Anda di halaman 1dari 32

KROMATOGRAFI

BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang


Kromatografi adalah suatu cara pemisahan dimana komponen-komponen yang akan
dipisahkan didistribusikan antara 2 fase, salah satunya yang merupakan fase stasioner
(diam), dan yang lainnya berupa fasa mobil (fasa gerak). Fase gerak dialirkan menembus
atau sepanjang fase stasioner. Fase diam cenderung menahan komponen campuran,
sedangkan fasa gerak cenderung menghanyutkannya. Berdasarkan terikatnya suatu
komponen pada fasa diam dan perbedaan kelarutannya dalam fasa gerak, komponen-
komponen suatu campuran dapat dipisahkan. Komponen yang kurang larut dalam fase
gerak atau yang lebih kuat terserap atau terabsorpsi pada fase diam akan tertinggal,
sedangkan komponen yang lebih larut atau kurang terserap akan bergerak lebih cepat.
Kromatografi merupakan alat yang digunakan untuk keperluan analisis. Di bidang
laboratorium, kromatografi digunakan sebagai salah satu alat untuk permurnian senyawa
ataupun pemisahan zat. Seperti pemeriksaan senyawa pestisida pada tanaman/ sayur, atau
pemeriksaan kadar obat atau narkoba pada sampel urin, serta pemisahan komponen zat
warna yang ada pada makanan.

1.2 Tujuan
Adapun manfaat yang diharapkan dari penulisan makalah ini selain memenuhi tugas
dari Dosen Mata Kuliah, juga bertujuan untuk memberi masukan ilmu pengetahuan bagi
semua khalayak pada umumnya dan khususnya bagi penulis pribadi sehingga kedepannya
dapat lebih mengetahui kegunaan masing-masing kromatografi dan mengetahui cara
penggunaan kromatografi yang baik dan benar.

1.3 Ruang Lingkup


Adapun ruang lingkup yang dibahas dalam makalah laporan Kromatografi ini adalah
menyebutkan macam-macam kromatografi beserta fungsi dan kegunaan masing-masing
kromatografi tersebut. Serta menjelaskan prinsip pemisahan pada kromatografi.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Pengertian Kromatografi
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola
pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa
molekul) yang berada pada larutan.
Kromatografi adalah suatu cara pemisahan dimana komponen-komponen yang akan
dipisahkan didistribusikan antara 2 fase, salah satunya yang merupakan fase stasioner
(diam), dan yang lainnya berupa fasa mobil (fasa gerak).
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan
perambatan komponen dalam medium tertentu.
Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan campuran menjadi komponennya
dengan bantuan perbedaan sifat fisik masing-masing komponen
Prosedur pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi diferensial dinamis dalam
sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara
berkesinambungan dalam arah tertentu dan di dalamnya zat-zat itu menunjukkan
perbedaan mobilitas disebabkan adanya perbedaan dalam absorpsi, partisi, kelarutan,
tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan muatan ion dinamakan kromatografi sehingga
masing-masing zat dapat diidentifikasi atau ditetapkan dengan metode analitik (Anonim,
1995).
Dari beberapa pengertian tersebut, maka dapat diambil sebuah kesimpulan bahwa
kromatografi adalah teknik analisis yang diterapkan untuk memisahkan komponen-
komponen dalam campuran berdasarkan 2 jenis fase yaitu fase diam (stationer) dan fase
gerak (mobil).

2.2 Sejarah penemuan Kromatografi


Perkembangan kimia modern dengan teknik pemisahan yang cepat, tidak dapat
terlaksana bila tidak adanya ilmuan yang menemukannya. Kromatografi merupakan salah
satu alat yang ada dalam perkembangan kimia modern, sehingga suatu analisis dapat
dilakukan dengan cepat dan baik.
Di awal abad ke-20, kimiawan Rusia Mikhail Semënovich Tsvet (1872-1919)
menyiapkan kolom yang diisi dengan serbuk kalsium karbonat, dan kedalamnya dituangkan
campuran pigmen tanaman yang dilarutkan dalam eter. Secara mengejutkan, pigmen
memisahkan dan membentuk lapisan berwarna di sepanjang kolom. Ia menamakan
kromatografi pada teknik pemisahan baru ini (1906). Kemudian kimiawan dari Swiss Richard
Martin Willstätter (1872-1942) menerapkan teknik ini untuk risetnya yakni khlorofil untuk
menunjukkan manfaat teknik ini, dan sejak itu banyak perhatian diberikan pada
kromatografi. Dan untuk Kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan oleh Izmailoff dan
Schraiber pada tahun 1938. Serta Kimiawan Inggris Richard Laurence Millington Synge
(1914-1994) adalah orang pertama yang menggunakan metoda analisis asam amino dengan
kromatografi kertas. Saat campuran asam amino menaiki lembaran kertas secara vertikal
karena ada fenomena kapiler, partisi asam amino antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang
teradsorbsi pada selulosa berlangsung berulang-ulang. Ketika pelarut mencapai ujung atas
kertas proses dihentikan. Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak
tertentu. Dari nilai R, masing-masing asam amino diidentifikasi.

2.3 Klasifikasi Kromatografi


Kromatografi dibagi menjadi beberapa jenis bergantung pada jenis fasa mobil dan
mekanisme pemisahannya.
Secara umum, fase gerak (mobil):
a. Kromatografi Cair (Liquid Chromatography)
Kromatografi cair merupakan teknik yang tepat untuk memisahkan ion atau molekul
yang terlarut dalam suatu larutan. Jika larutan sampel berinteraksi dengan fase stasioner,
maka molekul-molekul didalamnya berinteraksi dengan fase stasioner; namun interaksinya
berbeda dikarenakan perbedaan daya serap (adsorption), pertukaran ion (ion exchange),
partisi (partitioning), atau ukuran. Perbedaan ini membuat komponen terpisah satu dengan
yang lain dan dapat dilihat perbedaannya dari lamanya waktu transit komponen tersebut
melewati kolom. Terdapat beberapa jenis kromatografi cair, diantaranya: reverse phase
chromatography, High Performance Liquid Chromatography (HPLC), size exclusion
chromatography, serta supercritical fluid chromatography.
Reverse phase chromatography

Reverse phase chromatography merupakan alat analitikal yang kuat dengan memadukan
sifat hidrofobik serta rendahnya polaritas fase stasioner yang terikat secara kimia pada
padatan inert seperti silika.Metode ini biasa digunakan untuk proses ekstraksi dan
pemisahan senyawa yang tidak mudah menguap (non-volatile).

High performance liquid chromatography

High performance liquid chromatography (HPLC) mempunyai prinsip yang mirip dengan
reverse phase. Hanya saja dalam metode ini, digunakan tekanan dan kecepatan yang tinggi.
Kolom yang digunakan dalam HPLC lebih pendek dan berdiameter kecil, namun dapat
menghasilkan beberapa tingkatan equilibrium dalam jumlah besar.

Akhir-akhir ini, untuk pemurnian (misalnya untuk keperluan sintesis) senyawa organik skala
besar, HPLC (high precision liquid chromatography atau high performance liquid
chromatography) secara ekstensif digunakan. Bi la zat melarut dengan pelarut yang cocok,
zat tersebut dapat dianalisis. Ciri teknik ini adalah penggunaan tekanan tinggi untuk
mengirim fasa mobil kedalam kolom. Dengan memberikan tekanan tinggi, laju dan efisiensi
pemisahan dapat ditingkatkan dengan besar.

Silika gel atau oktadesilsilan yang terikat pada silika gel digunakan sebagai fasa stationer.
Fasa stationer cair tidak populer. Kolom yang digunakan untuk HPLC lebih pendek daripada
kolom yang digunakan untuk kromatografi gas. Sebagian besar kolom lebih pendek dari 1 m.

Size exclusion chromatography

Size exclusion chromatography, atau yang dikenal juga dengan gel permeation atau filtration
chromatography biasa digunakan untuk memisahkan dan memurnikan protein. Metode ini
tidak melibatkan berbagai macam penyerapan dan sangat cepat. Perangkat kromatografi
berupa gel berpori yang dapat memisahkan molekul besar dan molekul kecil. Molekul besar
akan terelusi terlebih dahulu karena molekul tersebut tidak dapat penetrasi pada pori-pori.

b. Kromatografi Gas
Campuran gas dapat dipisahkan dengan kromatografi gas. Fasa stationer dapat
berupa padatan (kromatografi gas-padat) atau cairan (kromatografi gas-cair).
Umumnya, untuk kromatografi gas-padat, sejumlah kecil padatan inert misalnya
karbon teraktivasi, alumina teraktivasi, silika gel atau saringan molekular diisikan ke dalam
tabung logam gulung yang panjang (2-10 m) dan tipis. Fasa mobil adalah gas semacam
hidrogen, nitrogen atau argon dan disebut gas pembawa. Pemisahan gas bertitik didih
rendah seperti oksigen, karbon monoksida dan karbon dioksida dimungkinkan dengan
teknik ini.
Dalam kasus kromatografi gas-cair, ester seperti ftalil dodesilsulfat yang diadsorbsi di
permukaan alumina teraktivasi, silika gel atau penyaring molekular, digunakan sebagai fasa
diam dan diisikan ke dalam kolom. Campuran senyawa yang mudah menguap dicampur
dengan gas pembawa disuntikkan ke dalam kolom, dan setiap senyawa akan dipartisi antara
fasa gas (mobil) dan fasa cair (diam) mengikuti hukum partisi. Senyawa yang kurang larut
dalam fasa diam akan keluar lebih dahulu.
Metoda ini khususnya sangat baik untuk analisis senyawa organik yang mudah
menguap seperti hidrokarbon dan ester. Analisis minyak mentah dan minyak atsiri dalam
buah telah dengan sukses dilakukan dengan teknik ini.
Efisiensi pemisahan ditentukan dengan besarnya interaksi antara sampel dan
cairannya. Disarankan untuk mencoba fasa cair standar yang diketahui efektif untuk
berbagai senyawa. Berdasarkan hasil ini, cairan yang lebih khusus kemudian dapat dipilih.
Metoda deteksinya, akan mempengaruhi kesensitifan teknik ini. Metoda yang dipilih akan
bergantung apakah tujuannya analisik atau preparatif.

Komponen alat kromatografi gas


Alat GLC atau GC terdiri atas 7 bagian yang pokok seperti pada gambar, yaitu:
1. Silinder tempat gas pembawa/pengangkut
2. Pengatur aliran dan pengatur tekanan
3. Tempat injeksi cuplikan
4. Kolom
5. Detector
6. Pencatat
7. Terminal untuk 3, 4 dan 5
1. Gas pengangkut/pemasok gas
Gas pengangkut (carrier gas) ditempatkan dalam silinder bertekanan tinggi.
Biasanya tekanan dari silinder sebesar 150 atm. Tetapi tekanan ini sangat besar untuk
digunakan secara Iansung.
Gas pengangkut harus memenuhi persyaratan :
a. Harus inert, tidak bereaksi dengan cuplikan, cuplikan-pelarut, dan material dalam kolom.
b. Murni dan mudah diperoleh, serta murah.
c. Sesuai/cocok untuk detektor.
d. Harus mengurangi difusi gas
Gas-gas yang sering dipakai adalah : helium, argon, nitrogen, karbon dioksida dan
hidrogen. Gas helium dan argon sangat baik, tidak mudah terbakar, tetapi sangat mahal.
H2 mudah terbakar, sehingga harus berhati-hati dalam pemakaiannya. Kadang-kadang
digunakan juga C02.
Pemilihan gas pengangkut atau pembawa ditentukan oleh ditektor yang
digunakan. Tabung gas pembawa dilengkapi dengan pengatur tekanan keluaran dan
pengukur tekanan. Sebelum masuk ke kromatografi, (harusnya) ada pengukur kecepatan
aliran gas serta sistem penapis molekuler untuk memisahkan air dan pengotor gas
lainnya. Pada dasarnya kecepatan alir gas diatur melalui pengatur tekanan dua tingkat
yaitu pengatur kasar (coarse) pada tabung gas dan pengatur halus (fine) pada
kromatograf. Tekanan gas masuk ke kromatograf (yaitu tekanan dari tabung gas) diatur
pada 10 s.d 50 psi (di atas tekanan ruangan) untuk memungkinkan aliran gas 25 s.d 150
mL/menit pada kolom terpaket dan 1 s.d 25 mL/menit untuk kolom kapiler.

2. Pengatur aliran dan pengatur tekanan


Ini disebut pengatur atau pengurang Drager. Drager bekerja baik pada 2,5 atm, dan
mengalirkan massa aliran dengan tetap. Tekanan lebih pada tempat masuk dari kolom
diperlukan untuk mengalirkan cuplikan masuk ke dalam kolom. Ini disebabkan, kenyataan
lubang akhir dari kolom biasanya mempunyai tekanan atmosfir biasa. Juga oleh kenyataan
bahwa suhu kolom adalah tetap, yang diatur oleh thermostat, maka aliran gas tetap yang
masuk kolom akan tetap juga.
Demikian juga komponen-komponen akan dielusikan pada waktu yang tetap yang
disebut waktu penahanan (the retention time), t R. Karena kecepatan gas tetap, maka
komponen juga mempunyai volume karakteristik terhadap gas pengangkut = volume
penahanan (the retention volume), v r. Kecepatan gas akan mempengaruhi effisiensi
kolom.
Harga-harga yang umum untuk kecepatan gas untuk kolom yang memiliki diameter
luar.
1/4" O.D : kecepatan gas 75 ml/min
1/8" O.D : kecepatan gas 25 ml/min.

3. Tempat injeksi (The injection port)


Dalam pemisahan dengan GLC cuplikan harus dalam bentuk fase uap. Gas dan uap
dapat dimasukkan secara langsung. Tetapi kebanyakan senyawa organik berbentuk cairan
dan padatan. Hingga dengan demikian senyawa yang berbentuk cairan dan padatan
pertama-tama harus diuapkan. Ini membutuhkan pemanasan sebelum masuk dalam
kolom. Panas itu terdapat pada tempat injeksi seperti pada gambar 9. bagan injektor.

Tempat injeksi dari alat GLC selalu dipanaskan. Dalam kebanyakan alat, suhu dari
tempat injeksi dapat diatur. Aturan pertama untuk pengaturan suhu ini adalah batiwa
suhu tempat injeksi sekitar 50°C lebih tinggi dari titik didih campuran dari cuplikan yang
mempunyai titik didih yang paling tinggi. Bila kita tidak mengetahui titik didih komponen
dari cuplikan maka kita harus mencoba-coba. Sebagai tindak lanjut suhu dari tempat
injeksi dinaikkan. Jika puncak-puncak yang diperoleh lebih baik, ini berarti bahwa suhu
percobaan pertama terlalu rendah. Namun demikian suhu tempat injeksi tidak boleh
terlalu tinggi, sebab kemungkinan akan terjadi perubahan karena panas atau penguraian
dari senyawa yang akan dianalisa.

Cuplikan dimasukkan ke dalam kolom dengan cara menginjeksikan melalui tempat


injeksi. Hal ini dapat dilakukan dengan pertolongan jarum injeksi yang sering disebut "a
gas tight syringe".

Perlu diperhatikan bahwa kita tidak boleh menginjeksikan cuplikan terlalu banyak,
karena GC sangat sensitif. Biasanya jumlah cuplikan yang diinjeksikan pada waktu kita
mengadakan analisa 0,5 -50 ml gas dan 0,2 - 20 ml untuk cairan seperti pada gambar di
bawah.

4. Kolom
Kolom merupakan jantung dari kromatografi gas. Bentuk dari kolom
dapat lurus, bengkok, misal berbentuk V atau W, dan kumparan/spiral. Biasanya bentuk
dari kolom adalah kumparan. Kolom selalu merupakan bentuk tabung. Tabung ini dapat
terbuat dari :
a. Tembaga (murah dan mudah diperoleh)
b. Plastik (teflon), dipakai pada suhu yang tidak terlalu tinggi.
c. Baja (stainless steel), (mahal)
d. Alumunium
e. Gelas
Panjang kolom dapat dari 1 m sampai 3 m. Diameter kolom mempunyai berbagai
ukuran, biasanya pengukuran berdasarkan diameter dalam dari kolom gelas yaitu antara
0,3 mm hingga 5 min. Kebanyakan kolom yang digunakan berupa stainles steel dengan
diameter luar (OD) dari I/S atau 1/4 inch (0,3 atau 0,6 cm). Pada GSC kolom diisi dengan
penyerap (adsorbent), sedangkan pada GLC kolom diisi dengan "solid support" (padatan
pendukung) yang diikat oleh fase diam.

5. Detektor
Detektor berfungsi sebagai pendeteksi komponen-komponen yang telah dipisahkan
dari kolom secara terus-menerus, cepat, akurat, dan dapat melakukan pada suhu yang lebih
tinggi. Detektor harus dapat dipercaya dan mudah digunakan. Fungsi umumnya mengubah
sifat-sifat molekul dari senyawa organik menjadi arus listrik kemudian arus listrik tersebut
diteruskan ke rekorder untuk menghasilkan kromatogram. Detektor yang umum digunakan:
a. Detektor hantaran panas (Thermal Conductivity Detector_ TCD)
b. Detektor ionisasi nyala (Flame Ionization Detector_ FID)
c. Detektor penangkap elektron (Electron Capture Detector _ECD)
d. Detektor fotometrik nyala (Falame Photomertic Detector _FPD)
e. Detektor nyala alkali
f. Detektor spektroskopi massa
Detektor yang peka terhadap senyawa organik yang mengandung fosfor adalah FID,
ECD, dan FPD. Detektor penangkap elektron (Electron Capture Detector – ECD). Pada
penetapan ini, digunakan detektor penangkap elektron. Detektor ini merupakan modifikasi
dari FID yaitu pada bagian tabung ionisasi. Dasar dari ECD ialah terjadinya absorbsi e- oleh
senyawa yang mempunyai afinitas terhadap e- bebas (senyawa-senyawa elektronegatif).
Dalam detektor gas terionisasi oleh partikel yang dihasilkan dari 3H atau 63Ni. Detektor ini
mengukur kehilangan sinyal ketika analit terelusi dari kolom kromatografi. Detektor ini peka
terhadap senyawa halogen, karbonil terkoyugasi, nitril, nitro, dan organo logam, namun
tidak peka terhadap hidrokarbon, ketone, dan alkohol.
6. Oven kolom
Kolom terletak didalam sebuah oven dalam instrumen. Suhu oven harus diatur dan
sedikit dibawah titik didih sampel. Jika suhu diset terlalu tinggi, cairan fase diam bisa
teruapkan, juga sedikit sampel akan larut pada suhu tinggi dan bisa mengalir terlalu cepat
dalam kolom sehingga menjadi terpisah (Hendayana, 2001).
7. Rekorder
Rekorder berfungsi sebagai pengubah sinyal dari detektor yang diperkuat melalui
elektrometer menjadi bentuk kromatogram. Dari kromatogram yang diperoleh dapat
dilakukan analisis kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif dengan cara membandingkan
waktu retensi sampel dengan standar. Analisis kuantitatif dengan menghitung luas area
maupun tinggi dari kromatogram (Hendayana, 2001). Sinyal analitik yang dihasilkan
detektor dikuatkan oleh rangkaian elektronik agar bisa diolah oleh rekorder atau
sistem data. Sebuah rekorder bekerja dengan menggerakkan kertas dengan kecepatan
tertentu. di atas kertas tersebut dipasangkan pena yang digerakkan oleh sinyal keluaran
detektor sehingga posisinya akan berubah-ubah sesuai dengan dinamika
keluaran penguat sinyal detektor. Hasil rekorder adalah sebuah kromatogram berbentuk
pik-pik dengan pola yang sesuai dengan kondisi sampel dan jenis detektor yang
digunakan.

Rekorder biasanya dihubungkan dengan sebuah elektrometer yang dihubungkan


dengan sirkuit pengintregrasi yang bekerja dengan menghitung jumlah muatan atau
jumlah energi listrik yang dihasilkan oleh detektor. Elektrometer akan melengkapi pik-pik
kromatogram dengan data luas pik atau tinggi pik lengkap dengan biasnya.

Sistem data merupakan pengembangan lebih lanjut dari rekorder dan elektrometer
dengan melanjutkan sinyal dari rekorder dan elektrometer ke sebuah unit pengolah pusat
(CPU, Central Procesing Unit).

Kromatografi gas dibagi lagi menjadi 2, yaitu kromatografi gas-cair, dan kromatografi
gas-padat.

Kromatografi Gas-Cair
Dalam kromatografi gas-cair, fase gerak adalah gas seperti helium dan fase diam
adalah cairan yang mempunyai titik didih yang tinggi diserap pada padatan.
Sebagaimana kecepatan suatu senyawa tertentu bergerak melalui mesin, akan
tergantung pada seberapa lama waktu yang dihabiskan untuk bergerak dengan gas dan
sebaliknya melekat pada cairan dengan jalan yang sama.

Kromatografi gas pada prinsipnya mirip dengan kromatografi kolom (dan juga bentuk
kromatografi yang lain, seperti HPLC, TLC), namun memiliki beberapa perbedaan. Pertama,
proses memisahkan senyawa dalam campuran dilakukan antara fase diam cair dan gas fase
bergerak. Kedua, kolom yang melaluinya melewati fase gas terletak di oven dimana
temperatur gas dapat dikendalikan, dan ketiga, konsentrasi senyawa dalam fase gas adalah
semata-mata fungsi dari tekanan uap gas.

c. Kromatografi Pertukaran Ion (Ion-Exchange Chromatography)

Kromatografi pertukaran ion (ion-exchange chromatography) biasa digukanan untuk


pemurnian materi biologis, seperti asam amino, peptida, protein. Metode ini dapat
dilakukan dalam dua tipe, yaitu dalam kolom maupun ruang datar (planar). Terdapat dua
tipe pertukaran ion, yaitu pertukaran kation (cation exchange) dan pertukaran anion (anion
exchange). Pada pertukaran kation, fase stasioner bermuatan negatif; sedangkan pada
pertukaran anion, fase stasioner bermuatan positif. Molekul bermuatan yang berada pada
fase cair akan melewati kolom. Jika muatan pada molekul sama dengan kolom, maka
molekul tersebut akan terelusi. Namun jika muatan pada molekul tidak sama dengan kolom,
maka molekul tersebut akan membentuk ikatan ionik dengan kolom. Untuk mengelusi
molekul yang menempel pada kolom diperlukan penambahan larutan dengan pH dan
kekuatan ionik tertentu. Pemisahan dengan metode ini sangat selektif dan karena biaya
untuk menjalankan metode ini murah serta kapasitasnya tinggi, maka metode ini biasa
digunakan pada awal proses keseluruhan.
Berdasarkan Fase stasioner (Fase diam) :
1. Kromatografi Kolom
a. Kromatografi Adsorpsi
Kromatografi Adsorpsi adalah pemisahan akibat daya tarik fase diam yang kuat terhadap
komponen yang dipisahkan adanya interaksi kimiawi dan elusi bertahap.
Syarat fase diam dalam kromatografi Adsorpsi adalah :
1. Tidak larut dalam fase gerak
2. Inert
3. Cukup aktif
4. Sebaiknya tidak berwarna
5. Memungkinkan aliran baik dan teratur fase gerak. Missal : sukrosa, pati, CaCO3, MgCO3, Mg
Silikat aktif, alumina aktif, arang aktif, florisil
b. Kromatografi Partisi
Prinsip kromatografi partisi dapat dijelaskan dengan hukum partisi yang dapat diterapkan
pada sistem multikomponen yang dibahas di bagian sebelumnya. Dalam kromatografi
partisi, ekstraksi terjadi berulang dalam satu kali proses. Dalam percobaan, zat terlarut
didistribusikan antara fasa stationer dan fasa mobil. Fasa stationer dalam banyak kasus
pelarut diadsorbsi pada adsorben dan fasa mobil adalah molekul pelarut yang mengisi ruang
antar partikel yang teradsorbsi.
Kolomnya (tabung gela) diisi dengan bahan seperti alumina, silika gel atau pati yang
dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan kedalam kolom. Larutan sampel
kemudian diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sammpel diasorbsi oleh adsorben.
Kemudian pelarut (fasa mobil; pembawa) ditambahkan tetes demi tetes dari atas kolom.
Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke bawah (fasa mobil) dan pelarut
yang teradsorbsi oleh adsorben (fasa stationer). Selama perjalanan turun, zat terlarut akan
mengalami proses adsorpsi dan partisi berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk
masing-masing zat terlarut dan bergantung pada koefisien partisi masing-masing zat
terlarut. Akhirnya, zat terlarut akan terpisahkan membentuk beberapa lapisan.

c. Kromatografi Adsorpsi dan Partisi


d. Kromatografi pertukaran Ion
e. Kromatografi Ekslusif molekul
f. Kromatografi Afinitas
2. Kromatografi Kertas
Kromatografi kertas diterapkan untuk analisis campuran asam amino dengan sukses
besar. Karena asam amino memiliki sifat yang sangat mirip, dan asam-asam amino larut
dalam air dan tidak mudah menguap (tidak mungkin didistilasi), pemisahan asam amino
adalah masalah paling sukar yang dihadapi kimiawan di akhir abad 19 dan awal abad 20. Jadi
penemuan kromatografi kertas merupakan berita sangat baik bagi mereka.
Kimiawan Inggris Richard Laurence Millington Synge (1914-1994) adalah orang
pertama yang menggunakan metoda analisis asam amino dengan kromatografi kertas. Saat
campuran asam amino menaiki lembaran kertas secara vertikal karena ada fenomena
kapiler, partisi asam amino antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang teradsorbsi pada
selulosa berlangsung berulang-ulang. Ketika pelarut mencapai ujung atas kertas proses
dihentikan. Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai R,
masing-masing asam amino diidentifikasi.
Kromatografi kertas dua-dimensi (2D) menggunakan kertas yang luas bukan lembaran
kecil, dan sampelnya diproses secara dua dimensi dengan dua pelarut.
Kromatografi kertas hampir sama dengan kromatografi lapis tipis. Kromatografi kertas
memisahkan larutan organic air dan larutan anorganik atau komponen polar yang tinggi
seperti asam amino dan gula. Kertas yang digunakan mengandung air yang merupakan fase
diam. Fase gerak umumnya adalah fase pelarut organik polar dan air (campuran pelarut
yang mengandung air sebagai komponen). Fase diam kromatografi kertas bersifat cair (air)
sedangkan fase geraknya juga cairan (pelarut organic dan air). Campuran sampel menjalani
partisi atau distribusi di antara dua fase cairan. Sampel akan terpisah dengan nilai koefesien
partisi yang berbeda.
Kromatografi kertas merupakan salah satu contoh kromatografi partisi. Ketika fase
gerak diiletakkan di atas chamber, teknik dikenal dengan descending. Ketika fase geraknya
diletakkan di bawah maka disebut ascending. Jika hasil kromatografi kertas kurang
berwarna, ada dua metode umum yang digunakan untuk mendeteksi lokasi spot, yaitu
menggunakan sinar UV dan reagen pewarna. Sinar UV digunakan ketika komponen
mengandung zat fluoresens (berpendar). Kation seperti Co, Ni, Zn, dan Mn menggunakan
reagen pewarna difenil karbazid sehingga menghasilkan warna masing-masing adalah ungu,
merah, pink, da pink pucat. Reagen pewarna tersebut disemprotkan pada kertas dan
hasilnya yang terlihat dilingkari oleh pensil (Krupadanam et al 2001). Kromatografi kertas
terdapat distribusi antara air (diadsorbsi oleh kertas saring sekitar 20 %) dan pelarut
bergerak (Bansal 2003).

Mekanisme pemisahan dengan kromatografi kertas prinsipnya sama dengan


mekanisme pada kromatografi kolom. Adsorben dalam kromatografi kertas adalah kertas
saring, yakni selulosa. Sampel yang akan dianalisis ditotolkan ke ujung kertas yang kemudian
digantung dalam wadah. Kemudian dasar kertas saring dicelupkan kedalam pelarut yang
mengisi dasar wadah. Fasa mobil (pelarut) dapat saja beragam. Air, etanol, asam asetat atau
campuran zat-zat ini dapat digunakan.
Satu keuntungan utama Kromatogrfi Kertas ialah kemudahan dan kesederhanaannya
pada pelaksanaan pemisahan, yaitu hanya pada lembaran kertas saring yang berlaku
sebagai medium pemisahan dan juga sebagai penyangga. Keuntungan lain ialah
keterulangan bilangan Rp yang besar pada kertas sehingga pengukuran Rp merupakan para-
meter yang berharga dalam memaparkan senyawa tumbuhan baru. Memang, untuk
senyawa antosianin yang tidak mempunyai ciri fisika lain yangjelas, Rjr adalah sarana
terpenting dalam memaparkan dan membedakan pigmen yang satu dengan pigmen yang
lain (Harborne, 1967).

3. Kromatografi Lapis Tipis


Kromatografi digunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-
komponennya. Seluruh bentuk kromatografi berkerja berdasarkan prinsip ini.
Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi
cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase
diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-
komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda. Kita akan membahasnya lebih
lanjut.
Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan sebuah bentuk dari kromatografi adsorpsi
padat cair yang fase diamnya dilumuri di atas plat. Ada perbedaan cara dalam melapisi plat,
yaitu menuangkan, mencelupkan, menyemprotkan, dan melapisi. Plat yang digunakan dapat
berupa plat kaca dan aluminium. Adsorban padat yang sering digunakan, yaitu silikia dan
alumina. Bahan tersebut dicampur dengan bahan pengikat agar tidak terkelupas pada plat
yang kering. Sampel ditambahkan sebagai larutan di dalam pelarut yang non polar di ujung
plat dengan membentuk spot yang simetri. Proses pengulangan penambahan bertujuan
mendapatkan beberapa miligram sampel. Pengamatan pada plat yang menggunakan silikia
(mengandung larutan fluoresens) dengan menggunakan sinar UV memperlihatkan lokasi
spot-spot yang berpendar. Ketika fase gerak diiletakkan di atas chamber, teknik dikenal
dengan descending. Ketika fase geraknya diletakkan di bawah maka disebut ascending
(Bansal 2003).
Bila KLT dibandingkan dengan KKt, kelebihan khas KLT ialah keser-baeunaan,
kecepatan, dan kepekaannya. Keserbagunaan KLT di-sebabkan oleh kenyataan bahwa di
samping selulosa, sejumlah pen-jerap yang berbeda-beda dapat disaputkan pada pelat kaca
atau penyangga lain dan digunakan untuk kromatografi. Walau pun silika gel paling banyak
digunakan, lapisan dapat pula dibuat dari alumuni-um oksida, 'celite', kalsium hidroksida,
damar penukar ion, magnesium fosfat, poliamida, 'sephadex', polivinil pirolidon, selulosa,
dan campuran dua bahan di atas atau lebih. Kecepatan KLT yang lebih besar disebabkan
oleh sifat penjerap yang lebih padat bila disaputkan pada pelat dan merupakan keuntungan
bila kita menelaah senyawa labil. Akhirnya, kepekaan KLT sedemikian rupa sehingga bila
diper-lukan dapat dipisahkan bahan yang jumlahnya lebih sedikit dari ukuran µg.
Satu kekurangan KLT yang asli ialah kerja penyaputan pelat kaca dengan penjerap.
Kerja ini kemudian agak diringankan dengan ada-nya penyaput otomatis. Meski pun begitu,
dengan menggunakan alat itu pun tetap diperlukan tindakan pencegahan tertentu. Pelat
kaca harus dibersihkan hati-hati dengan aseton untuk menghilangkan lemak. Kemudian
bubur silika gel (atau penjerap lain) dalam air harus dikocok kuat-kuat selama jangka waktu
tertentu (misalnya 90 detik) sebelum penyaputan. Tergantung pada ukuran partikel
penjerap, mungkin harus ditambahkan kalsium sulfat hemihidrat (15%) untuk membantu
melekatkan penjerap pada pelat kaca. Akhirnya, setelah penyaputan, pelat harus
dikeringkan pada suhu kamar dan kemudian diaktifkan dengan pemanasan dalam tanur
pada 100—110°C selama 30 menit. Pada beberapa pemisahan biasanya akan
menguntungkan bila sifat penjerap diubah dengan menambahkan garam anorganik
(misalnya perak nitrat untuk KLT pemerakan), dan hal ini paling balk dikerjakan ketika pelat
sedang disaput. Alasan lain masih digu-nakannya pelat yang disaput sendiri di laboratorium
ialah karena kadar air silika gel dapat dikendalikan. Hal ini merupakan faktor yang kritis
untuk beberapa pemisahan.
Tetapi sekarang menggunakan pelat pralapis niaga dalam kebanyakan pemisahan
sudah merupakan suatu hal yang biasa karena pelat tersedemikian dengan penjerap yang
berbeda-beda, disaputkan pada kaca, lembaran alumunium, atau plastik. Pelat dapat
mengandung indikator fluoresensi atau tidak. Penambahan indikator ini memungkinkan
pendeteksian semua senya-wa yang memadamkan fluoresensi bila pelat diamati dengan
disinari sinar UV berpanjang gelombang 254 nm. Jenis KLT yang paling baru ialah KLT yang
menggunakan pelat bersaputkan mikropartikel silika halus yang biasa digunakan untuk
kolom KCKT. Kromatografi yang demikian disebut kromatografi lapis tipis kinerja tinggi
(KLTKT) dan biasanya menghasilkan pemisahan yang lebih efisien dan lebih cepat daripada
pemisahan pada lapisan silika yang biasa.

2.4 Komponen Utama Kromatografi


Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan campuran menjadi komponennya
dengan bantuan perbedaan sifat fisik masing-masing komponen. Alat yang digunakan terdiri
atas kolom yang di dalamnya diisikan fasa stasioner (padatan atau cairan). Campuran
ditambahkan ke kolom dari ujung satu dan campuran akan bergerak dengan bantuan
pengemban yang cocok (fasa mobil). Pemisahan dicapai oleh perbedaan laju turun masing-
masing komponen dalam kolom, yang ditentukan oleh kekuatan adsorpsi atau koefisien
partisi antara fasa mobil dan fasa diam (stationer).
Komponen utama kromatografi adalah fasa stationer dan fasa mobil.
a. Fase Stationer (Fase diam)
Pelaksanaan kromatografi lapis tipis menggunakan lapis tipis silica atau alumina yang
seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastic yang keras.
Jel silica (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis
seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendar flour dalam sinar ultra
violet. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.
Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom
aluminium pada permukaan juga memiliki gugus –OH. Apa yang kita sebutkan tentang jel
silica kemudian digunakan serupa untuk alumina.
b. Fase Mobil (Fase gerak)
Dalam kromatografi, eluent adalh fase gerak yang berperan penting pada proses elusi
bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fase diam (adsorbent). Interaksi antara adsorbant
dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen. Oleh sebab itu,
pemisahan komponen gula dalam tetes secara kromatografi dipengaruhi oleh laju alir eluent
dan jumlah umpan.
Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau
campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan adalah
jenis adsorban alumina atau sebuah lapis tipis silica. Penggolongan ini dikenal sebagai deret
eluotropik pelarut. Suatu pelarut yang bersifat larutan relative polar dapat mengusir pelarut
yang relative tak polar dari ikatannya dengan alumina (jel silica). (Kantasubrata,1993).
Kecepatan gerak senyawa-senyawa ke atas pada lempengan itu, tergantung pada :
 Bagaimana kelarutan senyawa dalam pelarut. Hal ini bergantung pada bagaimana besar
atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.
 Bagaimana senyawa melekat pada fase diam, misalnya silica. Hal ini tergantung pada
bagaimana besar atraksi antara senyawa dengan silica gel.
Anggaplah bercak awal pada alumina mengandung dua senyawa, yang satu dapat
membentuk ikatan hydrogen, dan yang lainnya hanya dapat mengambil tiap-tiap bagian
interaksi van der Waals yang lemah.
Senyawa yang dapat membentuk ikatan hydrogen akan melekat pada jel silica lebih kuat
disbanding senyawa lainnya. Kita mengatakan bahwa senyawa ini terjerap lebih kuat dari
senyawa yang lainnya. Penjerapan merupakan pembentukan suatu ikatan dari satu
substansi pada permukaan.
Penjerapan bersifat tidak permanen, terdapat pergerakan tetap dari molekul antara yang
terjerap pada permukaan jel silica dan yang kembali pada larutan dalam pelarut.
Dengan jelas senyawa hanya dapat bergerak ke atas pada lempengan selama waktu
terlarut dalam pelarut. Ketika senyawa dijerap pada silica gel untuk sementara waktu proses
penjerapan berhenti-dimana pelarut bergerak tanpa senyawa. Itu berarti bahwa senyawa
semakin kuat senyawa dijerap, semakin kurang jarak yang ditempuh ke atas lempengan.

2.5 Kromatografi dan Aplikasinya pada Bidang lain


a) Pada Bidang Bioteknologi
Dalam bidang bioteknologi, kromatografi mempunyai peranan yang sangat besar.
Misalnya dalam penentuan, baik kualitatif maupun kuantitatif, senyawa dalam protein.
Protein sering dipilih karena ia sering menjadi obyek molekul yang harus di-purified
(dimurnikan) terutama untuk keperluan dalam bio-farmasi. Kromatografi juga bisa
diaplikasikan dalam pemisahan molekul-molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat,
lemak, vitamin dan molekul penting lainnya.
Dengan data-data yang didapatkan dengan menggunakan kromatografi ini,
selanjutnya sebuah produk obat-obatan dapat ditingkatkan mutunya, dapat dipakai sebagai
data awal untuk menghasilkan jenis obat baru, atau dapat pula dipakai untuk mengontrol
kondisi obat tersebut sehingga bisa bertahan lama.

b) Pada Bidang Klinik


Dalam bidang clinical (klinik), teknik ini sangat bermanfaat terutama dalam
menginvestigasi fluida badan seperti air liur. Dari air liur seorang pasien, dokter dapat
mengetahui jenis penyakit yang sedang diderita pasien tersebut. Seorang perokok dapat
diketahui apakah dia termasuk perokok berat atau ringan hanya dengan mengetahui
konsentrasi CN- (sianida) dari sampel air liurnya. Demikian halnya air kencing, darah dan
fluida badan lainnya bisa memberikan data yang akurat dan cepat sehingga keberadaan
suatu penyakit dalam tubuh manusia dapat dideteksi secara dini dan cepat.
Sekarang ini, deteksi senyawa oksalat dalam air kencing menjadi sangat penting
terutama bagi pasien kidney stones (batu ginjal). Banyak metode analisis seperti
spektrofotometri, manganometri, atau lainnya, akan tetapi semuanya membutuhkan kerja
ekstra dan waktu yang cukup lama untuk mendapatkan hasil analisis dibandingkan dengan
teknik kromatografi.
Dengan alasan-alasan inilah, kromatografi kemudian menjadi pilihan utama dalam
membantu mengatasi permasalahan dalam dunia bioteknologi, farmasi, klinik dan
kehidupan manusia secara umum.

c) Pada Bidang Forensik


Aplikasi kromatografi pada bidang forensik pun sangat membantu, terutama dilihat
dari segi keamanan. Masih lekat dalam ingatan kita, sebuah peristiwa Black September
Tragedy mengguncang Amerika pada tanggal 11 September 2001 yang ditandai dengan
runtuhnya dua gedung kesayangan pemerintah Amerika Serikat. Demikian halnya di
Indonesia yang marak dengan aksi peledakan bom yang terjadi di mana-mana. Perhatian
dunia pun akhirnya mulai beralih dengan adanya peristiwa-peristiwa
pengeboman/peledakan tersebut ke bahaya explosive (bahan peledak) dengan peningkatan
yang cukup tajam.
Kini kromatrografi menjadi hal yang sangat penting dalam menganalisis berbagai
bahan-bahan kimia yang terkandung dalam bahan peledak. Hal ini didorong karena dengan
semakin cepat diketahuinya bahan-bahan dasar apa saja bahan peledak, maka akan makin
mempercepat diambilnya tindakan oleh bagian keamanan untuk mengatasi daerah-daerah
yang terkena ledakan serta antisipasi meluasnya efek radiasi yang kemungkinan akan
mengena tubuh manusia di sekitar lokasi ledakan. Lebih jauh lagi, efek negatifnya terhadap
lingkungan juga bisa segera diketahui.
Pada dasarnya setiap bahan peledak, baru akan meledak jika terjadi benturan,
gesekan, getaran atau adanya perubahan suhu yang meningkat. Dengan terjadinya hal-hal
seperti ini, memberikan peluang bahan peledak tersebut berubah manjadi zat lain yang
lebih stabil yang diikuti dengan tekanan yang tinggi, yang bisa menghasilkan ledakan
dahsyat atau bahkan munculnya percikan api.
Ada banyak bahan kimia yang biasa digunakan dalam bahan peledak, baik bahan
peledak yang kerkekuatan tinggi maupun rendah, beberapa diantaranya adalah 2,4,6-
trinitrotoluene (TNT), siklonit (RDX), tetril, pentaeritritol tetranitrat (PETN) dan tetritol serta
beberapa anion lain seperti perklorat, klorat, klorida, nitrat, nitrit, sulfate dan tiosianat.Bisa
dikatakan bahwa analisis organic ion (ion organik) dan inorganic ion (ion anorganik)
memainkan peranan yang sangat penting pada saat investigasi lokasi ledakan bom
berlangsung. Pendeteksian ion-ion anorganik misalnya, setelah pengeboman berlangsung,
akan memberikan harapan karena tidak semua material dari bahan peledak tersebut ikut
meledak pada saat terjadi ledakan.
Bahan-bahan anorganik seperti klorat, klorida, nitrat, nitrit, sulfate, tiosianat, dan
perklorat adalah bahan-bahan kimia yang biasa digunakan sebagai oksidator untuk low
explosive (bahan peledak berkekuatan rendah).

d) Dalam bidang lingkungan


Dalam masalah lingkungan, sebagai konsekuensi majunya peradaban manusia, berarti
permasalahan pun semakin “maju”. Salah satu permasalahan serius yang dihadapi oleh
negara-negara berkembang dan utamanya negara maju adalah persoalan global warming
(pemanasan global). Menurut survei National Institute for Environmental Studies, Japan,
tahun 2006 lalu, bahwa masyarakat di Jepang memperkirakan tingkat pemanasan global
merupakan masalah lingkungan paling serius dan tingkatannya hampir 7 kali lipat dari satu
dekade yang lalu saat polling kali pertama dilakukan pada tahun 19972). Seiring dengan hal
itu, permasalahan lingkungan pun semakin meningkat. Disinilah, teknik kromatografi
mengambil peran paling penting dalam environmental analysis (analisis lingkungan) ini.
Pada dasarnya permasalahan lingkungan bisa dibagi ke dalam 3 bagian : water
hygiene, soil hygiene dan air hygiene. Sebagai contoh, kualitas air (misal : air ledeng, air
sungai, air danau, air permukaan) dapat diketahui salah satunya dengan mengetahui jenis
anion dan kation yang terkandung dalam sampel air tersebut sekaligus jumlahnya. Apakah
mengandung logam-logam berbahaya atau tidak.
Demikian halnya pada daerah yang terkena acid rain (hujan asam). Antisipasi dini
dapat dilakukan dengan mengetahui secara dini kandungan sulfate ion, SO42- (ion sulfat)
dan nitrogen trioxide ion, NO3- (nitrogen trioksida) yang terdapat dalam air hujan tersebut.
Terbentuknya hujan asam disebabkan gas sulfur oxide, SOx dengan uap air dan membentuk
asam sulfat (H2SO4), demikian pula nitrogen oxide NOx dapat membentuk asam nitrat
(HNO3) di udara. Reaksi-rekasi ini mengambil waktu berjam-jam atau bahkan berhari-hari di
udara hingga akhirnya jatuh ke bumi dalam bentuk hujan asam.
Di beberapa negara maju seperti Jepang, Amerika, Eropa, Kanada, dan beberapa negara
lainnya, monitoring udara dan air hujan menjadi sangat penting tidak hanya untuk
memperkirakan efek dari polusi itu tapi yang lebih penting lagi adalah memonitor progress
(perkembangan) control polusi dari global ecology (ekologi global).
Kontrol kondisi air hujan ini menjadi penting karena beberapa efek yang fatal yang
mungkin bisa terjadi, di antaranya jatuhnya hujan asam dapat meningkatkan keasaman
danau, sungai, bendungan yang pada akhirnya mungin dapat menyebabkan kematian pada
kehidupan air. Demikian pula keasaman pada tanah dapat meningkat dan merembes ke air
permukaan tanah yaitu sumber air minum sehari-hari. Aplikasi pada bidang yang lain
Sebenarnya masih sangat banyak aplikasi kromatografi dalam bidang-bidang keilmuan
lainnya. Beberapa aplikasi tersebut misalnya dalam industri kertas, pertambangan, proses
logam, petrokimia, pertanian, kedokteran dan lain-lain.
Namun karena keterbatasan ruang, dalam tulisan ini penulis hanya menampilkan
beberapa contoh peran serta kromatografi dalam memudahkan dan mempercepat
perolehan “target data” dalam beberapa bidang yang tersebut di atas.
BAB III
METODA
Pemisahan senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya
merupakan masalah penting dari pekerjaan di laboratorium kimia. Untuk itu, kemurnian
bahan atau komposisi campuran dengan kandungan yang berbeda dapat dianalisis dengan
benar. Control kualitas, analisis bahan makanan dan lingkungan, tetapi juga control dan
optimasi reaksi kimia dan proses berdasarkan penentuan analitik dari kuantitas material.
Teknologi yang penting untuk analisis dan pemisahan preparative pada campuran bahan
adalah kromatografi.

3.1 Alat dan Bahan


1. Cahmber 2 buah
2. Plat KLT
3. Slinder Kaca
4. Pipet volume 25 mL
5. Pipet Tetes
6. Penotol
7. Filler atau Sprayer
8. Mistar
9. Pensil

a. Metoda Kerja Kromatografi Lapis Tipis


1. Diambil sejumlah kecil dan ditambah senyawa pelarut
2. Diaduk dan disentrifugasi
3. Diambil filtratnya
4. Ditotol ke KLT yang telah diberi identitas sampel, tanda dengan nomor ataupun garis.
5. Chember diisi kloroform dan eluen
6. Di jenuhkan
7. Masukkan KLT yang telah ditotol
8. Tunggu sampai eluen naik sampai tanda batas
9. Dikeluarkan dari chember dan dikeringkan
10. Pengamatan bisa dilakukan dengan cara visual, kimia, fisika, ataupun radioaktif. Pada
pengamatan dengan cara fisika, maka digunakan sinar UV dengan panjang gelombang 254
dan 366.
11. Tandai noda yang terlihat pada KLT
12. Lakukan perhitungan RF
BAB IV
PENUTUP

4.1 Kesimpulan
Pemisahan senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya
merupakan masalah penting dari pekerjaan di laboratorium kimia. Untuk itu, kemurnian
bahan atau komposisi campuran dengan kandungan yang berbeda dapat dianalisis dengan
benar. Control kualitas, analisis bahan makanan dan lingkungan, tetapi juga control dan
optimasi reaksi kimia dan proses berdasarkan penentuan analitik dari kuantitas material.
Teknologi yang penting untuk analisis dan pemisahan preparative pada campuran bahan
adalah kromatografi.
kromatografi adalah teknik analisis yang diterapkan untuk memisahkan komponen-
komponen dalam campuran berdasarkan 2 jenis fase yaitu fase diam (stationer) dan fase
gerak (mobil).
Secara umum kromatografi dibagi menjadi :
a. Kromatografi Cair
 Kromatografi kertas
 Kromatografi kolom
 Kromatografi lapis tipis
 Kromatografi cair kinerja tinggi
b. Kromatografi Gas
 Kromatografi gas-cair
 Kromatografi gas-padat

4.2 Saran
Dalam menggunakan kromatografi, kita harus mengetahui jenis-jenis kromatografi
yang akan digunakan. Karena setiap kromatografi mempunyai cara kerja yang berbeda-
beda. Seperti kromarografi kertas dan lapis tipis. Kedua kromatografi ini mengolah sampel
dengan cara menotolkan sampel dikertas atau silika gel, dalam penotolan sampel, kita harus
mengetahui cara menotolkan sampel itu, hal ini untuk mendapatkan hasil yang benar pada
pemeriksaan sampel.
Pengerjaannya juga harus membutuhkan ketelitian dan kehati-hatian untuk
mendapatkan hasil yang akurat. Setelah pemeriksaan sampel selesai, pastikan semua alat
dimatikan dengan baik, untuk menjaga agar alat dapat bertahan lama
Apa itu Kromatografi?
Kalau bicara tentang kromatografi pasti ada beberapa definisi dengan kata-kata yang beda.
Salah satunya menyebutkan bahwa,

“Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan yang mana analit-analit dalam sampel
terdistribusi antara 2 fase, yaitu fase diam dan fase gerak.”

Dari pengertian di atas dapat diketahui kalo ada dua komponen penting dalam kromatografi
yaitu fase diam dan fase gerak. Dan perlu dicatat bahwa hasil pemisahan kromatografi yang
baik bukan lagi berbentuk senyawa melainkan berbentuk tunggal.

Fase diam (Stationary phase)

Fase diam merupakan salah satu komponen yang penting dalam proses pemisahan dengan
kromatografi. kenapa? karena dengan adanya interaksi dengan fase diamlah terjadi perbedaan
waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen senyawa analit.

Fase diam dapat berupa bahan padat atau porous (berpori) berbentuk molekul kecil atau
cairan yang umumnya dilapiskan pada padatan pendukung.

Fase gerak (Mobile phase)

Fase gerak merupakan pembawa analit dapat bersifat inert maupun berinteraksi dengan analit
tersebut. Nah fase gerak ini g melulu hanya cairan. Tapi juga dapat berupa gas inert yang
umumnya dapat dipakai sebagai carrier gas senyawa mudah menguap (volatil)

Pemisahan dengan kromatografi

Pemisahan dengan kromatografi sendiri lebih baik daripada ekstraksi. kenapa? Karena sering
diibaratkan dengan corong pisah yang saling berhubungan yang bergerak dari atas ke bawah
dimana pada setiap corong pisah terjadi pemisahan. Selain itu permukaan antar fase pada
kromatografi lebih besar.

Lalu apa yang menyebabkan senyawa tersebut dapat dipisahkan?

Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya kalo pemisahan senyawa-senyawa dapat diamati
dengan perbedaan waktu retensi (tR) pada kromatogram.

“Waktu retensi (tR) adalah waktu yang diperlukan oleh analit dari awal kolom sampai ke
detektor”

Semakin lama analit berinteraksi dengan fase diam –> semakin lama ia keluar –> tR semakin
besar
Sehingga ada suatu konstanta yang menyatakan kecepatan migrasi solut melalui fase diam.
Kecepatan migrasi solut dipengarui oleh perbandingan distribusinya (Kd atau kadang disebut
D) yang ditentukan oleh afinitas relatif solut pada fase diam dibanding fase gerak:

Kd = Kadar senyawa dalam fase diam/Kadar senyawa dalam fase gerak

Dari persamaan tersebut dapat ditarik kesimpulan kalo semakin besar harga Kd suatu
senyawa maka waktu retensinya (tR) akan semakin besar karena interaksi dengan fase diam
besar dan migrasinya semakin lambat.

Parameter kinetika pemisahan


Faktor Selektifitas (α)

“Selektifitas merupakan kemampuan instrumen dalam mengenali senyawa-senyawa dalam


campuran”

untuk mendapat selektifitas yang maksimum maka harus dicari interaksi yang sesuai (apakah
partisi, adsorpsi, size exclusion, atau ion exchange). Faktor selektifitas (α) dapat dicari
dengan:

α = k2/k1 = (tR2-tm)/(tR1-tm)

Apabila kedua senyawa memiliki nilai K yang sama / α = 1 maka kedua senyawa tidak dapat
dipisahkan. karena waktu retensinya identik.

Faktor Spesifisitas (Kd)

Sifat spesifisitas dari kromatografi didasarkan pada sifat dari senyawa yang spesifik.
Senyawa memiliki sifat spesifik karena memiliki Kd yang spesifik.

Kapasitas Kolom (K’)

Menunjukkan kemampuan kolom menampung analit. Semakin lama analit berada dalam
kolom, akan semakinb esar nilai kapasitasnya. Nilai K’ yang bagus antara 1-10. Jika k’
terlalu kecil, kemungkinan pemisahannya belum sempurna dan jika terlalu besar maka akan
terjadi pelebaran puncak.

Resolusi (Rs)

Untuk taraf kepercayaan 95%, harga Rs yang baik adalah > 1,5. Jika kurang dari ini maka
puncak dari masing2 analit akan saling tumpang tindih

Jumlah Lempeng Teoritis (Neff)

Merupakan parameter yang menghitung efisiensi kromatografi. Menyatakan jumlah peristiwa


partisi yang dialami oleh analit pada setiap saat yang dibawa oleh fase gerak selama elusi.
Interaksi Analit dan Fase diam
Setelah tahu tentang konsep pemisahan nyambung kesini. Sebenarnya secara sederhana
mekanisme pemisahan analit dibedakan menjadi 4, hal ini yang mengakibatkan perbedaan
waktu retensi karena perbedaan interaksi analit dengan fase diamnya.

1. Adsorbsi

Fase diam: Padatan

Fase gerak: Cair (bisa juga gas pada Kromatografi padat-gas)

Dasar pemisahan: Stereokimia

2. Partisi

Fase diam: Cair

Fase gerak: Cair atau gas (pada kromatografi cair-gas)

Dasar pemisahan: Partisi-konsep like dissolves like

Untuk kromatografi jenis ini dasarnya adalah senyawa yang memiliki kemiripan sifat fisika
kimia dengan fase diam akan tertambat lebih lama pada fase diam –> tR lebih besar

Sebagai contoh jika kita ingin memisahkan kafein dan parasetamol pada sampel obat flu
dengan fase diam ODS (Oktadesil silika) yang nonpolar. maka parasetamol akan lebih dulu
keluar dari kolom atau tR lebih kecil dari pada kafein. karena Kafein sifatnya nonpolar dan
lebih terlarut pada fase diam. sedangkan parasetamol bisa terlarut sedikit.

3. Penukar ion (bahasa kerennya: ion exchange)

mekanisme pemisahan karena interaksi ionik antara fase diam dan solut. biasanya dipake di
pabrik farmasi untuk bikin air bebas ion (sori lupa namanya haha). berdasarkan muatan yang
dilapiskan pada fase diam, dapat dibagi 2:

a. Penukar anion: Fase diamnya muatan positif sehingga yang bermuatan negatif akan ketarik
fase diam

b. Penukar kation: Fase diamnya bermuatan negatif sehingga yang bermuatan positif akan
ketarik fase diam

4. Ekslusi ukuran (bahasa kerennya: Size Exclusion Chromatography)

Prinsip kerjanya pemisahan analit berdasarkan ukuran. Biasanya pake fase diam dengan pori
berukuran tertentu.
Jadi ntar saat elusi, molekul yang kecil akan masuk ke pori fase diam. semakin kecil maka
dapat masuk semakin dalam. sedangkan molekul yg besar dia g bisa masuk ke pori sehingga
langsung terelusi.

Kesimpulannya: Partikel dengan ukuran besar (BM besar) memiliki tR lebih kecil daripada
partikel dengan ukuran kecil (BM kecil)

Pelebaran puncak kromatogram

Selesai dipisahkan di kolom, dibawa ke detektor dan dicetak oleh rekorder maka kita dapat
yang namanya kromatogram. Secara resmi yg ada di buku B) kromatogram merupakan
profil konsentrasi yang simetri dalam arah aliran fase gerak (?)

gampangnya sih yang sumbu x itu waktu, sumbu y signal yg diterima detektor

Kromatogram yang ideal alias yg bagus yaitu yang tinggi, ramping dan tidak saling tindih
antar satu puncak dengan lain. Namun kadang (bahkan sering sih) terjadi pelebaran puncak
kromatogram. Apa aja penyebabnya:

1. Eddy diffusion

Kolom kan dikemas pake partikel fase diam yang kecil. Trus fase gerak lewat sambil bawa
analit. Nah ada beberapa analit yang bisa lewat dengan mudah trus sampe detektor daripada
beberapa partikel yang mengalami pengalihan (diversi) karena jalannya belok2. Buat lebih
jelasnya liat di gambar:
Di gambar di atas kan bisa dilihat bahwa partikel B “beruntung” jalan yg dilewati tiada
hambatan. ia tinggal lurus tanpa susah-susah. Beda dengan A dan C. Mereka berdua harus
susah payah nglewatin halangan rintangan partikel fase diam. Partikel C halangannya lebih
sedikit dari partikel B sehingga nyampe ke detektor setelah A. Sedangkan A harus belok jauh
nyari jalan baru bisa nyampe.

Untuk meminimalkannya dengan pake kolom dengan partikel yang homogen densitasnya.

2. Longitudinal diffusion

Biasanya terjadi jika kecepatan alir fase gerak lambat. Pada keadaan tersebut, aliran fase
gerak dengan analit di yang dekat dengan fase diam akan lambat karena adanya Vander walls
force sedangkan yang berada di tengah lebih cepat alirannya namun konsentrasinya lebih
kecil daripada yang samping. Karenanya analit yang semula tertahan oleh gaya Vanderwalls
di samping akan berdifusi ke tengah sesuai dengan hukum Ficks.

Cara meminimalkannya: mempercepat laju alir dan menurunkan temperatur.

3. Mass transfer equilibrum

Kalo yang ini biasanya terjadi kalo laju alir terlalu cepat dan pemisahan pada kolom belum
tercapai sempurna.

Cara meminimalkannya:

a. pake partikel kecil, karena luas permukaan besar sehingga kesetimbangan cepat tercapai

b. Menaikkan temperatur

c. Laju alir diperlambat

Jika faktor-faktor tersebut dibuat suatu kurva dengan H(tinggi lempeng teoritis) sebagai
sumbu y dan V (kecepatan alir) sebagai sumbu x, maka akan didapat kecepatan alir optimum.
Kurva ini disebut dengan kurva Van deemter.

Kurva van deemter ini didapat dari persamaan van deemter:


H = A+B/u+Cu
dimana A merupakan konstanta difusi eddy, B merupakan konstanta difusi longitudinal, C
merupakan konstanta transfer massa, dan u merupakan laju alir fase gerak.

Dari persamaan tersebut dapat dilihat bahwa efisiensi pemisahan pada kromatografi
bergantung pada ketiga faktor diatas, dan pelebaran puncak yang disebabkan oleh difusi
longitudinal dan transfer massa bergantung pada laju alir fase gerak (seperti yang sudah
dijelaskan sebelumnya). Karenanya dari kurva van deemter dapat diperoleh laju alir fase
gerak yang optimum.

Dari kedua gambar di atas kurva paling atas (yg ada tulisan HETP) merupakan resultan dari
ketiga gaya tsb. Semakin tinggi resultan –> HETP semakin tinggi berarti efisiensi kolom
lebih jelek.

Sedangkan makin rendah resultan –> HETP makin rendah efisiensi kolom lebih baik.

Kenapa?

Karena ada rumus lagi yaitu:


Jumlah lempeng teoritis = Panjang kolom / HETP (lebar lempeng teoritis)

atau

N = L / HETP

Efisiensi kolom meningkat jika N / jumlah lempeng teoritis meningkat. Kenapa? Karena
semakin banyak lempeng teoritis maka pemisahan semakin baik (diumpamakan semakin
banyak pula corong pisahnya ekstraksinya lebih baik). Semakin panjang L (panjang kolom)
maka semakin banyak jumlah lempeng teoritis dan efisiensi semakin bagus.
Namun bila HETP lebih besar efisiensi kolom jelek. kenapa? Karena berarti lebar untuk 1
kolom teoritis lebih besar sehingga dalam kolom yg panjangnya sama, jumlah lempeng
teoritisnya lebih sedikit. Misalnya ada dua kolom, dimana panjang kolom (L) nya sama2 100
cm. Kolom 1 HETPnya 5 cm sedangkan kolom 2 HETPnya 10 cm. Berarti dalam kolom 1
ada 20 lempeng teoritis kan (dari 100/5) ? lebih besar daripada di kolom 2 yg lempeng
teoritisnya cuma 10 (100/10)

Ditulis dalam Kromatografi

19 Komentar

Tag: Kromatografi

Anda mungkin juga menyukai