David, J.M., dos Reis, P.S., dos Santos, W.N.L.,
Ferreira H.S., Ferreira, S. L. C., Matos, J.M., Portugal, L.A. & Souza, A.S. (2007). Box-Behnken
desing: An alternative for the optimization of analytical methods. Acta 597, pp 179-186.
https://www.researchgate.net/publication/6155271_Box-
Behnken_design_An_alternative_for_the_optimization_of_analytical_methods
 Fernandez, S. (2012). CONTRIBUCIÓN DE LA COLINA Y LA BETAÍNA AL METABOLISMO DE
LA HOMOCISTEÍNA DURANTE LA GESTACIÓN (Tesis doctoral) Universitat Rovira i Virgili.
Carrer Sant Llorenç.
Anexo